Ce travail a été financé, en partie, par des subventions du NIH et HL087653 HL105314. Certaines de ces méthodes ont été développées dans le laboratoire du Dr Robert Mecham à l&#39;École de médecine de l&#39;Université de Washington.

1. L&#39;échographie et la pression du système <ol><li> Démarrez le système à ultrasons selon les instructions du fabricant (Vevo 770, Visualsonics). Remplir la sonde appropriée (âge E18 - P7 = modèle 708, l&#39;âge&gt; = P7 modèle 707B) avec de l&#39;eau distillée et se connecter au système à ultrasons. Placez la sonde dans le support réglable à l&#39;orientation approximative nécessaire pour obtenir une LV grand axe d&#39;une souris monté sur la plate-forme d&#39;imagerie de sorte que le sommet LV est pointé vers le bras d&#39;injection. </li><li> Le système de la pression se compose d&#39;un transducteur de pression remplie de fluide, l&#39;amplificateur de pont, le système d&#39;acquisition de données et des logiciels d&#39;enregistrement de données (LabChart). Les connexions se composent de trois voies robinets, tuyaux, seringues Luer et raccords cannelés. Seringue 20 ml est rempli avec une solution saline hépariné 10% pour le rinçage à une extrémité. L&#39;autre extrémité se connecte à une aiguille et un corps de seringue 3 ml est modifiée pour une utilisation comme boîtier pour maintenir le tube d&#39;aiguille dans le bras d&#39;injection (figure 1). </li><li&gt; Calibrer le système transducteur de pression avec un manomètre. </li><li> Monter le tube d&#39;aiguille et le tubage dans le bras d&#39;injection du système à ultrasons. Serrer le capteur de pression dans un support annulaire à la hauteur approximative de la plate-forme d&#39;imagerie. Fixer une aiguille adaptée à l&#39;âge de la souris (à l&#39;âge E18 - P3 = 30G, l&#39;âge&gt; P3 = 25G) à la tubulure de l&#39;aiguille. Les petites aiguilles obtenir bouché plus facile, il est plus difficile d&#39;avancer à travers la paroi thoracique, et avoir un temps de réponse plus lent. Par conséquent, la plus grande taille qui correspond à l&#39;aiguille dans la lumière BT est utilisé pour chaque âge. </li><li> Placer un monticule de gel pour ultrasons sur la plate-forme d&#39;imagerie et soigneusement aligner la sonde en utilisant la position réglable de sorte que l&#39;aiguille peut être avancé dans le gel directement sous le centre de la sonde d&#39;imagerie (figure 2). L&#39;aiguille doit être assez loin en dessous de la sonde pour ne pas percer le couvercle de la sonde, mais assez proche pour être au sein de la profondeur de la sonde focale. Si nécessaire, l&#39;aiguille peut être plié à la main de sorte qu&#39;il demeure en ee bon plan tout au long de sa course. </li><li> Maintenir l&#39;alignement, rétracter l&#39;aiguille et augmenter la sonde d&#39;imagerie à placer une souris sur la plate-forme d&#39;imagerie. Rincer l&#39;aiguille afin d&#39;éliminer tout gel qui peut avoir pénétré la pointe. </li></ol> 2. La préparation de la souris <ol><li> Toutes les méthodes indiquées dans le présent protocole ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation. Anesthésier une mère enceinte chronométré (E18) ou de la souris néonatale (P1 - 20) par inhalation continue de 1,5% d&#39;isoflurane. Tube peut être inséré dans un cône de nez standard pour accueillir la tête d&#39;un petit souris néonatale (P1 - 15). </li><li> Fixez la souris pour la plate-forme d&#39;imagerie du système à ultrasons dans une position décubitus dorsal avec le sommet LV pointant vers le bras d&#39;injection. Pour les mères enceintes, appliquer échographie gel pour surveiller le rythme cardiaque avec le détecteur de joint ECG et insérez le thermomètre rectal pour un asservissement de la température du corps. Souriceaux nouveau-nés sont f trop petitou ces détecteurs, afin de fréquence cardiaque est surveillée pendant les mesures de pression et la température du corps est maintenue avec une lampe de chaleur externe. </li><li> Enlever les poils de l&#39;abdomen de la femme enceinte ou de la poitrine de la jeune souris avec une crème dépilatoire. Souriceaux nouveau-nés (P1 - 10) ne nécessitent pas de l&#39;épilation. </li><li> Pour les mères enceintes, ouvrir l&#39;abdomen avec des ciseaux et des pinces à dissection courbes. Externaliser une corne utérine et le placer sur une gaze humidifiée avec une solution saline chaude. Soigneusement manipuler un embryon dans la bonne position pour obtenir une vue parasternale axe long de la LV en utilisant la sonde d&#39;échographie. Mesurer la pression dans tous les embryons de ce côté avant l&#39;externalisation de la corne utérine autre. Gardez tous les embryons et l&#39;abdomen de la mère humide avec addition périodique de sérum physiologique chaud. </li></ol> 3. Mesure de la pression <ol><li> Lieu préchauffé, gel pour ultrasons dégazé sur la souris embryonnaire ou néonatale. Souriceaux nouveau-nés qui n&#39;ont pas été dépilée devrait avoir une petite quantité de gel pour ultrasons frotté sur la poitrine avant que le gel reste ultrasons est appliqué pour améliorer couplage. Abaisser la sonde d&#39;imagerie et ajuster l&#39;angle de la plate-forme d&#39;imagerie pour obtenir une vue optimale parasternale LV axe long. Ne pas régler l&#39;angle de la sonde car l&#39;alignement aiguille sera perdu. </li><li> Tout en surveillant l&#39;image sur l&#39;écran LV ultrasons, lentement avancer l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit à proximité du fond de la sonde. Ajustez la position de l&#39;aiguille et la sonde, si nécessaire, pour corriger des changements d&#39;alignement. Rincez délicatement l&#39;aiguille avec une solution saline. Début des données de pression d&#39;enregistrement et de mettre à zéro le transducteur de pression avec le logiciel LabChart. Le transducteur dérive avec la température et la position, il est donc important pour le zéro juste avant la mesure de pression dans chaque souris. </li><li> Avancer