Ce travail a été soutenu par une subvention du NHLBI pour RW.

1. Configuration Power Tower et le fonctionnement <ol><li> Le Power Tower est placé sur un morceau rectangulaire de contreplaqué qui est serré à une table. A 4,5 vitesse rpm moteur de Grainger repose sur le dessus de quatre 2 &quot;x6&quot; conseils d&#39;administration et du conseil d&#39;administration contreplaqué une ¾ de pouce. Le moteur, une commande de vitesse AC / DC, un fusible, et une interrupteur marche / arrêt sont connectés ensemble dans une zone de jonction. </li><li> Pour refroidir le moteur, un 3 trous pouces de diamètre est découpée en une pièce verticale de ½ pouce de contreplaqué. Sur un côté, un ventilateur à 3 pouces est fixée à la contre-plaqué, et d&#39;autre part, un cylindre de 3 pouces diamètre métallique est attachée. </li><li> Un bras de rotation sur mesure avec un rouleau monté sur l&#39;extrémité est reliée au moteur. Le moteur et le bras joint tourner dans un sens horaire, poussant vers le bas d&#39;un côté d&#39;un stock courbée ¾ de pouce tube carré qui est attaché à l&#39;contreplaqué avec une charnière de porte. Une roue est fixée à la face supérieure de la réserve de tube sous la plateforme pour lui permettre de rouler contre la plate-forme qui est directement dessus. </li><li> Le bras pousse vers le bas sur une extrémité de la réserve de tube et soulève l&#39;extrémité opposée, portant une plate-forme à deux niveaux (figure 1D). Lorsque le rouleau sur le bras efface le stock de tube, il permet au bras de retourner à la position de départ, passant de la plate-forme vers le bas (figure 1E). </li><li> Les plates-formes se composent de supports qui sont placés sur le dessus de contre-plaqué et fixé par sandows qui sont accrochées sur les yeux vis. Les plates-formes glisser vers le haut et vers le bas le long curseurs tiroirs qui sont attachés à la contre-plaqué avec entre parenthèses. </li><li> Les flacons sont placés dans les racks et sécurisé par un écran grille carrée qui est maintenu en place par des cordons élastiques. </li><li> Un coussin en styromousse est placé en dessous la plate-forme pour amortir le choc de la chute. </li><li> La puissance du moteur est ajustée de telle sorte qu&#39;une période complète de rotation est de 15 secondes. </li></ol> 2. Exercice protocole <ol><li> Mouches sont logés dans un incubateur à 25 ° C avec une humidité de 50% et une lumière de 12 heures / dacycle de rk. L&#39;entraînement physique et sur l&#39;évaluation de la capacité d&#39;exercice sont menées dans un 25 ° C de température ambiante contrôlée. </li><li> Les mouches sont collectées et appariés pour l&#39;âge dans les 1-2 jours les uns des autres. Un minimum de 240 mouches est nécessaire pour le suivi longitudinal des géotaxie endurance et négatifs (escalade) capacité, deux indicateurs physiologiques qui reflètent les effets de l&#39;entraînement physique. Suivi longitudinal permet d&#39;isoler le changement induit par rapport aux valeurs de départ pour chaque cohorte, sans effets confondants de la variation entre les cohortes. Les mouches pour des expériences supplémentaires devraient être collectées selon les besoins. </li><li> Après la collecte, les mouches sont divisées en 120 mouches expérimentales, qui seront soumis au régime d&#39;exercice, et 120 mouches de contrôle, qui ne seront pas exercés. Les mouches sont stockés dans des flacons de 20 vole chacun. Les flacons de mouches expérimentales sont bouchés avec Flugs fermes d&#39;acétate de cellulose et les flacons de contrôle (non exercé) les mouches sont bouchés avec de doux spobouchons ESN, qui peuvent être poussés vers le bas pour immobiliser les mouches tandis que sur la Power Tower. Sponge est utilisé pour l&#39;immobilisation parce que sa taille adaptative permet un positionnement facile à proximité du fond du flacon. Le matériau plus souple éponge réduit également les dommages causés par les Flugs plus solides. </li><li> Des mouches sur la Power Tower sont stockés dans des flacons et exercé qui contiennent 5 ml de nourriture, ce qui leur procure un atterrissage plus en douceur que les mouches qui sont exercées dans des flacons vides. La nourriture est