Ce travail a été soutenu par des subventions de DOE des Grands Lacs Centre de recherche de la bioénergie (DOE BER Bureau de la science-DE-FC02 07ER64494). Nous sommes reconnaissants envers le Dr Xudong Zhang et ses membres du groupe pour des discussions techniques utiles et des commentaires précieux sur la finalisation du protocole.

1. Préparation de l&#39;échantillon et extraction d&#39;acide <ol><li> Lyophilisation des échantillons de sol après collecte sur le terrain. </li><li> Broyer et homogénéiser les échantillons de sol en utilisant un broyeur à boulets, broyeur du sol, ou d&#39;un mortier et un pilon. </li><li> Peser les échantillons de sol (contenant&gt; 0,3 mg N) dans un ballon de 25 ml d&#39;hydrolyse. </li><li> Ajouter 10 ml HCl 6M dans chaque flacon d&#39;hydrolyse, remplissez gaz N 2 dans les flacons, et fermer hermétiquement. </li><li> Hydrolyser à 105 ° C dans un incubateur pendant 8 heures en utilisant une minuterie automatique. </li></ol> 2. Purification de l&#39;échantillon <ol><li> Retirer les flacons de l&#39;incubateur et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;étalon interne myo-inositol (1 mg mL -1 dans l&#39;eau) dans chaque flacon, mélanger en remuant. </li><li> Mettre en place des entonnoirs en plastique se déversant dans 200 ml de poires en forme de flacons avec ST / NS 24/40 articulations, fixées sur des gobelets en plastique pour la stabilité. </li><li> Plier Whatman n ° 2 cercles qualitatives (11 cm de diamètre) en quarts et mis en entonnoirs. </li&gt; <li> Swirl chaque flacon d&#39;hydrolyse, et versez suspension dans l&#39;entonnoir pour filtrer (vous pouvez en outre rincer chaque flacon avec ~ 3 ml d&#39;eau). </li><li> Sécher le filtrat à l&#39;aide d&#39;un évaporateur rotatif à 45 ° C, application de vide. </li><li> Reprendre le résidu séché dans chaque flacon de poire avec 3 ~ 5 ml d&#39;eau (bain à ultrasons utiliser si vous le souhaitez), et verser dans un tube de 40 ml en téflon; rincer le ballon avec une seconde partie aliquote de l&#39;eau. </li><li> Ajuster le pH à 6.6 à 6.8 en utilisant une solution de KOH 1M à des ions métalliques précipiter et d&#39;autres molécules organiques. </li><li> Retirez le précipités par centrifugation à 2000 rcf pendant 10 minutes. </li><li> Verser le surnageant dans un tube de 40 ml en verre, couvrir l&#39;ouverture du tube avec du parafilm, congeler à -20 ° C, puis faire des trous dans le parafilm. </li><li> Lyophiliser le surnageant congelé pour éliminer tout le liquide. </li><li> Dissoudre le résidu avec 3 ml de méthanol sec, vortex soigneusement (utilisez bain à ultrasons si désiré); bouchon du tube, puis centrifuger à 2000 rcf pendant 10 minutes pour réglerles sels. </li><li> Transférer le surnageant dans un flacon de 3 ml de réaction conique; évaporer à sec par la machine RapidVap à 45 ° C (ou sous un léger courant d&#39;azote gazeux sec si désiré). </li><li> Pour chaque flacon, ajouter 100 ul de récupération standard N-méthyl-(1 mg mL -1 dans l&#39;eau) et 1 ml H 2 O, couvrir les bouches du flacon avec du parafilm, les congeler à -20 ° C, perforer le parafilm, puis congeler à sec . </li><li> Faire des normes: ajouter 100 ul d&#39;acide muramique (0,5 mg mL -1 dans le méthanol), 100 pl de la glucosamine (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), 100 pl myo-inositol (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), 100 N-ul méthylglucamine (1 mg mL -1 dans l&#39;eau), et 1 ml H 2 O, parafilm chaque flacon, congeler à -20 ° C, perforer le parafilm, puis congelez-sec. </li></ol> 3. Dérivatisation <ol><li> Préparer le réactif de dérivatisation contenant 32 mg mL -1 de chlorhydrate d&#39;hydroxylamine et 40 mg mL -1 4-diméthylamino-pydans la pyridine pipéridine-méthanol (4:1 en volume / volume). </li><li> Ajouter 300 ul du réactif de dérivatisation à chacun des reactivials, fermer hermétiquement, et le vortex à fond. </li><li> Mettre les flacons dans 75-80 ° C bain-marie pendant 35 minutes (bien scellé les flacons pour éviter toute permettant d&#39;eau d&#39;entrer dans les flacons). </li><li> Retirer les flacons du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;anhydride acétique à chacun des reactivials mL 3, fermer hermétiquement, et le vortex à fond, puis les réchauffer au bain-marie 75-80 ° C pendant 25 minutes. </li><li> Retirer les flacons du bain-marie et laisser refroidir à température ambiante. </li></ol> 4. Séparation et évaluation <ol><li> Ajouter 1,5 ml de dichlorométhane à chaque flacon, le bouchon hermétiquement, et le vortex à fond. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;HCl 1M à chaque flacon, bouchon et vortexer vigoureusement afin de permettre aux solutions de s&#39;asseoir tranquillement jusqu&#39;à ce que les deux phrases distinctes, aspirer et jeter la partie supérieure (aqueuse) à partir de 1000 pipette ul. </li><li> Dans le même fashion, extraire la phase organique 3 fois, mais avec 1 ml de H 2 O (avec la dernière étape de lavage, de prendre un soin particulier à s&#39;assurer que tous les de la phase aqueuse supérieure a été enlevée). </li><li> Séchez la solution finale à l&#39;aide RapidVap à 45 ° C (ou à sec en utilisant de l&#39;azote gazeux si désiré). </li><li> Dissoudre dans 300 uL d&#39;acétate d&#39;éthyle-hexane (1:1 v / v) et le transfert de 2 mL à bouchon à vis d&#39;ambre flacons avec insert un petit volume et fermer hermétiquement. </li><li> Pour la quantification, l&#39;analyse par GC-FID en utilisant une colonne capillaire en silice fondue non polaire: 30 m de long, 0,25 mm de diamètre, épaisseur de film 0,25 um; phase stationnaire 5% phényl-, 95% de méthyl-polysiloxane (DB-5 ou équivalent) avec de l&#39;hydrogène ou de l&#39;hélium comme gaz porteur, à raison de 0,5 ml d&#39;écoulement -1 min constante. La chromatographie est meilleure sur des primes &quot;inertes&quot; phases et de gaz porteur d&#39;hydrogène, mais il est acceptable sur les variétés les plus courantes et à l&#39;hélium. Les paramètres de détection sont de 300 ° C; 400 ml min -1 air et 30 ml min -1 pour la fois l&#39;azote etgaz à effet de maquillage d&#39;hydrogène. L&#39;injection et les paramètres du four sont comme suit: 1 injection directe ul (30:1) avec l&#39;entrée GC fixé à 250 ° C; température initiale du four, à 120 ° C; maintenir 1 min; augmenter la température du four à 10 ° C min. -1 à 250 ° C; maintenir 2,5 min;. rampe à 270 ° C à 20 ° C min -1; tenir 2 minutes; rampe à 290 ° C à 20 ° C min -1, maintenez 5 min. Régler le débit du gaz porteur de telle sorte que l&#39;éluer inositol, la glucosamine et des dérivés d&#39;acide muramique à 250 ° C, et les N-méthylglucamine s&#39;élue à 270 ° C. </li></ol> 5. Validation Derivative <ol><li> Utilisez ionisation douce LC-ESI-TOF-MS pour identifier l&#39;ion moléculaire et de déterminer le poids moléculaire du dérivé. </li><li> Utilisez GC-EI-MS-SIM ou GC-EI-MSMS pour l&#39;amélioration de la sensibilité pour étudier les ions ciblés de la dérivée. </li><li> Utiliser plusieurs réactifs marqués par des isotopes pour la préparation des dérivés, et ensuite utiliser le décalage de massede ces dérivés marqués par des isotopes dans les États membres à enquêter sur l&#39;ion moléculaire et des fragments d&#39;ions. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le protocole de la méthode comprend principalement quatre étapes: la digestion acide, la purification de l&#39;échantillon, et la détermination de dérivatisation GC (Figure 1). Un exemple de l&#39;analyse de la glucosamine et l&#39;acide muramique des stocks standard et à partir d&#39;un échantillon de sol est montré dans la figure 2. Ailleurs glucosamine et l&#39;acide muramique, la mannosamine et la galactosamine (deux isomères de glucosamine) peut également être déterminée simultanément en utilisant le procédé. Sur la base de facteurs de réponse de normes à l&#39;égard de l&#39;étalon interne myo-inositol, nous pouvons quantifier ces biomarqueurs dans des échantillons de sol. La norme de récupération a été utilisé pour surveiller le processus qualitativement dérivatisation. Les régimes pour la formation de l&#39;acétate de l&#39;acide aldononitrile dérivé de glucosamine et de muramique sont présentés dans la figure 3 </strong&gt;. Les structures proposées pour les produits dérivés ont été déterminées par GC-EIMS-SIM pour l&#39;amélioration de la sensibilité, ou d&#39;ionisation douce LC-ESI-TOF-MS 8; les structures proposées des fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons ont été étudiés en comparant les spectres d&#39;ions de l&#39; échantillons préparés avec des incorporations des isotopes différents 11. La figure 4 montre le décalage de masse de l&#39;ion dominante m / z 187 de l&#39;acétate de aldononitrile dérivé de la glucosamine dans trois scénarios, préparés avec des agents non-étiquetés, D-acétique anhydrite, et U -13 ° C-glucosamine. Autres informations et des explications détaillées peuvent être référés à notre récente des publications 8, 11. Cette stratégie pourrait servir de modèle pour étudier la chimie dérivée. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme de mesure du protocole pour l&#39;analyse de la glucosamine et de l&#39;acide dans le sol muramiqueéchantillons. Le protocole contient principalement 4 étapes: la digestion acide, purification, dérivatisation GC et la détermination. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> Figure 2. GC-FID chromatogrammes des acétates aldononitrile de l&#39;inositol, de la glucosamine, l&#39;acide muramique, mannosamine, la galactosamine et méthylglucamine pour les normes et les sols. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> Figure 3. Systèmes pour la formation de l&#39;acétate de l&#39;acide aldononitrile dérivé de la glucosamine et muramique. Le numéro 1 représente la réaction nitrile. Le numéro 2 représente l&#39;acétylation. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> Figure 4. Les spectres de masse d&#39;acétate de aldononitrile dérivé de la glucosamine associée à la structuration d&#39;ions dominantees en mode AE préparé avec (A) des agents non marqués, (B) D-acétique l&#39;anhydrite, (C) en U -13 C-glucosamine. Star représente lourde isotopes atome ou un groupe d&#39;isotopes.