lentement l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;il puisse être vu au bord de l&#39;image échographique, mais pas encore dans le VG. Ajustez la position de l&#39;aiguille, si nécessaire, pour entrer dans le LV à laapex. Ajustez la position de la sonde, si nécessaire, pour maintenir une image claire de l&#39;aiguille. Faire avancer l&#39;aiguille dans la lumière VL (figure 3), tout en enregistrant des données de pression et de suivi de l&#39;emplacement d&#39;aiguille sur l&#39;image d&#39;ultrasons. Le début d&#39;enregistrements pulsatile du transducteur de pression confirme l&#39;emplacement à l&#39;intérieur du lumen VL (figure 4). </li><li> Si l&#39;aiguille semble être dans la lumière LV, mais ne sont pas des enregistrements de pression pulsatile, de niveau avec un robinet de lumière sur le piston de seringue, jusqu&#39;à ce que une augmentation de pression est détectée (environ 5 à 10 volumes pl). Cela devrait éliminer toute obstruction qui peut empêcher d&#39;obtenir une lecture précise. Si les lectures de pression ne sont pas encore pulsatile, l&#39;aiguille peut être au-dessus ou au-dessous le bon plan et ne pas être inséré dans la lumière LV. Retrait de l&#39;aiguille, rincer avec une solution saline, et avance à nouveau. Si les lectures sont pulsatiles toujours pas obtenu, passer à la souris à côté. Utilisez une nouvelle aiguille pour chaque souris. </li><li> Des lectures de pression qui réussissent peuvent être obtenus à partir de 75% desles souris embryonnaires et néonatale tenté. Lectures devrait prendre 5 - 10 minutes chacune et les données de pression pour une souris ne devrait pas être inclus si les fréquences cardiaques sont nettement différent de celui attendu (figure 5A). La fréquence cardiaque a un effet significatif sur les mesures cardiovasculaires et les rythmes cardiaques altérés sont révélateurs de la détresse cardiaque. Détresse embryonnaire se produit habituellement 1 - 1,5 heures après l&#39;externalisation d&#39;abord l&#39;utérus, si la vitesse est importante pour mesurer la pression dans une portée entière. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Tous les résultats sont présentés pour les souris C57BL6J. Une image de l&#39;aiguille dans la lumière BT pour une souris P1 dans la figure 3. L&#39;aiguille est nécessaire à la perforation de la paroi thoracique et d&#39;accéder à la petite lumière LV, mais il augmente de façon significative le temps de réponse du système de pression. Quand une augmentation de la pression approximative étape est appliquée manuellement au système, le temps pour atteindre 67% de la pression maximale est 0,067 soic avec la tubulure que (le plus probable indicatif du temps réel pour appliquer l&#39;étape de pression), 0,105 sec avec une aiguille G 25 et 0.529 sec avec une aiguille G 30. Le retard dans la réalisation de pression maximale peut être vu dans les tracés complets présentés dans la figure 4A et 4C. Bien que le temps de réponse est plus lente avec l&#39;aiguille 30G, la forme d&#39;onde est mieux saisi les stades embryonnaires et néonatale précoce, car la fréquence cardiaque augmente avec l&#39;âge chez la souris 5. Malgré cette limitation, la pression systolique peut être calculé en supposant que le LV vrai diastolique (minimale) de pression est nulle, et la pression systolique (maximale) de pression LV est de deux fois la pression moyenne LV à partir des valeurs à l&#39;équilibre (figure 4B et 4D ) 6. Il est généralement admis que la systolique du ventricule gauche et les pressions artérielles sont égaux. Les pressions mesurées rythme cardiaque et calcule BT pour différents âges entre E18 et P14 sont présentés dans la figure 5. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig1.jpg" /> Figure 1. Image du transducteur de pression avec joints à trois voies robinets, de sexe masculin (M) et femelles (F) des connexions de type luer lock, des barbes de tuyaux, tubes, seringues et aiguilles. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig2.jpg" /> Figure 2. Image de l&#39;. Mis en place pour aligner l&#39;aiguille avec la sonde d&#39;imagerie (A) La plate-forme d&#39;imagerie est tourné de telle sorte que le sommet LV de la souris est confronté le bras d&#39;injection. La sonde est montée dans le support réglable à l&#39;orientation approximative nécessaire pour obtenir une LV long axe de l&#39;image. Le boîtier tube aiguille est montée dans le bras d&#39;injection. L&#39;aiguille est avancé dans un monticule de gel pour ultrasons sur la plate-forme d&#39;imagerie pour déterminer l&#39;angle et la position verticale et horizontale par rapport à la sonde d&#39;imagerie (B). <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig3.jpg" /> Figure 3. Image de l&#39;aiguille (N) avancé à travers la paroi thoracique (CW) etdans la lumière LV dans une souris P1. La barre d&#39;échelle = 0,1 mm. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig4.jpg" /> Figure 4. Exemple lectures pulsatiles de pression que l&#39;aiguille pénètre dans le LV d&#39;un E18 (A) et P14 (C) de la souris. Il ya un délai pour parvenir à un état d&#39;équilibre en raison du temps de réponse du système avec l&#39;aiguille fixée. Zoom vue de les lectures à l&#39;état d&#39;équilibre sont présentés dans la note B et D. que les pressions minimales E18 BT sont proches de zéro, mais la forme d&#39;onde complète à partir de zéro à la pression maximale ne peut pas être enregistré au rythme cardiaque plus élevé de P14 chez la souris. Les pressions moyennes sont calculées à partir des lectures état d&#39;équilibre et il est supposé que la pression systolique LV = 2 x mesurée de la pression moyenne. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig5.jpg" /> Figure 5 fréquences cardiaques mesurées (a) et calculées systolique pressions BT (B) pour E18 -. P14 souris. N = 7 pour E18, 5 pour la P1, P3 22 pour, 23 pour la P7 et 16 pour P14 <sup&gt; 5-7.

