Ce travail a été financé par le National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, affiliée Fondateurs (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fonds, New York (SHP).

1. Préparation <ol><li> Préparer les solutions suivantes et tubes (tableau 1) comme suit: <ol><li> Écheveaux solution, pas de calcium, de magnésium ou de l&#39;indicateur avec de la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml). </li><li> Tampon phosphate salin (PBS), 1x, pas de calcium, de magnésium aucune. </li><li> Éthanol, 70%, faire 500 ml. </li><li> Tamponnée de formaldéhyde, de 7-10% avec du PBS, faire 500 ml. </li><li> Solutions d&#39;anesthésie: <ol><li> Avertin. Ajouter avec précaution 5 ml de 2-méthyl-2-butanol à 5 ​​g de 2,2,2-tribromoéthanol. Une fois dissous, gardez solution mère à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Prenez 0,25 ml de la solution mère et le diluer avec 10 ml d&#39;1xPBS en bouteille à fond de verre. Envelopper la bouteille avec du papier d&#39;aluminium, placer à 37 ° C jusqu&#39;à dissolution, puis aliquote dans des tubes de 5 ml en polypropylène et conserver au réfrigérateur. Chauffez une aliquote du matin de l&#39;expérience. </li><li> Barbituriques. Diluer la solution mère avec du PBS pour donner 2,6% barbiturique solution. Placez aliquotes 3-4 ml dans des tubes en polypropylène. </li></ol></li></ol></li><li> Organiser trois travaux-zones (figure 1). </li><li><ol><li> Zone A: Disposer les éléments suivants: Formulaire étude pour enregistrer le numéro d&#39;identification étude, la date, le poids corporel, le poids du coeur droit, le coeur gauche et du septum, une balance de précision (0-50 g à 0,01 g de précision) pour déterminer le poids du corps; micro-échelle pour déterminer le poids du cœur à 0,001 g de précision; pèsent bateaux, les solutions d&#39;anesthésie (clairement identifiés), petit vase de Dewar d&#39;azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir des échantillons de sang et de tissus (tableau 1); instruments chirurgicaux ( Le tableau 2, figure 2), et les solutions pour nettoyer les instruments (tableau 1). </li><li> Zone B: Disposez les articles suivants: microscope de dissection; cathéter cardiaque droite relié à une unité de contrôle de la pression qui est connecté à un amplificateur et un ordinateur portable. Le cathéter est placé dansun bécher contenant de l&#39;eau. Disposer les instruments chirurgicaux (tableau 2), des morceaux de coupe de suture à la longueur optimale et placés dans un bateau pèse; ruban (ruban autoclave est optimale) coupé à la longueur et la largeur optimale et alignés sur le banc microscope ou au laboratoire pour un accès facile, des cotons-tiges et Epilateur solution. Étalonner le cathéter au début de l&#39;étude. </li><li> Zone C: Disposez les éléments suivants: lentilles loupe; canule trachéale; seringues de 1 ml; coupe de suture à la longueur optimale et placé dans un bateau peser, petit vase de Dewar d&#39;azote liquide; conteneur isotherme avec de la glace, tubes et plaques à 24 puits pour recueillir BAL et des échantillons de tissus (tableau 1), les instruments chirurgicaux (tableau 2), des solutions pour effectuer BAL et à nettoyer la canule trachéale et les instruments (tableau 1). </li></ol></li></ol> 2. Cathétérisme cardiaque droit <ol><li> Peser souris à l&#39;aide d&#39;une balance de précision en plaçant délicatement la souris dans une pesée bd&#39;avoine. Assurez-vous de traiter l&#39;animal en douceur et en silence. Notez le poids. Le protocole décrit fonctionne le mieux pour les souris qui sont de 20 g ou plus parce que le diamètre de la veine jugulaire doit accueillir le cathéter de pression, il est possible de sonder les petites souris (17 g ou plus) tant que la veine est assez grand. </li><li> Anesthésier la souris par injection avec Avertin en fonction du poids corporel (10 ul / g), par exemple pour donner 20 g 200 pi, pour donner 25 g 250 pi, pour donner 30 g 300 pl. Le volume d&#39;injection exacte doit être ajustée en fonction de la souche de souris. Assurez-vous de traiter l&#39;animal en douceur et en silence car le stress peut modifier la réponse à l&#39;anesthésie. </li><li> Une fois que la souris est sous sédatif, les placer sur du papier de soie plissé double. Notez le numéro d&#39;identification sur le papier. Frottez doucement la lotion épilation à la face ventrale du cou pour dégager le champ opératoire. Placez la souris en arrière sur le papier et attendre pendant 1-2 min. </li><li> Enlever les poils de la face ventraledu col par caressant doucement les cheveux dans le sens de la pousse des cheveux avec des cotons-tiges. </li><li> Soin de déterminer la profondeur de l&#39;anesthésie suffisante en vérifiant l&#39;absence du réflexe de pointe: la souris ne réagit pas au pincement de ses orteils. </li><li> En travaillant rapidement et détendue, le reste de l&#39;cathétérisme cardiaque droit ne devrait pas prendre plus de 10 minutes, de façon optimale 3-6 min. Il est important que le tissu ne se dessèche pas parce que le cathéter doit glisser dans la veine et se déplacent à l&#39;intérieur de la veine sur une couche d&#39;humidité. Conformément moment de la procédure est importante pour la production de données qui soient comparables entre les groupes. </li><li> Placez la souris sur le dos du papier de soie et de transfert de papier tissu sur mousse de polystyrène bord. Fixer les pattes et la tête en place avec du ruban autoclave. </li><li> Faire une incision de la peau de mandibules au sternum (sternum). </li><li> Disséquer soigneusement vers le haut thyroïde grands vers les mandibules pour exposer la veine jugulaire droite une trachée. </li><li> Lieu polystyrène conseil d&#39;administration en tenant la souris sous le microscope de dissection avec le plan focal déjà en place et la lentille à environ 0,8 x grossissement (grossissement total [pièce cristallin x] est d&#39;environ 8x. </li><li> Soigneusement microdissect la veine jugulaire droite en enlevant entourant le tissu conjonctif avec des pinces chirurgicales. </li><li> Placez deux morceaux de suture au-dessus de la veine jugulaire droite. Attacher le fil de suture proche de la mandibule pour fermer le débit sanguin dans la veine d&#39;un nombre très limité, de placer le fil de suture qui est plus proche de la poitrine / sternum à un noeud lâche autour de la veine. On peut utiliser le mince filet de sang pour trouver plus tard le trou dans la veine, si cela s&#39;avérait nécessaire. </li><li> Respirez et détendez-vous (desserrer les muscles du cou et de la mâchoire) pour garder vos yeux sur la veine à travers l&#39;oculaire. Cela permettra d&#39;assurer que vos mains et vos doigts se déplacer en toute sécurité, facilement et détendue. Tout en maintenant la veine avec une pince sur le côté le plus proche deles mandibules, découper un trou dans la veine entre les deux