Les biosurfactants sont les molécules tensio-actives empathiques produites par des micro-organismes qui ont la capacité de réduire la tension superficielle du liquide et la tension interficiaire entre deux phases différentes. La nature empathique de ces molécules leur permet de s’aligner à l’interface entre deux phases différentes, et d’améliorer la solubilisation d’une phase dans une autre. Les biosurfactants ont gagné beaucoup d’attention par rapport à leurs homologues chimiques en raison des divers avantages qu’ils offrent.
Il s’agit notamment d’une plus grande spécificité, d’une toxicité plus faible, d’une plus grande diversité structurelle, d’une facilité de préparation, d’une biodégradabilité plus élevée, de leur plus grande compatibilité environnementale et de leur activité dans des conditions environnementales extrêmes. Dans cette vidéo, nous démontrons les méthodes impliquées dans le criblage, la caractérisation et les biosurfactants applicatifs, produits par différentes souches de rodococcus, lysinibacillus et paenibacillus. Nous illustrons également les méthodes d’évaluation de l’application d’une combinaison de biosurfactants, produite par ces trois souches microbiennes dans la récupération de l’huile résiduelle par une technique de colonne de sable.
Les travaux ont été réalisés sous la direction du Dr Preeti Srivastava et du Dr Manoj Kumar. Pour la croissance des microbes, inoculez les flacons contenant cent millilitres de bouillon Luria autoclavé, en ajoutant un millilitre de culture de graines cultivée pendant la nuit à la fiole à l’intérieur de l’armoire à flux d’air laminaire. Incuber les flacons dans un incubateur rotatif à 30 degrés Celsius et 180 tr / min pendant sept jours.
Une fois la période d’incubation terminée, récoltez les flacons et transférez le bouillon de culture dans les tubes de centrifugeuse. Centrifuger la culture à 4 500 G pendant 20 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius. Versez doucement le surnageant sans cellules dans un bécher frais et utilisez-le dans des tests de criblage pour la production de biosurfactants.
Pour filtrer la production de biosurfactant par un test d’effondrement de goutte, prenez une lame de verre propre et recouvrez la surface de la lame de 200 microlitres d’huile. Maintenant, ajoutez 20 microlitres de surnageant sans cellule au centre de l’huile et laissez-la intacte pendant deux à trois minutes. Si la goutte s’effondre, notez le surnageant positif pour la présence de biosurfactant.
Dans le dosage d’épandage d’huile, prenez 20 millilitres d’eau distillée double dans une plaque de Petri et ajoutez 200 microlitres de pétrole brut à la surface de l’eau. Maintenant, ajoutez 20 microlitres de surnageant sans cellule au centre de l’huile et laissez-la intacte pendant une minute. Si une zone de défrichement est formée à la suite d’un déplacement d’huile, notez le surnageant positif pour la présence de biosurfactant.
Dans le test de l’indice d’émulsion, ajoutez quatre millilitres d’essence et de surnageant sans cellule chacun dans un tube de verre propre. Ensuite, ce que le mélange vigoureusement pendant trois minutes et laissez-le intact pendant les prochaines 24 heures. Pour mesurer la tension superficielle du surnageant sans cellule, nettoyez le récipient en verre avec le liquide dont la tension superficielle doit être déterminée.
Ajouter le liquide dans le récipient et monter le récipient sur le porte-récipient. Déverrouillez le support de la sonde et montez la sonde dessus. À l’aide du contrôleur manuel, ajustez la hauteur de la plate-forme, de sorte que la sonde soit à deux à trois millimètres de la surface du liquide.
Ensuite, allez dans les logiciels et suivez les étapes mentionnées dans le document pour mesurer la tension superficielle. Une fois la mesure terminée, abaissez la hauteur de la plate-forme et déverrouillez et démontez la sonde et le navire de l’instrument. Pour l’extraction du biosurfactant, ajuster le pH du surnageant sans cellule à deux, en utilisant deux acides chlorhydriques normaux.
Conservez le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajouter un volume égal de mélange de méthanol chloroforme et mélanger vigoureusement pendant 20 minutes. Laissez le mélange intact pour qu’une séparation libre se produise.
Retirer la face supérieure, contenant de l’eau et du méthanol, et laisser la face inférieure contenant du biosurfactant s’évaporer dans une hotte. Après évaporation de la phase organique, redissoudre le biosurfactant de couleur miel dans trois millilitres de chloroforme et utiliser ce mélange pour la caractérisation et l’identification du biosurfactant. Pour la caractérisation chromatographique du biosurfactant extrait, repérez 20 microlitres de biosurfactant sur des plaques TLC.