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	<li>Ji, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+ventricular+diastolic+function+correlate+with+changes+in+ventricular+myoarchitecture+in+normal+mouse+embryos.">Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos.</a> Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).</li><li>Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+nonuniformity+of+geometric+and+mechanical+properties+of+mouse+aorta+is+increased+during+postnatal+growth.">Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).</li><li>Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+blood+pressure+and+baroreflex+in+mice.">Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice.</a> Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).</li><li>Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+aortic+diameter+and+compliance+precedes+blood+pressure+increases+in+postnatal+development+of+elastin-insufficient+mice.">Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).</li><li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+elasticity+alters+cardiovascular+structure+and+function+in+newborn+mice.">Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice.</a> Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).</li><li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+elastin+to+aortic+development+in+mice.">The importance of elastin to aortic development in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).</li><li>Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microfibrils+in+development+and+disease.">Extracellular microfibrils in development and disease.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).</li><li>Li, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease,+supravalvular+aortic+stenosis.">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).</li><li>Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+on+cardiac+function+during+echocardiography+in+mice.">Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole présenté ici fournit une méthode pour mesurer la pression dans le LV embryonnaire fin et au début des souriceaux nouveau-nés. La principale limitation de ce protocole est la résolution temporelle de la pression du système. Le signal de pression est amorti lorsqu&#39;il se déplace de la LV à travers l&#39;aiguille au transducteur, et que les valeurs moyennes de pression peut être enregistrée. L&#39;amortissement peut être minimisé en utilisant la plus grande aiguille possible, mais l&#39;aiguill...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipements </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Haute résolution système à ultrasons </td><td> Visualsonics </td><td> Vevo 770 </td><td> Ou un autre système à ultrasons appropriée </td></tr><tr><td> Hautes sondes à ultrasons de fréquence </td><td> Visualsonics </td><td> 708 et 707B </td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme d&#39;imagerie et de bras d&#39;injection </td><td> Visualsonics </td><td> Imaging Station 2 </td><td> Avec l&#39;ECG et le contrôle suivi de la température de la plate-forme </td></tr><tr><td> Capteur de pression </td><td> Instruments AD </td><td> MLT 844 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur en pont </td><td> Instruments AD </td><td> ML221 </td><td></td></tr><tr><td> Système d&#39;acquisition de données </td&gt; <td> Instruments AD </td><td> ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;enregistrement de données </td><td> Instruments AD </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Anneau se lever et serrer </td><td> Divers fournisseurs </td><td></td><td> Pour tenir transducteur de pression lors des mesures </td></tr><tr><td> 3-way robinets avec les connexions Luer lock mâle </td><td> Cole Parmer </td><td> 30600-02 </td><td></td></tr><tr><td> 1/16 &quot;tubes Tygon ID </td><td> Cole Parmer </td><td> 06408 </td><td></td></tr><tr><td> Luers mâles et femelles w cannelés / 1/16 le tuyau &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> 45510-50 45510-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 &quot;tube avec Luer mâle et femelle à chaque extrémité </td><td> Cole Parmer </td><td> 30600-60 </td><td></td></tr><tr><td> 3 et 10 seringues mL </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 30 et 25G aiguilles </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> 1,5 pouces de longueur </td></tr><tr><td> Big Ben manomètre </td><td> Riester </td><td> 1456-100 </td><td></td></tr><tr><td> Saline </td><td> Divers fournisseurs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Divers fournisseurs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel pour ultrasons </td><td> Parker </td><td> Aquasonic 100 </td><td></td></tr><tr><td> Lotion démaquillante cheveux </td><td> Nair </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice

La pression artérielle augmente de façon significative au cours du développement embryonnaire et postnatal chez les animaux vertébrés. Chez la souris, le débit sanguin est le premier détectable autour du jour embryonnaire (E) 8.5 1. Systolique ventriculaire gauche (VG) la pression est de 2 mmHg à 11 mmHg et E9.5 à E14.5 2. A ces stades la mi-embryonnaires, le LV est clairement visible à travers la paroi thoracique pour les mesures de pression invasive parce que les nervures et la peau ne sont pas pleinement développés. Entre E14.5 et la naissance (environ E21) des méthodes d&#39;imagerie doit être utilisée pour afficher le LV. Après la naissance, des augmentations moyennes de pression artérielle de 30 à 70 mmHg au jour postnatal (P) 2 - 35 3. Au-delà de P20, la pression artérielle peut être mesurée avec l&#39;état solide (c.-à-cathéters Millar ou SCISENSE). Avant P20, ces cathéters sont trop gros pour développer les artères de souris et de la pression artérielle doit être mesurée à l&#39;aide personnalisée tiré cathéters en plastique attachés à des transducteurs de pression remplis de liquide ou de verre 3 micropipettes attsouffrait d&#39;asservissement des transducteurs de pression nulles 4. Nos travaux récents ont montré que la plus forte augmentation de la pression artérielle se produit pendant les embryonnaire fin à la période postnatale précoce chez la souris 5-7. Cette forte augmentation de la pression artérielle peuvent influer sur des cellules musculaires lisses (SMC) phénotype dans les artères en développement et déclencher des événements importants mécanotransduction. Dans la maladie humaine, où les propriétés mécaniques des artères en voie de développement sont compromis par des défauts dans les protéines de la matrice extracellulaire (syndrome c.-à-Marfan 8 et une sténose aortique supravalvulaire 9) les changements rapides de la pression artérielle au cours de cette période peut contribuer à phénotype de la maladie et la gravité par des altérations dans la mécanotransduction signaux. Par conséquent, il est important de pouvoir mesurer les changements de pression artérielle au cours de la fin embryonnaire et la période néonatale dans des modèles murins de maladies humaines. Nous décrivons une méthode pour mesurer la pression à la fin de LVembryonnaire (E18) et au début du post-natal (P1 - 20) chez la souris. Une aiguille attachée à un transducteur de pression remplie de fluide est insérée dans le LV sous échographie. On prend soin de maintenir une fonction cardiaque normale au cours du protocole expérimental, en particulier pour les souris embryonnaires. Les données représentatives sont présentées et les limites du protocole sont discutés.