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	<li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil:+a+review.">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li><li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+studying+soil+microbial+diversity.">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li><li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity,+biomass,+and+diversity+in+agricultural+soils.">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li><li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems.">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li><li>Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile,+O-methyloxime,+alditol,+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography.">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li><li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid,+glucosamine,+mannosamine,+and+galactosamine+in+soils.">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li><li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid.">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li><li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+GC/MS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars.">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li><li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization.">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li><li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le présenté GC méthode basée sur l&#39;analyse de l&#39;acétate aldononitrile acide dérivé de la glucosamine et muramique fournit un procédé relativement rapide pour quantifier ces sucres aminés, des extraits du sol. Les dérivés sont chimiquement stables, et peut être déterminée dans une analyse. La méthode n&#39;est pas limitée à des échantillons de sol, et peuvent être simplifiées pour les échantillons de non-matrice du sol. La pompe à vide utilisée dans ce procéd?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> L&#39;acide muramique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-chlorhydrate de glucosamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-méthyl-D-glucamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Le myo-inositol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> Le méthanol (à sec) </td><td> Acros Organics </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-diméthylamino-pyridine </td><td> Acros Organics </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;éthyle </td><td> VWR International </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate Hydroxlamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> Fisher Scientific </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> L&#39;anhydride acétique </td> &lt;td&gt; Fisher Scientific </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Le dichlorométhane (chlorure de méthylène) </td><td> Fisher Scientific </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> Hexane </td><td> Fisher Scientific </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (6M) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> Chlorhydrate d&#39;hydroxylamine -15 N </td><td> Icône de services </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> L&#39;anhydride acétique -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros Organics </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-glucose-U -13 C </td><td> Cambridge isotope de laboratoire </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> D&#39;ammonium sufate -15 N </td><td> Cambridge isotope de laboratoire </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Type </td></tr><tr><td> Rapid-Vap </td&gt; <td> Labconco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacum pompe </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> Flacon hydrolyse </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 423 </td></tr><tr><td> Microtube dérivatisation </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> Agilent </td><td> Un Agilent série 1200 système HPLC couplée à une LC Agilent / MSD-TOF </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