généralement composé de saccharose à 10%, 10% de levure, et de l&#39;agar 2% dans de l&#39;eau, même si nous n&#39;observons pas les mouches à manger souvent au cours d&#39;une session de formation. Si les flacons vides sont utilisés pendant la formation, le pourcentage de mouches qui subissent des blessures est augmenté de façon spectaculaire. </li><li> Le Power Tower est exploité dans une pièce à température contrôlée qui est maintenue à 25 ° C. Mouches expérimentales sont placés sur la Power Tower et fait monter. Mouches de contrôle sont également mis sur le Power Tower, mais le bouchon éponge est pushed vers le bas dans le flacon d&#39;environ 3 mm au-dessus des mouches afin de limiter le mouvement. Ce groupe sert de témoin pour tous les effets de la Power Tower qui sont sans rapport avec l&#39;exercice. Bien que peu de place existe encore pour ces mouches de manœuvre, nous avons observé à plusieurs reprises que les mouches dans ces conditions de fonctionner très peu et ne démontrent pas une réponse physiologique à l&#39;exercice. Il peut également être souhaitable d&#39;inclure un groupe témoin qui n&#39;est pas placée sur la Power Tower à tous. </li><li> Les mouches sont exercées cinq jours consécutifs chaque semaine, en utilisant un calendrier rampe (figure 2). Pendant une semaine les mouches sont exercés pendant 2 heures par session, pendant deux semaines, pendant 2,5 heures par session, et de trois semaines pendant 3 heures par session. Bien que d&#39;autres traitements ont été testés, ce protocole donne des résultats cohérents à travers les génotypes et dans des conditions divergentes. Ce protocole est, cependant, l&#39;objet d&#39;un large éventail de variations possibles qui pourraient convenir à une expérience particulière. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. L&#39;exercice et la fatigue locomotrice <ol><li> Temps à la fatigue au cours de l&#39;exercice d&#39;endurance est un indicateur utile pour confirmer physiologique et / ou quantifier la capacité d&#39;exercice d&#39;une cohorte donnée. Dosages de fatigue peut être effectuée longitudinalement sur des cohortes qui seront utilisés dans des expériences de formation. Dosages peut être effectuée soit avant la formation, après l&#39;achèvement du protocole de formation, ou les deux. Autres points dans le temps intermédiaires peuvent être ajoutés si la cartographie des progrès graduels au cours de formation est souhaitée. Le test de fatigue peut aussi être utilisé pour mesurer l&#39;endurance physique comme une réponse à d&#39;autres traitements que le protocole de formation, tels que l&#39;altération alimentation (figure 3B). </li><li> Dosages de la fatigue devrait être menée sur un jour où la formation ne se déroule pas. Mouches à la fois le laboratoire et le contrôle sont placés sur la Power Tower dans des flacons de 20 chacun et fait monter jusqu&#39;à la fatigue. La fatigue est reconnue comme l&#39;absence de réponse à un stimulus négatif avec l&#39;escalade géotaxie êtreportement. Comportement à la fatigue est marqué par l&#39;observation visuelle. </li><li> Un flacon de mouches est considéré comme «fatigué» lorsque 5 ou moins les mouches sont capables de monter plus haut que 2 pouces pour les quatre baisses consécutives. Flacons fatigués sont retirés de la Power Tower alors qu&#39;il est encore en activité, et le moment de l&#39;enlèvement est enregistrée. Temps de retrait peuvent être tracées sous forme d&#39;histogramme imbriqué, ou comme un &quot;time-to-échec&quot; complot. Un exemple de données les plus récentes en tant que &quot;time-to-échec&quot; complot est montré dans la figure 3B. </li><li> Les flacons sont surveillés à intervalles de 10 minutes pour un maximum de 10 heures (figure 3B). </li></ol> 4. Capacité d&#39;exercice, l&#39;âge et locomotrice <ol><li> Depuis ce protocole de formation repose sur un comportement en cours d&#39;exécution induite, un premier dosage pour la quantification de effets de la formation est de mesurer le changement longitudinalement en moyenne la vitesse de course pendant l&#39;entraînement. Au cours de la formation, 120-mouche cohortes de mouches exercés et non levées sont testés