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Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Mesure de la pression ventriculaire gauche (VG) chez la souris embryonnaires et néonatale est décrite. La pression est mesurée par l&#39;insertion d&#39;une aiguille reliée à un transducteur à remplissage de fluide dans le BT sous échographie. Des précautions doivent être prises pour maintenir une fonction cardiaque normale au cours du protocole expérimental.

Mesure de la pression ventriculaire gauche à la fin de souris embryonnaires et néonatale

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K vues.  Saint Louis University. Mesure de la pression ventriculaire gauche (VG) chez la souris embryonnaires et néonatale est décrite. La pression est mesurée par l'insertion d'une aiguille reliée à un transducteur à remplissage de fluide dans le BT sous échographie. Des précautions doivent être prises pour maintenir une fonction cardiaque normale au cours du protocole expérimental.

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both cleansing agents and daily variations in ambient moisture; both of which can alter the water content of the tissue. Reductions in water content from severe barrier dysfunction or low humidity environments can alter SC stiffness and cause a build-up of drying stresses. In extreme conditions, these factors can cause mechanical rupture of the tissue. We have established a high throughput method of quantifying dynamic changes in the mechanical properties of SC upon drying. This technique can be employed to quantify changes in the drying behavior and mechanical properties of SC with cosmetic cleanser and moisturizer treatments. This is achieved by measuring dynamic variations in spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. In-plane radial displacements acquired during drying are azimuthally averaged and fitted with a profile based on a linear elastic contractility model. Dynamic changes in drying stress and SC elastic modulus can then be extracted from the fitted model profiles.

This article describes a method of quantifying the dynamic drying behavior and mechanical properties of stratum corneum by measuring spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. This technique can be used to measure how different chemical treatments alter drying and tissue mechanical properties.

