JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML culture cellulaire et la séparation des cellules Lin-CD34 + et CD34-Lin en utilisant la cellule magnétique Système et tri cellulaire activé par fluorescence méthode de tri <ol><li> Préparation de rein de bébé hamster (BHK), du milieu de culture de cellules pour la collecte de facteur de cellules souches: <ol><li> Culture des cellules BHK dans un milieu DMEM contenant 10% de FBS en flacon de 25 cm2 (voir le tableau 1) à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Lorsque les cellules se développent à 80 - 90% de confluence, laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Ajouter 5 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25% de la monocouche et on incube les cellules pendant 1-5 min à température ambiante (TA) jusqu&#39;à ce que les cellules sont décollées. </li><li> Pipet la solution et doucement à briser des amas de cellules. Ajouter 5 ml de DMEM complet dans le ballon pour arrêter l&#39;activité de la trypsine. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Enlever le milieu et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu BHK fraîches de culture cellulaire. </li&gt; <li> Transférer 2 ml de la suspension cellulaire de l&#39;étape 1.1.4 dans un nouveau flacon de 75 cm 2 et ajouter 48 ml de milieu de culture de cellules BHK fraîches dans le ballon. </li><li> Culture des cellules BHK pour deux jours et recueillir le milieu de culture. Passage du milieu à travers un filtre de 0,45 um. Conserver dans le milieu à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> EML culture cellulaire: <ol><li> Culture des cellules en suspension (EML) en milieu basique EML BHK contenant le milieu de culture des cellules (tableau 1) à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Maintenir les cellules EML à faible densité cellulaire (0,5 à 5 x 10 5 cellules / ml) avec la densité de crête inférieure à 5 x 10 6 cellules / ml. Diviser les cellules tous les 2 à 3 jours, à raison de 1: 5. Passage cellules EML doucement et jetez la culture après repiquage depuis 10 générations. </li></ol></li><li> L&#39;épuisement des cellules positives de la lignée: <ol><li> Récolter les cellules EML par centrifugation à 200 xg for 5 min et laver les cellules une fois avec du PBS. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min. </li><li> Reprendre les cellules avec du PBS et compter les cellules avec un hémocytomètre. Déterminer la concentration d&#39;anticorps dans l&#39;étape de séparation ultérieure des cellules en fonction du nombre de cellules (se il vous plaît consulter les instructions proposées par le fournisseur du système d&#39;isolement des cellules). </li><li> Isoler la lignée négative (Lin-) cellules en utilisant un cocktail d&#39;anticorps de la lignée (cocktail d&#39;anticorps monoclonaux conjugué à la biotine CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 et Ter-119 ) et un système magnétique de tri cellulaire activé selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Séparation des cellules Lin-CD34 + et CD34-Lin: <ol><li> Isoler les cellules Lin- de l&#39;étape 1.3.3 à 200 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot de cellules avec du PBS et compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Laver les cellules deux fois avec un tampon FACS et sédimenter les cellules à 200 xgpendant 5 min. </li><li> Étiqueter cinq 1,5 ml microtubes avec le numéro 1, 2, 3, 4, 5 respectivement. Reprendre les cellules avec 100 pi de tampon FACS pour 10 6 cellules (10 6 cellules par tube). </li><li> Ajouter 1 pg d&#39;anticorps anti-souris CD34 FITC dans le tube 1 et tube 2 et mélanger doucement les tubes. </li><li> Incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 1 heure dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 0,25 pg d&#39;anticorps anti-Sca1 PE-conjugué et 20 pl d&#39;APC conjugué anticorps lignée de cocktail de tube 1, 0,25 pg d&#39;anticorps anti-Sca1 conjugué à PE de tube 3, et 20 ul d&#39;anticorps lignée cocktail de APC conjugué à tube 4. </li><li> Mélanger tous les tubes doucement et incuber les cellules à 4 ° C pendant encore 30 minutes dans le noir. </li><li> Ajouter 300 ul de tampon FACS pour les cellules et centrifuger les cellules à 200 g pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules avec 500 pl de tampon FACS à trois reprises. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de FACS buffre. </li><li> Utilisez les cellules dans des tubes 2, 3, 4, et 5 pour la mise en place de compensation. Isoler les cellules Lin-SCA + CD34 + et Lin-SCA-CD34 dans le tube 1 en utilisant FACS Aria. </li></ol></li></ol> 2. Préparation d&#39;ARN et construction de la bibliothèque de séquençage à haut débit <ol><li> L&#39;isolement, la qualité de l&#39;analyse et la quantification de l&#39;ARN: <ol><li> Extrait de l&#39;ARN total de Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34 en utilisant respectivement TRIzol suivant le protocole fabrique ». </li><li> Retirer l&#39;ADN en utilisant la désoxyribonucléase I contaminée (DNase I) selon le protocole du fabricant. Eventuellement, stocker l&#39;ARN à -80 ° C à cette étape pour une utilisation ultérieure. </li><li> Évaluer la qualité des ARN total en utilisant Bioanalyzer selon les instructions offerts par le fournisseur. Utilisez échantillon d&#39;ARN avec l&#39;ARN Nombre intégrité (RIN) de bière à 9. </li></ol></li><li> Construction d&#39;une bibliothèque et séquençage à haut débit: NOTE: Ce protocole décrit ARN-Seq en utilisant la plate-forme Illumina. Pourd&#39;autres plates-formes de séquençage, différentes méthodes de préparation de bibliothèques sont nécessaires. <ol><li> Utilisez 0,1-4 ug d&#39;ARN total de haute qualité par exemple pour la préparation bibliothèque. Normalement 2 ug d&#39;ARN total peut être extrait à partir de 10 5 cellules EML. </li><li> Utiliser un système de préparation d&#39;échantillons ARN-séquençage pour la purification d&#39;ARN et de la fragmentation, premier et deuxième synthèse brin d&#39;ADNc, réparation de fin, les extrémités 3 &#39;adénylation, adaptateur ligature et l&#39;amplification par PCR, en suivant les procédures standard détaillées par rapport aux instructions du fournisseur. <ol><li> Sélectionner positivement PolyA ARNm en utilisant oligo-dT billes magnétiques et fragmenter l&#39;ARNm. </li><li> Effectuer transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires pour obtenir l&#39;ADNc et ensuite synthétiser le deuxième brin d&#39;ADNc pour générer de l&#39;ADNc double brin. </li><li> Retirez les surplombs »et remplir la 5 &#39;3 surplombs par l&#39;ADN polymérase. L&#39;adénylate extrémités 3 &#39;pour empêcher la ligature des fragments d&#39;ADNc à partir d&#39;une autre.</li><li> Ajouter adaptateurs d&#39;indexation multiplex aux deux extrémités de l&#39;ADNc-bc. Effectuer la PCR pour l&#39;enrichissement de fragments d&#39;ADN. </li></ol></li><li> Mesurer la A260 / A280 pour obtenir des informations sur la concentration de bibliothèque à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li><li> Évaluer la qualité de la bibliothèque et de mesurer la gamme de taille des fragments d&#39;ADN en utilisant un Bioanalyzer. </li></ol></li></ol> 3. Analyse des données Pour référence des logiciels utilisés dans cette partie, se il vous plaît voir (tableau 2). <ol><li> le traitement des fichiers de données pour l&#39;analyse en aval: <ol><li> Convertir .bcl (fichier d&#39;appel de base) à déposer .fastq fichier en utilisant un logiciel de CASAVA (Illumina, la version 1.8.2). <ol><li> Lancez le &#39;Terminal&#39; dans le système Linux. Allez dans le dossier de données qui contient le fichier de données à partir d&#39;une machine de séquençage Illumina HiSeq2000. Supposons que le dossier de résultat est «NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX / &#39;, le typedans la commande de la figure S1A, et entrer dans le dossier de données. </li><li> Installez CASAVA 1.8.2 dans le système Linux. Supposons que le outputfolder est «non aligné», utilisez la commande à la figure S1B pour préparer le fichier de configuration pour la conversion. Utilisez l&#39;option --fastq-cluster-comptage 0 à assurer un seul fichier .fastq est créé pour chaque échantillon. Le fichier généré est .fastq au format .gz. Décompressez-le pour l&#39;analyse en aval (Figure S1B). </li><li> Une fois le dossier &#39;Unaligned&#39; a été généré, allez dans le dossier &quot;Unaligned &#39;(Figure S1C). </li><li> Utilisez la commande de la figure S1D pour commencer le processus de conversion. Le paramètre &#39;-j&#39; fournit le numéro d&#39;unité centrale de traitement qui sera utilisé. </li><li> Après que le système a terminé le processus de conversion, allez dans le dossier de résultat sous dossier «non aligné» (Figure S1E). </li><li> Utilisez la commande de la figure S1F &lt;/ Strong&gt; pour décompresser le fichier .fastq.gz dans .fastq fichier sous chaque dossier de l&#39;échantillon. </li></ol></li></ol></li><li> Détecter de nouveaux relevés de notes et d&#39;évaluer le niveau d&#39;expression en utilisant Tuxedo Suite 26: <ol><li> Plan de la fin de l&#39;ARN-Seq couplé lit au génome de référence de la souris (UCSC version mm9, obtenu à partir de <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> ) en utilisant un logiciel