Ce protocole est un essai simple basé sur la cytométrie d’écoulement permettant la mesure du potentiel mitochondrique de membrane et de la masse mitochondrique dans les cellules vivantes. Les analyses métaboliques standard échouent lorsque l’on travaille avec des populations rares telles que les cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode permet aux utilisateurs de profiler la membrane mitochondriale lorsqu’ils travaillent avec un faible nombre de cellules et de déterminer de nouveaux modulateurs métaboliques de cellules telles que les HSC.
En outre, vous pouvez le combiner avec des analyses fonctionnelles en aval telles que la transplantation de moelle osseuse ou des tests de formation de colonies pour déterminer la fonctionnalité de vos cellules post-culture. Notre technique peut être exploitée pour l’identification de nouvelles molécules capables d’améliorer la fonction HSC dans le contexte de la transplantation de moelle osseuse et de la récupération immunitaire hématopoïétique après des thérapies ablatives. Comme décrit dans notre protocole, notre méthode peut être employée pour évaluer la forme physique métabolique des cellules immunisées de T.
Il est très important que les cellules aient une exposition minimale à la lumière après coloration. En outre, l’utilisation de l’inhibiteur de la pompe verapamil doit être inclus afin d’évaluer la contribution de l’efflux de la pompe. Cependant, les utilisateurs doivent être conscients que le verapamil perturbe profondément l’équilibre ionique et ne peut pas être utilisé afin d’évaluer l’effet d’un modulateur métabolique sur le potentiel meitochondrial de membrane.
Démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement important parce qu’il ya quelques étapes critiques que l’on doit garder à l’esprit lorsque vous travaillez avec un faible nombre de cellules, et ces étapes sont très souvent absents dans les journaux réguliers que les utilisateurs lisent sur PubMed. Pour le tri des AEC, la population de SLS, définie par lignée négative, Sca1 positive, cKit positive est identifiée. Les cellules souches hématopoïétiques d’environ cinq à 10 % des cellules de la population de LKS sont identifiées en gémissant pour la population négative positive de CD150, CD48, étiquetée comme HSC.
Après le tri des cellules souches hématopoïétiques, centrifugez les tubes à 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirer délicatement la majeure partie du supernatant sans déloger la pastille et laisser 50 à 80 microlitres sur le dessus de la pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire dans le milieu d’expansion des cellules souches à un volume final de 200 microlitres.
Préparer une culture stérile des tissus traités 96 U-bottom plaque de puits, et d’identifier les puits où les cellules seront cultivés. Transférer 100 microlitres de milieu basal 2x préalablement préparés dans ces puits. Dans le NR bien marqué, ajouter deux microlitres d’une solution riboside nicotinamide 100x.
Transférer 100 microlitres de milieu basal 2x dans des puits pour le contrôle des taches. Graine 100 microlitres de cellules souches hématopoïétiques préparées sur le dessus des puits contenant 2x milieu basal. Ensemencer 100 microlitres de cellules entières de moelle osseuse sur des puits marqués comme des commandes de coloration.
Ajouter 200 microlitres d’eau autoclavée dans tous les puits environnants pour réduire l’évaporation des puits contenant des cellules. Placez la plaque intacte dans un incubateur à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 72 heures. Sortez la plaque pour reconstituer le riboside nicotinamide toutes les 24 heures, et remettre dans l’incubateur.
À la fin de la période de culture, ajouter deux microlitres de solution TMRM 100x et deux microlitres de solution de tache fluorescente verte 100x dans chacun des puits d’essai. Ajouter deux microlitres de 100x TMRM dans le puits de contrôle des taches TMRM. Ajouter deux microlitres de tache fluorescente verte 100x dans le puits de contrôle des taches MitoTracker.
Couvrir le dessus de la plaque de papier d’aluminium. et remettre la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 45 minutes. Retirer la plaque de l’incubateur et la centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes.
Inverser la plaque pour enlever le supernatant, et ajouter 200 microlitres de tampon FACS standard pour résuspendre. Couvrir la plaque de papier d’aluminium. Centrifuger la plaque à 300 fois g pendant cinq minutes.
Répétez cette étape de lavage trois fois. Resuspendez les cellules en 200 microlitres de tampon FACS, et transférez-les dans des tubes FACS. Pour exécuter les échantillons sur le cytomètre d’écoulement, chargez d’abord les commandes de couleur unique dans la machine, et enregistrez au moins 5000 événements dans chacun par un.
Dans le logiciel, appuyez sur Acquérir, puis Enregistrer sur le tableau de bord pour acquérir et enregistrer des commandes de couleur unique. Appuyez sur Configuration de la rémunération, et cliquez sur Calculer la compensation pour calculer la compensation. Une fois que la compensation a été appliquée, acquérir l’échantillon hématopoïétique de cellules souches, et enregistrer autant d’événements que possible.
Exportez les fichiers FACS à partir du cytomètre et ouvrez le fichier sur le logiciel d’analyse. Sur FlowJo, utilisez la dispersion vers l’avant et la diffusion latérale pour identifier la population cellulaire. Identifiez les singlets dans les portes d’à côté, puis tracez la fraction négative DAPI représentant les cellules vivantes.
Dans la porte cellulaire vivante, faire une parcelle de contour dans le TMRM et le canal vert tache fluorescente pour mesurer le potentiel de membrane mitochondriale et la masse, respectivement. Exportez l’intensité moyenne de fluorescence de ces deux canaux dans la porte des cellules vivantes. Ensuite, exportez la proportion de cellules dans la porte basse TMRM dans tous les échantillons.
Le traitement de riboside de nicotinamide a montré une augmentation claire de la population basse de TMRM. Il a également augmenté de manière significative la proportion de cellules dans la porte basse de TMRM et a montré un abaissement significatif de l’intensité de fluorescence de TMRM. La masse mitochondrique n’a pas changé sur la supplémentation riboside de nicotinamide.
En outre, la coloration de marqueur de cellules souches a été combinée avec la coloration mitochondrique post-culture. Avec la stratégie de gating pour identifier des cellules souches hématopoïétiques, l’exposition au riboside de nicotinamide a montré une augmentation significative de la population basse de TMRM et une diminution significative de l’intensité de fluorescence de TMRM dans les HSCs gated. Le signal vert vert vert de tache mitochondrique fluorescente est resté inchangé dans les deux conditions.
Il est important de couvrir la plaque de coloration avec du papier d’aluminium afin de minimiser l’exposition de la lumière aux échantillons tachés. Cette méthode peut être combinée avec des analyses en aval telles que la transplantation de moelle osseuse et des analyses de formation de colonies pour déterminer la fonctionnalité de vos cellules souches. Cette technique permet donc une méthode de dépistage simple pour l’identification de nouveaux modulateurs métaboliques des HSC.