Mesure et modélisation contractile séchage dans Human stratum corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

Recherche

Bio-ingénierie

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in areas requiring ammonia for synthetic fertilizer. Such wind energy is often called &#34;stranded,&#34; because it is only available far from population centers where it can be directly used.
In the proposed low pressure process, nitrogen is made from air using pressure swing absorption, and hydrogen is produced by electrolysis of water. While these gases can react at approximately 400 &#176;C in the presence of a promoted conventional catalyst, the conversion is often limited by the reverse reaction, which makes this reaction only feasible at high pressures. This limitation can be removed by absorption on an ammine-like calcium or magnesium chloride. Such alkaline metal halides can effectively remove ammonia, thus suppressing the equilibrium constraints of the reaction. In the proposed absorption-enhanced ammonia synthesis process, the rate of reaction may then be controlled not by the chemical kinetics nor the absorption rates, but by the rate of the recycle of unreacted gases. The results compare favorably with ammonia made from a conventional small scale Haber-Bosch process.

Ammonia can be synthesized at low pressure by using a conventional catalyst and an ammonia selective absorbent.

Synthèse de l’ammoniac à basse pression

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff practice clinical interventions such as chest compressions to ensure patient survival in the case of bradycardia or cardiac arrest. The simulators used currently are of low physical fidelity and therefore cannot provide qualitative insight into the procedure of chest compressions. The embedding of an anatomically realistic heart model in future simulators enables the detection of cardiac output generated during chest compressions; this can provide clinicians with an output parameter, which can deepen the understanding of the effect of the compressions in relation to the amount of blood flow generated. Before this monitoring can be achieved, an anatomically realistic heart model must be created containing: two atria, two ventricles, four heart valves, pulmonary veins and arteries, and systemic veins and arteries. This protocol describes the procedure for creating such a functional artificial neonatal heart model by utilizing a combination of magnetic resonance imaging (MRI), 3D printing, and casting in the form of cold injection molding. Using this method with flexible 3D printed inner molds in the injection molding process, an anatomically realistic heart model can be obtained.

This protocol describes a procedure for creating functional artificial neonatal heart models by utilizing a combination of magnetic resonance imaging, 3D printing, and injection molding. The purpose of these models is for integration into the next generation of neonatal patient simulators and as a tool for physiological and anatomical studies.

Modèle coeur néonatale anatomiquement réaliste pour une utilisation dans les simulateurs patients néonatales

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Mouse Model of Pressure Ulcers After Spinal Cord Injury

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony prominences. There is, however, little known about the impact of SCI on skin wound healing in the context of animal models in controlled experimental settings. In this study, a simple, non-invasive, reproducible and clinically relevant mouse model of PUs in the context of complete SCI is presented. Adult male mice (Balb/c, 10 weeks old) were shaved and depilated. Post-depilation (24 h), mice were subjected to laminectomy followed by complete spinal cord transection (T9-T10 vertebrae). Immediately after, a skin fold on the back of the mice was lifted and sandwiched between two magnetic discs held in place for next 12 h, thus creating an ischemic area that developed into a PU over the following days. The wounded areas demonstrated tissue edema and epidermal disappearance by day 3 post-magnet application. PUs spontaneously developed and healed. Healing was, however, slower in the SCI mice compared to control non-SCI mice when the wound was created below the level of SCI. Conversely, no difference in healing was seen between SCI and control non-SCI mice when the wound was created above the level of SCI. This model is a potentially useful tool to study the dynamics of skin PU development and healing after SCI, as well as to test therapeutic approaches that may help heal such wounds.

Here, we describe a simple method to induce clinically relevant skin pressure ulcers (PUs) in a mouse model of spinal cord injury (SCI). This model can be used in pre-clinical studies to screen for different therapeutics for healing PUs in SCI patients.