Après séchage des plaques, placez la plaque TLC à l’intérieur de la chambre saturée de mélange de chloroforme méthanol et faites fonctionner la TLC. Pour la détection des lipides, ajoutez quelques granules d’iode dans la chambre fraîche et saturez la chambre pendant cinq à 10 minutes. Placez le TLC à l’intérieur de la chambre et observez le développement de taches jaunes.
Pour la détection des protéines et des glucides, vaporisez la plaque TLC avec du non-hydrogène ou de l’anisaldéhyde, et chauffez à 110 degrés Celsius et observez le développement de la couleur. Pour l’analyse RMN, insérez le tube dans la clé. Ajustez la hauteur du tube à l’aide du tube ajusté.
Placez le tube RMN, ainsi que la clé dans une machine MR et suivez les étapes mentionnées dans le document pour obtenir un spectre RMN. Pour une expérience de récupération assistée de l’huile, prenez une colonne de verre et scellez la sortie inférieure avec de la laine de verre et des perles de verre. Soutenez la colonne avec du sol sablonneux de manière à ce qu’un peu de liquide puisse être ajouté au sommet du sol.
Montez la colonne sur le support et ajoutez des perles de verre sur le sol. Inonder la colonne avec 50 millilitres de solution de saumure et recueillir le débit pour déterminer le faible volume. Retirez la saumure de la colonne en forçant le pétrole brut à la traverser.
Recueillir le volume de saumure et d’huile sortant de la colonne pour déterminer le volume initial de saturation en huile. Après 24 heures, inonder la colonne avec 10 faibles volumes de saumure et recueillir l’huile sortant de la colonne pour estimer la récupération secondaire du pétrole. L’huile laissée dans la colonne après récupération secondaire de l’huile correspond à l’huile résiduelle.
Préparez maintenant un mélange de biosurfactants en ajoutant le biosurfactant extrait à un bécher en verre. Et ajoutez le biosurfactant et le mélange à la colonne et laissez-le intact pendant les prochaines 24 heures. Après 24 heures, mesurez la quantité d’huile et d’eau qui a fait allusion hors de la colonne pour déterminer une récupération supplémentaire ou améliorée du pétrole.
Les surnageants sans cellules des trois souches microbiennes ont obtenu une note positive pour la présence de biosurfactant, car ils ont entraîné l’effondrement des gouttes, la propagation de l’huile et la formation d’émulsion. La confirmation de la production de biosurfactant a été fournie par la mesure de la tension superficielle du bouillon sans cellules. En raison de la croissance du rhodococcus et des lysinibacilles, la tension superficielle du milieu a diminué de 59 à 45 mN par mètre.
En raison de la croissance des paenibacillus, la tension superficielle du milieu a diminué de 59 à 28,4 mN par mètre. Les tests de stabilité en émulsion ont montré que les biosurfactants produits par les trois souches microbiennes présentaient une grande stabilité dans des conditions diverses et environnementales. Les indices d’émulsion n’ont montré aucun changement significatif lorsque la température d’incubation, le pH et la concentration en sel du bouillon sans cellules ont été modifiés.
La caractérisation DLC du biosurfactant extrait a montré que les biosurfactants produits par les trois souches étaient glycolipés. L’identification chimique des biosurfactants a montré que le rodocoque et le lysinbacille produisaient le même biosurfactant, qui a été identifié comme rhamnolipide, avec une masse d’environ quatre 80 daltons. Paenibaccilus d’autre part, produit un rhamnolipide contenant trois chaînes lipidiques d’une masse d’environ 802 daltons.
La combinaison de biosurfactants a permis de récupérer 56,5 % du pétrole résiduel de la colonne de sable. La production de biosurfactants à partir des souches de rodococcus, de lsyinibaccilus et de paenibacillus a été analysée et les souches ont obtenu une note positive pour la production de biosurfactant. Les biosurfactants produits ont été caractérisés et identifiés comme des rhamnolipides.
Étant donné que la combinaison de biosurfactants a permis de récupérer 56% de l’huile résiduelle dans une technique de pack de sable, la combinaison de biosurfactant peut être utilisée dans des applications sur le terrain pour récupérer l’huile résiduelle piégée à l’intérieur des réservoirs de pétrole.