Les approches quantitatives à des micro-organismes qui caractérisent sont cruciales pour une meilleure compréhension de l&#39;état et la fonction microbiennes dans les écosystèmes. Les stratégies actuelles de l&#39;analyse microbienne comprennent à la fois traditionnels de laboratoire de la culture-dépendantes techniques et celles qui sont basées sur l&#39;extraction directe et la détermination de certains biomarqueurs 1, 2. Peu d&#39;entre la diversité des espèces microbiennes qui habitent le sol peuvent être cultivées, afin de la culture-dépendantes des méthodes introduire des biais importants, une limitation absente dans l&#39;analyse des biomarqueurs. L&#39;acide glucosamine, la mannosamine, la galactosamine et muramique ont été bien servis que les mesures à la fois de la vie et de la masse microbienne morts, de ces acides de la glucosamine (le plus abondant) et muramique (uniquement à partir de la cellule bactérienne) sont des constituants les plus importants dans les systèmes sol 3 , 4. Cependant, le manque de connaissances sur l&#39;analyse limite la vulgarisation large entre pairs scientifiques. Parmi tous les exipiquer les méthodes d&#39;analyse, de dérivatisation à aldononitrile acétates suivie par GC-analyse basée sur a émergé comme une bonne option par rapport à l&#39;équilibre de façon optimale la précision, la sensibilité, la simplicité, une bonne séparation chromatographique, et la stabilité sur 5 stockage de l&#39;échantillon. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour une analyse fiable et relativement simple de la glucosamine et l&#39;acide muramique à partir du sol après leur conversion à acétates aldononitrile. Le protocole comprend principalement quatre étapes: la digestion acide, la purification de l&#39;échantillon, et la détermination de dérivatisation GC. La procédure étape par étape est modifiée conformément à l&#39;ancien publications 6, 7. En outre, nous présentons une stratégie visant à valider la structure de l&#39;ion moléculaire du dérivé et ses fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons. Nous avons appliqué GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS et réactifs marqués par des isotopes pour déterminer le poids moléculaire de l&#39;acétate aldononitrile dérivé de glucosamine et de muracide amique; nous avons utilisé le changement de masse de l&#39;isotope-étiquetés dérivés dans le spectre des ions d&#39;enquêter sur des fragments d&#39;ions de chaque dérivés 8. En plus de l&#39;élucidation théorique, la validation de l&#39;ion moléculaire du dérivé et ses fragments d&#39;ions sera utile aux chercheurs qui utilisent δ 13 C ou des fragments d&#39;ions de ces biomarqueurs dans les études biogéochimiques 9, 10.

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GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Nous décrivons un protocole de la méthode pour l&#39;analyse par GC-base des dérivés de l&#39;acétate de aldonitrile glucosamine et d&#39;acide muramique extrait du sol. Pour élucider le mécanisme chimique, nous présentons également une stratégie visant à confirmer la structure de l&#39;instrument dérivé et les fragments d&#39;ions formés sur l&#39;ionisation d&#39;électrons.

GC basé sur la détection de l&#39;acétate de Aldononitrile acide dérivé de glucosamine et de muramique pour la détermination des résidus microbienne dans le sol

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vues.  University of Wisconsin, Madison. Nous décrivons un protocole de la méthode pour l'analyse par GC-base des dérivés de l'acétate de aldonitrile glucosamine et d'acide muramique extrait du sol. Pour élucider le mécanisme chimique, nous présentons également une stratégie visant à confirmer la structure de l'instrument dérivé et les fragments d'ions formés sur l'ionisation d'électrons.

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Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Les communautés microbiennes dans la Nature et de laboratoire - Interview

Recherche

Biologie

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Détection directe de l&#39;activité Acétate de formation de l&#39;acétate kinase Enzyme

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to degrade plastics. Typically, when formulations of plastics are known and a source of the feedstock is available, powdered plastic can be suspended in agar-based media and degradation determined by visualization of clearing zones. However, this approach poorly mimics in situ degradation of BDMs. First, BDMs are not dispersed as small particles throughout the soil matrix. Secondly, BDMs are not sold commercially as pure polymers, but rather as films containing additives (e.g. fillers, plasticizers and dyes) that may affect microbial growth. The procedures described herein were used for isolates acquired from soil-buried mulch films. Fungal isolates acquired from excavated BDMs were tested individually for growth on pieces of new, disinfested BDMs laid atop defined medium containing no carbon source except agar. Isolates that grew on BDMs were further tested in liquid medium where BDMs were the sole added carbon source. After approximately ten weeks, fungal colonization and BDM degradation were assessed by scanning electron microscopy. Isolates were identified via analysis of ribosomal RNA gene sequences. This report describes methods for fungal isolation, but bacteria also were isolated using these methods by substituting media appropriate for bacteria. Our methodology should prove useful for studies investigating breakdown of intact plastic films or products for which plastic feedstocks are either unknown or not available. However our approach does not provide a quantitative method for comparing rates of BDM degradation.

Plastic films labeled "biodegradable" are commercially available for agricultural use as mulches. Tillage represents an attractive disposal method, but degradation under field conditions is poorly understood. The purpose of this study was to develop methods for isolating native soil fungi and bacteria that colonize plastic mulch films after field burial.

Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l&#39;agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing pour l&#39;identification microbienne et Caractérisation

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Un test de concurrence plaque comme une rapide évaluation préliminaire de la Suppression de la maladie

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.