Modèle murin d’escarres après une lésion de la moelle épinière

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Mesure des métalloprotéinases de la matrice cellulaire Global et l’activité métabolique des Hydrogels 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder regions, collectively referred to as the brachial plexus (BP). Despite recent advances in obstetrical care, the problem of NBPP continues to be a global health burden with an incidence of 1.5 cases per 1,000 live births. More severe types of this injury can cause permanent paralysis of the arm from the shoulder down. Prevention and treatment of NBPP warrants an understanding of the biomechanical and physiological responses of newborn BP nerves when subjected to stretch. Current knowledge of the newborn BP is extrapolated from adult animal or cadaveric BP tissue instead of in vivo neonatal BP tissue. This study describes an in vivo mechanical testing device and procedure to conduct in vivo biomechanical testing in neonatal piglets. The device consists of a clamp, actuator, load cell, and camera system that apply and monitor in vivo strains and loads until failure. The camera system also allows monitoring of the failure location during rupture. Overall, the presented method allows for a detailed biomechanical characterization of neonatal BP when subjected to stretch.

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Presented here are methods to perform in vivo biomechanical testing on brachial plexus in a neonatal piglet model.

Méthodes pour les tests biomécaniques In Vivo sur le plexus brachial chez les porcelets néonatals

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Evaluation of Left Ventricular Structure and Function using 3D Echocardiography

Three-dimensional (3D) quantification of the left ventricle (LV) provides significant added value in terms of diagnostic accuracy and precise risk stratification in various cardiac disorders. Recently, 3D echocardiography became available in routine cardiology practice; however, high-quality image acquisition and subsequent analysis have a steep learning curve. The present article aims to guide the reader through a detailed 3D protocol by presenting tips and tricks and also by highlighting the potential pitfalls to facilitate the widespread but technically sound use of this important technique concerning the LV. First and foremost, we show the acquisition of a high-quality 3D dataset with optimal spatial and temporal resolution. Then, we present the analytical steps toward a detailed quantification of the LV by using one of the most widely applied built-in software. We will quantify LV volumes, sphericity, mass and also systolic function by measuring ejection fraction and myocardial deformation (longitudinal and circumferential strain). We will discuss and provide clinical examples about the essential scenarios where the transition from a conventional echocardiographic approach to a 3D-based quantification is highly recommended.

In this article, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the volumetric assessment and speckle-tracking analysis of the left ventricle by 3D echocardiography, particularly focusing on practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Évaluation de la structure et de la fonction ventriculaires gauches à l’aide de l’échocardiographie 3D

Three-dimensional (3D) quantification of the left ventricle (LV) provides significant added value in terms of diagnostic accuracy and precise risk ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, multiple ligaments, and approximately 20 muscles. Unfortunately, shoulder pathologies (e.g., rotator cuff tears, joint dislocations, arthritis) are common, resulting in substantial pain, disability, and decreased quality of life. The specific etiology for many of these pathologic conditions is not fully understood, but it is generally accepted that shoulder pathology is often associated with altered joint motion. Unfortunately, measuring shoulder motion with the necessary level of accuracy to investigate motion-based hypotheses is not trivial. However, radiographic-based motion measurement techniques have provided the advancement necessary to investigate motion-based hypotheses and provide a mechanistic understanding of shoulder function. Thus, the purpose of this article is to describe the approaches for measuring shoulder motion using a custom biplanar videoradiography system. The specific objectives of this article are to describe the protocols to acquire biplanar videoradiographic images of the shoulder complex, acquire CT scans, develop 3D bone models, locate anatomical landmarks, track the position and orientation of the humerus, scapula, and torso from the biplanar radiographic images, and calculate the kinematic outcome measures. In addition, the article will describe special considerations unique to the shoulder when measuring joint kinematics using this approach.

Biplane videoradiography can quantify shoulder kinematics with a high degree of accuracy. The protocol described herein was specifically designed to track the scapula, humerus, and the ribs during planar humeral elevation, and outlines the procedures for data collection, processing, and analysis. Unique considerations for data collection are also described.

Mesure de la cinématique 3D in vivo de l’épaule à l’aide de la vidéoradiographie biplanaire

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...