points de suture à l&#39;aide de micro-ciseaux exploités par l&#39;autre main. Déposez les ciseaux micro-, et de garder la main détendue que, pour sentir le cathéter. Doucement récupérer le cathéter en le tenant entre le pouce et l&#39;index (Figure 3). Insérer le cathéter dans l&#39;orifice de la veine. </li><li> Avancer doucement le cathéter dans le coeur droit (figure 3). Observer les marques au cathéter qui donne un indice approximatif de la distance du cathéter doit être inséré et observer le moniteur. Une fois les courbes de pression sont affichées, serrez délicatement la partie inférieure de suture autour du cathéter. Parce que le cathéter a résistance à la traction qui lui donne une bobine, et parce que le rythme respiratoire et cardiaque de la souris ajouter du mouvement, en outre fixer le cathéter avec du ruban adhésif. </li><li> Mesures de pression records pendant 2 minutes pour une analyse ultérieure (Figure 4). </li><li> Ouvrez le support de suture du cathéter, puis doucement Retrieve cathéter. Essuyez la partie arrière du transducteur de pression, replacez-le dans le bol avec de l&#39;eau. Ne touchez pas le capteur de pression. </li><li> Transfert de la souris au-dessus du papier de soie à la zone A pour l&#39;euthanasie, la collecte de sang et le tissu splénique. Nettoyer les instruments chirurgicaux. </li><li> Démarrez la procédure avec l&#39;animal suivant. Lorsque la synchronisation permet, injecter l&#39;anesthésique dans l&#39;attente d&#39;enregistrer la courbe de pression (2,15). </li></ol> 3. Prélèvement des échantillons de sang et la rate <ol><li> Injecter barbituriques solution, 400 pi par souris et attendre pendant 1-2 min. Ceci est habituellement effectué dans notre laboratoire afin d&#39;éviter la possibilité que les souris par inadvertance se remettre de l&#39;anesthésie-avertin tout en étant saigné. Normalisation appropriée de l&#39;expérience est réalisée en injectant la même dose de barbiturique solution par souris, et en attendant la même quantité de temps avant la récolte du sang. Si elle est autorisée par la protection des animaux et institutionnel Utiliser Comité etaussi longtemps que les animaux sont suivis pendant la profondeur de l&#39;anesthésie avant la saignée, cette étape peut être omise. </li><li> Faire une incision dans l&#39;abdomen. Ouvrez la veine caudale (la veine cave) et recueillir le sang à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Ablation de la rate, ou un morceau de la rate dans le tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l&#39;azote liquide, ou dans la plaque à 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks pour la préparation ultérieure de cellules individuelles. </li><li> Transfert de la souris au-dessus du papier de soie pour le travail et la zone C pour la collecte des BAL, les ganglions lymphatiques drainant poumon, le poumon et les tissus cardiaques. Nettoyer les instruments chirurgicaux. </li></ol> 4. Collecte des échantillons du poumon et coeur <ol><li> Disséquer la trachée libre de muscle et de tissu conjonctif. Pince placement sous la trachée, tirez suture à travers. Doucement générer suffisamment extensible pour couper un trou. Maintenir l&#39;étirement doux, insérer la canule trachéale en utilisant un mouvement tournant légèrement, et la suture canule into lieu. Pour l&#39;insertion de la canule trachéale, assurez-vous que la trachée est humide, si nécessaire, ajouter une goutte de solution de Hanks. Tout au long de la procédure, respirer, se détendre le cou et les muscles de la mâchoire, de garder mouvements de la main sûre et en douceur. </li><li> Disséquer ouvrir la cage thoracique en retirant avec précaution le sternum à partir de l&#39;extrémité abdominale. Ne pas déranger le contenu du thorax car cela rendra très difficile de trouver le ganglion lymphatique. </li><li> Effectuer lavage broncho-alvéolaire (LBA) en insérant doucement 1 ml de tampon de Hanks, tournez doucement la seringue et récupérer le liquide de LBA. Répétez 3 fois, tube étroit et place sur la glace. Tout au long de la procédure, garder les yeux sur l&#39;extrémité de la canule trachéale qui se connecte à la seringue. Coup d&#39;œil sur le thorax d&#39;observer l&#39;inflation et la déflation des poumons. </li><li> Ganglion lymphatique récolte du poumon en maintenant paroi de la cage thoracique d&#39;un jeu de pinces, la recherche et la récupération des ganglions lymphatiques avec une autre pince. Ganglions lymphatiques lieu en plaque à 24 puits. Il est important de kmaintenant où chercher: à partir de la nuque, trouver l&#39;entrée de la cage thoracique du côté droit de la souris et regarder au-dessus de la colonne vertébrale (figure 5). </li><li> Coeur de récolte et les placer sur du papier de soie. Isoler le cœur droit en prenant soin de dissection le long de la cloison. Transfert à l&#39;aire de travail de A à peser, enregistrer le poids et la place dans des tubes Eppendorf de casser le gel dans l&#39;azote liquide. </li><li> Placez suture autour du lobe pulmonaire gauche pour fermer la bronche principale. Disséquer le poumon gauche lobe libre, le placer dans tube Eppendorf et refroidissement rapide dans l&#39;azote liquide, ou le placer dans un puits d&#39;une plaque à 24 puits contenant la solution de Hanks pour l&#39;isolation ultérieure de suspensions de cellules isolées. </li><li> Insérez env. 0,5 ml solution tamponnée de formaldéhyde par la canule trachéale dans les lobes pulmonaires restantes. Après l&#39;inflation, disséquer les lobes pulmonaires sur le thorax et le placer dans tube de 50 ml contenant une solution de formaldéhyde. Pour une conception de l&#39;étude alternative, les poumons peuvent être gonflés à l&#39;optimal la coupe des médias (PTOM, dilué 1:4 avec du PBS) et congelés dans un moule contenant octobre non dilués pour la préparation ultérieure de coupes congelées. Une autre conception de l&#39;étude pourrait nécessiter l&#39;obtention de tissus pulmonaires pression congelés et des suspensions monocellulaires dans les poumons. Dans ce cas, pas d&#39;inflation est nécessaire: disséquer les lobes pulmonaires restantes; les récupérer depuis le thorax et le placer dans la plaque de 24 puits dans un tampon contenant bien Hanks. </li><li> Retirer la canule trachéale, le rincer avec du tampon de Hanks, nettoyer les instruments chirurgicaux. </li></ol> 5. L&#39;analyse des courbes de pression générées à partir du cathéter cardiaque droite Les données enregistrées pression ventriculaire droite sont analysés en utilisant LabChart 7 du logiciel sans aucune connaissance de l&#39;identité du groupe de chaque enregistrement. Plus de 20 courbes sont sélectionnées de manière aléatoire et la différence entre le maximum et le minimum de pression ventriculaire pour chaque courbe de mesure (AP). L&#39;AP moyenne est calculée pour donner le droit de vpression systolique entricular.