de Tophat (version 1.3.3) 27, qui utilise la Bowtie lire mappeur (version 0.12.7) 28. Tophat est fourni avec l&#39;option &quot;-no-nouveaux-juncs&quot; pour améliorer la précision de l&#39;estimation du niveau de l&#39;expression. <ol><li> Mettez les fichiers .fastq dans un dossier où le processus de cartographie sera mise en œuvre. Supposons qu&#39;il y ait 2 fichiers (renommer .fastq à Example1.read1, Example1.read2) pour un échantillon de séquençage paired fin, utilisez la commande à la figure S2 pour faire la cartographie (ajuster les paramètres en fonction de la configuration du système).Le paramètre &quot;-p&quot; fournit le nombre de CPU qui sera utilisé. Les paramètres &quot;-r&quot; et &quot;-mate-STD-dev&quot; peuvent être obtenus à partir de la bibliothèque QC ou déduites à partir d&#39;un sous-ensemble de lit alignés (Figure S2). </li></ol></li><li> Assemblez la cartographie lit en transcrits d&#39;ARN en utilisant le logiciel de manchette (version 1.3.0) 29. Boutons de manchette analyse avec le fichier d&#39;annotation de gènes connus (même fichier .gtf utilisé par Tophat) et le fichier .bam produite par Tophat. <ol><li> Après Tophat terminé la course, dans le même dossier, utilisez la commande à la figure S3A afin de fonctionner boutons de manchette pour construire transcriptome et transcription estimer le niveau d&#39;expression. Le &#39;mm9_repeatMasker.gtf&#39; et les fichiers de séquence du génome dans le dossier &#39;GenomeSeqMM9&#39; peuvent être obtenus à partir du navigateur UCSC Genome. </li><li> Les fichiers genes.expr et transcripts.expr obtenus contiennent la valeur de l&#39;expression des gènes et des transcriptions (isoformes). Copier et collerle contenu du fichier dans un fichier Excel et de manipuler avec tableur (Figure S3B). </li><li> Utilisez la commande de la figure S3C à comparer la «transcripts.gtf &#39;fichier à la référence« mm9_genes.gtf&#39; fichier résultant afin d&#39;identifier de nouveaux relevés de notes. </li><li> Le fichier résultant contient .tmap le résultat de la comparaison. Copiez et collez le contenu du fichier dans un fichier Excel et manipuler avec tableur. Transcriptions avec le code de la classe «u» peuvent être considérés comme «roman» par rapport à la référence .gtf fichier fourni (Figure S3D). REMARQUE: Pour l&#39;analyse en aval commodité, définissez les valeurs de FPKM à 0,1 si les valeurs sont en dessous de 0,1. REMARQUE: L&#39;étape 3.2.3 - 3.2.6 est facultative pour ceux qui souhaitent améliorer la précision de l&#39;estimation expression de nouveaux relevés de notes. Cela va prendre beaucoup plus de temps, parce que la cartographie et la construction du transcriptome doivent être rnon plus d&#39;une fois. </li></ol></li><li> Exécutez Tophat en utilisant les paramètres par défaut et puis exécutez à boutons de manchette fichier .gtf généré à l&#39;aide de la commande à la figure S3E. </li><li> Comparez le fichier de .gtf résultant dans le fichier .gtf du génome de référence en utilisant la commande à la figure S3F. </li><li> Analyser le fichier .tmap entraîné comme décrit à l&#39;étape 3.2.2.4. Copiez et collez le contenu du fichier dans un fichier Excel et manipuler avec tableur. Transcriptions avec le code de la classe «u» peuvent être considérés comme «roman» par rapport à la référence .gtf fichier fourni. </li><li> Après l&#39;étape 3.2.5, il existe un fichier de .combined.gtf dans le dossier qui peut être utilisé en tant que fichier de .gtf de référence. Une deuxième série de boutons de manchette Tophat et peut être réalisée comme décrit dans l&#39;étape 3.2.1 et 3.2.2 pour obtenir une estimation plus précise de FPKM de nouveaux relevés de notes. </li></ol></li><li> Détecter differentially exprime des gènes en utilisant DESeq paquet de 30. <ol><li> L&#39;entrée de DESeq est une brute tableau des chiffres de lecture. Pour obtenir un tel tableau, utilisez le script htseq comptage distribué avec le paquet HTSeq Python qui peut être téléchargé à partir du site HTSeq ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> Assurez-vous que samtools, python, et htseq comptage programsare installés dans le système. Obtenir des chiffres bruts de comptage de lecture de sortie de tophat en utilisant la commande à la figure S4A. </li><li> Préparer, des fichiers &quot;ExperimentDesign.txt &#39;aide d&#39;Excel&#39; Raw_Count_Table.txt. Copiez et enregistrez le contenu au format .txt pour le paquet DESeq R (Figure S4B). </li><li> Installez programme de R dans le système. Dans le terminal, de type «R» et appuyez sur ENTER.A message sur écran appearas montré à la figure S4C. </li><li> Lire «Raw_Count_Table.txt »,« ExperimentDesign.txt &#39;dans R en utilisant la commande à la figure S4D. </li><li> Chargez paquet DESeq aide de la commande à la figure S4E. </li><li> Conditions factoriser dans R (Figure S4F). </li><li> Utilisez la commande de la figure S4G de réaliser des essais binominal négatif sur la table de comptage normalisée. </li><li> Utilisez la commande de la figure S4H de gènes exprimés sortie différentiels importants dans un fichier .csv. </li></ol></li></ol></li><li> Recherche des facteurs de transcription »(TFS) valeurs de FPKM à travers les échantillons en utilisant Excel. Intersection DE Table de gène et la table TF. Les gènes appartiennent à la fois à la table sont exprimés de manière différentielle des facteurs de transcription. <ol><li> Allez sur le site <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> et télécharger les facteurs de transcription. Cherchez ensuite les facteurs de transcription de Dans le Excel (&lt;<html> strong&gt; Figure S5). </li></ol></li><li> Génération fichier .bigwig pour UCSC navigateur génome visualisation. <ol><li> Télécharger le logiciel &#39;bedtools de partir du site Web <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> et installer le logiciel dans le système 31. Télécharger de bedGraphToBigWig «les outils UCSC du site <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> et installer le logiciel dans le système. </li><li> Dans le dossier contenant le fichier de .bam, utilisez la commande à la figure S6A pour convertir le fichier généré par .bam tophat dans le fichier .bed. </li><li> Une fois le fichier .bed est produit, utilisez la commande à la figure S6B pour générer un fichier .bigwig. Le fichier &#39;ChromInfo.txt »peut être obtenu à partir de l&#39;URL suivante:Arget = &quot;_blank&quot;&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> Observer un circuit personnalisé sur navigateur UCSC Genome. Consultez le site Web <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> sur la façon d&#39;afficher une piste personnalisée à l&#39;aide UCSC navigateur génome. </li></ol></li></ol><img alt="Figure S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" /> Figure S1: Conversion de fichier .bcl à .fastq fichier en utilisant un logiciel de CASAVA. <img alt="Figure S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" /> Figure S2: Cartographie lit pour référencer génome en utilisant Tophat. <img alt="Figure S3" fo:contente-width = &quot;5 pouces&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52104 / 52104supplementalfig3.jpg&quot; /&gt; Figure S3: détection de nouveaux relevés de notes et estimation du niveau d&#39;expression. <img alt="Figure S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" /> Figure S4: Appel différentiel gène exprimé à l&#39;aide DESeq paquet. <img alt="Figure S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" /> Figure S5: Identification des facteurs de transcription exprimés de manière différentielle. <img alt="Figure S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" /> Figure S6: Conversion résultat de la cartographie pour la visualisation des données.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection.">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16 (2010).</li><li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq.">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106 (2009).</li><li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing.">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307 (2013).</li><li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+studies+using+microarrays:+principles,+problems,+and+prospects.">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute/subacute+phases:+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level.">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567 (2013).</li><li>Marioni, J. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction,+RT-PCR,+and+direct+sequencing.">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li><li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human,+mouse,+and+rat.">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li><li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Transcriptome des mammifères est très complexe 34-38. technologie de l&#39;ARN-Seq joue un rôle de plus en plus important dans les études d&#39;analyse du transcriptome, roman détection des transcriptions et seul nucléotide découverte de variation etc. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes d&#39;analyse de l&#39;expression des gènes. Comme mentionné dans l&#39;introduction, il surmonte les artefacts d&#39;hybridation de micro-réseau et peut être utilis?...

Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules sanguines rares qui se trouvent principalement dans la niche de la moelle osseuse adulte. Ils sont responsables de la production de cellules nécessaires pour reconstituer le sang et le système immunitaire 1. Comme une sorte de cellules souches, cellules souches hématopoïétiques sont capables à la fois de l&#39;auto-renouvellement et de différenciation. Mécanismes qui contrôlent la décision de sort de CSH élucider, soit vers l&#39;auto-renouvellement ou de la différenciation, offrira de précieux conseils sur la manipulation de cellules souches hématopoïétiques pour les recherches de maladies du sang et de l&#39;utilisation clinique 2. Un problème rencontré par les chercheurs est que les CSH peuvent être maintenues et développées in vitro dans une mesure très limitée; la grande majorité de leur progéniture sont partiellement différenciées en culture 2. Afin d&#39;identifier les principaux régulateurs qui contrôlent les processus d&#39;auto-renouvellement et de différenciation à l&#39;échelle de l&#39;ensemble du génome, nous avons utilisé une primitive hématopoïétique ligne de cellules souches de souris EML en tant que système modèle. Thest la lignée cellulaire a été dérivée à partir de 3,4 murin de la moelle osseuse. Lorsque nourris avec différents facteurs de croissance, les cellules peuvent se différencier en EML érythroïdes, myéloïdes, lymphoïdes et des cellules in vitro 5. Surtout, cette lignée cellulaire peut être propagé en grande quantité dans le milieu de culture contenant un facteur de cellules souches (SCF) et en conservant leur multipotentialité. EML cellules peuvent être séparés en sous-groupes d&#39;auto-renouvellement Lin-SCA + CD34 + et les cellules différenciées partiellement Lin-SCA-CD34 sur la base de marqueurs de surface CD34 et SCA 6. Similaire à court terme CSH, SCA + CD34 + cellules sont capables d&#39;auto-renouvellement. Lorsqu&#39;ils sont traités avec SCF, Lin-SCA + des cellules CD34 + peut régénérer rapidement une population mixte de Lin-SCA + et les cellules CD34 + Lin-SCA-CD34 et continuent à proliférer 6. Les deux populations sont similaires dans la morphologie et des niveaux similaires de c-kit ARNm et la protéine 6. Des cellules Lin-SCA-CD34 sont capables de se propager dans un milieu contenant IL-3 à la place de SCF 3. Unveiling régulateurs clés dans la décision du destin cellulaire EML à offrir une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires à transition précoce de développement au cours de l&#39;hématopoïèse. Afin d&#39;étudier les différences moléculaires sous-jacents entre le Lin-SCA auto-renouvellement + CD34 + et les cellules Lin-SCA-CD34 partiellement différenciées, nous avons utilisé l&#39;ARN-Seq pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle. En particulier, nous nous concentrons sur les facteurs de transcription, des facteurs de transcription jouent un rôle crucial dans la détermination du destin cellulaire. ARN-Seq est une approche développée récemment qui utilise les capacités de séquençage de nouvelle génération (NGS) technologies de profil et de quantifier les ARN transcrits à partir de 7,8 génome. En bref, l&#39;ARN total est le poly-A et fragmenté choisi comme modèle initial template.The ARN est ensuite converti en ADNc en utilisant la transcriptase inverse. Afin de cartographier des transcrits d&#39;ARN de pleine longueur, en utilisant intact, l&#39;ARN non dégradé pour la construction de la banque d&#39;ADNc est importante. Pour le purpose de séquençage, des séquences d&#39;adaptation spécifiques sont ajoutées aux deux extrémités de l&#39;ADNc. Ensuite, dans la plupart des cas, les molécules d&#39;ADNc sont amplifiés par PCR et séquences d&#39;une manière à haut débit. Après séquençage, résultant lectures peut être aligné sur un génome de référence et une base de données de transcriptome. Le numéro de la carte qui lit le gène de référence est prise en compte et cette information peut être utilisée pour estimer le niveau d&#39;expression du gène. Le lit peut également être assemblé de novo sans un génome de référence, ce qui permet l&#39;étude de transcriptome dans les organismes non-modèles 9. la technologie de l&#39;ARN-seq a également été utilisé pour détecter les isoformes d&#39;épissage 10 à 12, de nouveaux transcrits 13 et 14 des fusions de gènes. En plus de la détection de gènes codant pour des protéines, de l&#39;ARN-Seq