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le flux expérimentale décrite ici permet une mesure rapide et simultanée de la pression systolique ventriculaire droite et la récolte d&#39;échantillons pour l&#39;analyse des réponses dans les poumons, le cœur et le système immunitaire chez la souris. La procédure combine des mesures de la physiologie cardiaque, micro-dissection des tissus et la récolte ultérieure pour les études de cellules vivantes, l&#39;analyse histologique ou omiques-analyse des tissus. La procédure complète prend moins de 20 minutes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> 2-méthyl-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-tribromoéthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> savon désinfectant (couverture uniforme tuberculose ainsi Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool éthylique, 200 Proof, absolu, anhydre ACS / USP grade </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Diluer à 70% avec de l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Diluer à un 7-10% formaconcentration ldehyde PBS à une concentration de 1 x PBS en utilisant la solution mère et de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Hanks solution, pas de calcium, de magnésium </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Octobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline (10.000 U / ml) / streptomycine (10.000 mg / ml) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS), pas de calcium, de magnésium aucune des solutions 1x et 10x </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le pentobarbital sodique 26% </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> Les plaques 12, 24, 96 et </td><td> Faucon </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Pipeter transfert </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711 9BM- </td><td></td></tr><tr><td> Tube, EDTA couché </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 0,65 ml et 1,7 ml de micro-centrifugeuse </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polypropylène tubes 12 x 75 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 956-1D </td><td></td></tr><tr><td> Tubes en polypropylène de différentes tailles, </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Forceps, Dumon # 5 Beaux- </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps, extra fine 0,5 mm graefe-conseils courbé </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps, extra fine Graefe-0.5mm conseils droite </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Canule calibre 18, 19 ga </td><td> BD </td><td> Precision Aiguilles Glide </td><td> Couper à la longueur optimale, émoussé et à l&#39;extérieur râpé pour créer une surface rugueuse à l&#39;extérieur </td></tr><tr><td> Ciseaux, ciseaux de dissection fines lames-9cm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Suture pour BAL, une suture de soie tressée, 4-0 </td><td> Outils Fine Science </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Suture de cathétérisme cardiaque droit, suture de soie tressée, 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Amplificateur, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modèle ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Cathéter, la pression F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forceps, ciseaux Vannas printemps-2mm lames </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Loupe éclairante halogène bureau </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Ordinateur portable </td><td> Asus </td><td> Numéro de modèle A52F processeur i5, 15 pouces </td><td></td></tr><tr><td> Source de lumière </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Unité de contrôle de pression </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel, LabChart-Pro V.7 </td><td> Dans ADinstruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

La fonction du cœur droit est de pomper le sang à travers les poumons, reliant ainsi la physiologie du cœur droit et la physiologie vasculaire pulmonaire. L&#39;inflammation est un modificateur de la commune fonctions cardiaques et pulmonaires, par l&#39;élaboration d&#39;une infiltration cellulaire, la production de cytokines et de facteurs de croissance, et en lançant des processus de remodelage 1. Par rapport au niveau du ventricule gauche, le ventricule droit est une pompe à basse pression qui fonctionne dans une zone relativement étroite de variations de pression. L&#39;augmentation des pressions artérielles pulmonaires sont associés à une pression accrue dans le lit vasculaire pulmonaire et l&#39;hypertension pulmonaire 2. L&#39;hypertension artérielle pulmonaire est souvent associée à des maladies pulmonaires inflammatoires, par exemple maladie pulmonaire obstructive chronique, maladies auto-immunes ou 3. Parce que l&#39;hypertension artérielle pulmonaire confère un mauvais pronostic pour la qualité de vie et l&#39;espérance de vie, beaucoup de recherches sont orientées vers la compréhension des mécanismes qui might être la cible de 4 intervention pharmaceutique. Le principal défi pour le développement d&#39;outils de gestion efficaces pour l&#39;hypertension pulmonaire reste la complexité de la compréhension simultanée des changements moléculaires et cellulaires dans le cœur droit, les poumons et le système immunitaire. Ici, nous présentons un workflow procédural pour la mesure rapide et précise des variations de pression dans le cœur droit de la souris et la récolte simultanée des échantillons de cœur, les poumons et les tissus immunitaires. La méthode est basée sur le cathétérisme directe du ventricule droit par la veine jugulaire en gros torse souris, d&#39;abord développé dans les années 1990 comme mesure de substitution de pressions dans l&#39;artère pulmonaire 5-13. L&#39;équipe a organisé approche facilite une technique très rapide cathétérisme cardiaque droit. Cela permet d&#39;effectuer les mesures sur des souris qui respirent spontanément l&#39;air ambiant. L&#39;organisation du flux de travail dans les différents domaines de travail-réduit le délai du temps et ouvre la possibilité d&#39;effectuer simultanément des expériences de physiologie et de la récolte des tissus immunitaire, cardiaques et pulmonaires. Le workflow procédural décrit ici peut être adapté à une grande variété de paramètres de laboratoire et des plans d&#39;étude, des petits, des expériences ciblées, aux grands tests de dépistage de drogue. L&#39;acquisition simultanée de données physiologie cardiaque qui peut être élargi pour inclure l&#39;échocardiographie 5,14-17 et la récolte des tissus cardiaques, pulmonaires et du système immunitaire réduit le nombre d&#39;animaux nécessaires pour obtenir des données qui déplacent la base des connaissances scientifiques vers l&#39;avant. Le workflow procédural présentée ici fournit également une base idéale pour acquérir des connaissances sur les réseaux qui relient immunitaire, pulmonaire et la fonction cardiaque. Les mêmes principes décrits ici peuvent être adaptées pour étudier d&#39;autres organes ou supplémentaires, au besoin.