peut également être utilisé pour détecter et analyser nouveau niveau d&#39;ARN non codants, tels que la transcription de l&#39;ARN de long 15,16, 17 micro-ARN, etc. siRNA 18 non codante. En raison de til précision de cette méthode, il a été utilisé pour la détection de variations nucléotidiques simples 19,20. Avant l&#39;avènement de la technologie de l&#39;ARN-Seq, puces à ADN est la principale méthode utilisée pour analyser le profil d&#39;expression génique. Sondes pré-synthétisées sont conçus et ensuite fixés à une surface solide pour former une lame de microréseau 21. L&#39;ARNm est extrait et converti en ADNc. Au cours du processus de transcription inverse, les nucleotides marqués par fluorescence sont incorporés dans l&#39;ADNc et l&#39;ADNc peuvent être hybridés sur les lames de puces à ADN. L&#39;intensité du signal recueilli à partir d&#39;un endroit précis dépend de la quantité d&#39;ADNc de liaison à la sonde spécifique à cet endroit 21. Par rapport à la technologie de l&#39;ARN-Seq, puces à ADN a plusieurs limites. Tout d&#39;abord, puces à ADN repose sur la connaissance préalable de l&#39;annotation des gènes, tandis que la technologie de l&#39;ARN-Seq est capable de détecter de nouveaux relevés de notes au niveau de fond élevé relative, ce qui limite son utilisation lorsque geniveau d&#39;expression ne est faible. En outre, la technologie de l&#39;ARN-Seq a beaucoup plus dynamique portée de détection (8000 fois) 7, tandis que, en raison de fond et la saturation des signaux, l&#39;exactitude des puces à ADN est limitée pour les deux gènes fortement exprimés et humble 7,22. Enfin, des sondes de puces à ADN diffèrent dans leur efficacité d&#39;hybridation, ce qui rend les résultats moins fiables lors de la comparaison des niveaux d&#39;expression relatifs des différents produits de transcription au sein d&#39;un échantillon 23. Bien que l&#39;ARN-Seq a de nombreux avantages par rapport aux puces à ADN, l&#39;analyse des données est complexe. Ceci est une des raisons pour lesquelles de nombreux chercheurs utilisent encore microarray la place de l&#39;ARN-Seq. Divers outils de bioinformatique sont nécessaires pour le traitement et l&#39;analyse des données 24 ARN-Seq. Parmi plusieurs séquençage de nouvelle génération (NGS), les plates-formes 454, Illumina, Torrent SOLIDE et Ion sont les plus largement utilisés. 454 a été la première plate-forme commerciale NGS. A la différence des autres plates-formes de séquençagelongueur comme Illumina et solide, la plate-forme 454 génère plus lus (moyenne 700 BASE lit) 25. Plus de lectures est mieux pour la caractérisation initiale de transcriptiome en raison de leur plus assembler efficacité 25. Le principal inconvénient de la plate-forme 454 est son coût élevé par mégabase de séquence. Le Illumina et solides plates-formes de générer lit avec une augmentation du nombre et de courtes longueurs. Le coût par mégabase de séquence est beaucoup plus faible que la plate-forme 454. En raison du grand nombre de court interprète pour l&#39;Illumina et solides plates-formes, l&#39;analyse des données est beaucoup plus de calculs. Le prix de l&#39;instrument et des réactifs pour le séquençage de la plate-forme Ion Torrent est moins cher et le temps de séquençage est plus courte de 25. Cependant, le taux d&#39;erreur et le coût par mégabase de séquence sont plus élevés par rapport à la Illumina et les plates-formes solides. Différentes plates-formes ont leurs propres avantages et inconvénients et nécessitent des méthodes d&#39;analyse des données. Le platform devraient être choisis en fonction du but de séquençage et la disponibilité des fonds. Dans cet article, nous prenons plate-forme Illumina ARN-Seq comme un exemple. Nous avons utilisé cellule EML en tant que système modèle pour étudier les régulateurs clés dans EML cellule auto-renouvellement et de différenciation, et a fourni une des méthodes détaillées de la construction de la bibliothèque de l&#39;ARN-Seq et l&#39;analyse de données pour le calcul du niveau d&#39;expression et roman détection de transcription. Nous avons montré dans notre précédente publication de cette étude de l&#39;ARN-Seq dans EML système modèle 2, lorsqu&#39;il est couplé avec un test fonctionnel (par exemple shRNA de knockdown) fournir une approche puissante dans la compréhension du mécanisme moléculaire des premiers stades de la différenciation hématopoïétique, et peut servir de modèle pour l&#39;analyse de cellules auto-renouvellement et de différenciation en général.