Le paramètre principal pour obtenir les courbes de pression droite du coeur est obtenue par la position correcte du cathéter cardiaque droite. La forme des courbes de temps de pression est essentielle, car le placement correct de l&#39;intérieur du cathéter du ventricule droit se traduira par des plateaux de pression (figure 4). Courbes pointues, au contraire, indiquent un cathéter qui est déplacé par la respiration ou du rythme cardiaque mouvement contre la paroi du ventricule droit. Pour détec...

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Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Un protocole spécifique et rapide à la fois étudier la fonction cardiaque droite, une inflammation des poumons, et la réponse immunitaire est décrit comme un outil d&#39;apprentissage. Vidéo et chiffres décrivent la physiologie et de techniques de microdissection dans une équipe organisée approche qui est adaptable pour être utilisé pour les petites et grandes études taille.

Mesures systolique ventriculaire droite pression en combinaison avec la récolte du poumon et des échantillons de tissus immunitaires chez des souris

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

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25.0K vues.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Un protocole spécifique et rapide à la fois étudier la fonction cardiaque droite, une inflammation des poumons, et la réponse immunitaire est décrit comme un outil d'apprentissage. Vidéo et chiffres décrivent la physiologie et de techniques de microdissection dans une équipe organisée approche qui est adaptable pour être utilisé pour les petites et grandes études taille.

Vidéo: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sept étapes pour Stellate Cellules

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Recherche

Immunologie et infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Induction de la mère Immune Activation chez la souris à mi-gestation scène avec Viral Mimic Poly (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Application de perturbations de massage cohérentes sur les veaux de souris et surveillance des changements de pression intramusculaire qui en résultent

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

Surveillance de l’activité de l’élastase neutrophile et de la cathepsine G dans les échantillons d’expectorations humaines

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Séparation des sous-populations de cellules immunitaires dans les échantillons de sang périphérique des enfants atteints de mononucléose infectieuse

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.