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont utilisés en clinique pour le traitement de la greffe à reconstruire le système hématopoïétique d&#39;un patient dans de nombreuses maladies telles que la leucémie et le lymphome. Élucider les mécanismes contrôlant CSH auto-renouvellement et de différenciation est important pour l&#39;application de CSH pour la recherche et les utilisations cliniques. Cependant, il est impossible d&#39;obtenir des CSH en grande quantité en raison de leur incapacité à proliférer in vitro. Pour surmonter cet obstacle, nous avons utilisé une lignée de cellules dérivées de la moelle osseuse de souris, la lignée cellulaire EML (érythroïde, myéloïde et lymphoïde), en tant que système modèle pour cette étude. ARN-séquençage (ARN-Seq) a été de plus en plus utilisés pour remplacer les puces à ADN pour les études d&#39;expression génique. Nous rapportons ici une méthode détaillée de l&#39;utilisation de la technologie de l&#39;ARN-Seq pour enquêter sur les facteurs clés potentiels dans la régulation de la cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Le protocole fourni dans le présent document est divisé en trois parties. La première part explique comment la culture de cellules EML et séparé Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. La deuxième partie du protocole propose des procédures détaillées pour la préparation d&#39;ARN total et la construction de la bibliothèque ultérieure pour le séquençage à haut débit. La dernière partie décrit la méthode d&#39;analyse de données RNA-Seq et explique comment utiliser les données pour identifier les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle entre Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. Les facteurs de transcription plus nettement exprimés de manière différentielle ont été identifiés comme les principaux régulateurs potentiels contrôle cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Dans la section de discussion de cet article, nous mettons en évidence les étapes clés de la performance réussie de cette expérience. En résumé, ce document propose une méthode d&#39;utilisation de la technologie de l&#39;ARN-Seq pour identifier des régulateurs potentiels de l&#39;auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules EML. Les principaux facteurs identifiés sont soumis à l&#39;analyse fonctionnelle en aval in vitro et in vivo.

Afin d&#39;analyser les gènes exprimés de manière différentielle dans Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34 EML, nous avons utilisé la technologie de l&#39;ARN-Seq. La figure 1 montre le flux de travail des procédures. Après isolement de cellules de la lignée négatifs par tri magnétique de cellules, nous nous sommes séparés Lin-SCA + CD34 + et les cellules Lin-SCA-CD34 en utilisant FACS Aria. EML cellules Lin-enrichis ont été colorées avec anti-CD34, anti-Sca1 et anticorps de cocktail de la...

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Analyses ARN de séquençage et de bioinformatique ont été utilisés pour identifier les facteurs de transcription de manière significative et exprimés de manière différentielle dans des sous-populations Lin-CD34 + et CD34 Lin-des EMLcells de souris. Ces facteurs de transcription peuvent jouer un rôle important dans la détermination de l&#39;interrupteur entre les cellules Lin-CD34 auto-renouvellement Lin-CD34 + et partiellement différenciés.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vues.  The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston.  Analyses ARN de séquençage et de bioinformatique ont été utilisés pour identifier les facteurs de transcription de manière significative et exprimés de manière différentielle dans des sous-populations Lin-CD34 + et CD34 Lin-des EMLcells de souris. Ces facteurs de transcription peuvent jouer un rôle important dans la détermination de l'interrupteur entre les cellules Lin-CD34 auto-renouvellement Lin-CD34 + et partiellement différenciés. 

Vidéo: Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

L&#39;utilisation de SC1 (Pluripotin) pour soutenir MESC autorenouvellement en l&#39;absence de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Essai Reporter Oct4GiP d&#39;étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l&#39;auto-renouvellement

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...