quotidiennement pour leur réponse à un impact négatif géotaxie stimulus. La technique de l&#39;anneau décrit dans Gargano et al. (2005) est utilisé pour mesurer la capacité des mouches d&#39;escalade 12. Brièvement, cette technique mesure hauteur moyenne est monté par un flacon de mouches pendant un temps défini après l&#39;induction de géotaxie négative. La hauteur est monté pendant un temps défini est équivalente à la vitesse d&#39;escalade. Les mesures sont effectuées avant de placer les mouches sur la machine pour un entraînement quotidien afin d&#39;éviter les complications de la fatigue après l&#39;exécution de la journée. </li><li> Dans notre protocole standard, les mouches sont exercés pour un total de trois semaines et la capacité d&#39;escalade est examiné pour un total de cinq semaines: trois semaines au cours de l&#39;exercice de formation et deux semaines après l&#39;arrêt de l&#39;exercice (figure 2). Cela permet à l&#39;expérimentateur de tracer si les effets de l&#39;exercice sur la mobilité persistent après l&#39;arrêt du programme. </li><li> Quatre photographies de la performance de chaque cohorte RING quotidienne sont utilisés pour l&#39;analyse de l&#39;escalade capacité. Six flacons sont inclus dans chaque photographie. Négatif geotaxis est induite, et en utilisant une caméra à calage, une photographie est prise après un nombre défini de secondes. Nous utilisons généralement deux secondes, même si cela peut varier en fonction des conditions expérimentales. Pour chaque photographie, chaque flacon est divisé en quatre quadrants de hauteur égale, et le logiciel de traitement d&#39;image est utilisé pour attribuer à chaque volée un score basé sur le quadrant il a atteint dans le délai imparti. Les mouches qui grimpent dans le quadrant le plus élevé reçoivent un score de 4, vole dans le quadrant le plus élevé suivant recevoir un 3, vole dans le quadrant deuxième rang recevront un 2, et les mouches dans le quadrant recevoir un plus bas 1. Les mouches qui ne sont pas grimper hors du fond du tout sont donné un score de 0. </li><li> Pour chaque flacon dans une photographie donnée, un «indice de l&#39;escalade&quot; est généré par la moyenne des notes de toutes les mouches dans ce flacon. Chaque fiole de indices des quatre photographies sont ensuite la moyenne pour donner un indice de l&#39;escalade finale pour ce jour-là. </li><li> Toutes les expériences sont menées géotaxie négative longitudinalesdinally. Les résultats sont normalisés à l&#39;initiale de &quot;pré-exercice&quot; score dans le but de réduire l&#39;effet de la variation de cohorte dans l&#39;escalade et la capacité de mettre en évidence la variation relative de la capacité d&#39;escalade longitudinale d&#39;une cohorte à la suite de l&#39;entraînement physique. Le score initial est déterminé par la moyenne des indices des trois premiers jours de l&#39;escalade et se voit attribuer une valeur de 1. Des essais ultérieurs sont ensuite exprimés en pourcentage de l&#39;indice initial. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Wild-mouches de type répondent à un protocole d&#39;endurance avec une diminution liée à l&#39;âge diminution de la capacité d&#39;escalade qui persiste après la fin de la formation, comme en témoignent des essais RING longitudinales sur les cinq semaines d&#39;âge (figure 3A). Cette baisse retard dans géotaxie négative est une réponse standard phénotypique qui peut servir de contrôle positif afin d&#39;assurer que la réponse de l&#39;exercice de type sauvage qui se passe normalement. Cet ensemble de données est présenté comme un exemple de la façon dont lel&#39;induction de l&#39;exercice par le programme Power Tower peut être utilisé comme une entrée de comportement. La capacité des différents facteurs génétiques ou environnementaux pour moduler cet effet peut alors être évaluée. A l&#39;inverse, la Power Tower peut également être utilisé comme une sortie dans divers modèles expérimentaux. Par exemple, le génotype, le régime alimentaire, ou d&#39;autres conditions peuvent être modifiées. Ensuite, l&#39;effet de ces variations sur physiologie de l&#39;exercice peut être testée à l&#39;aide de la Power Tower. Ici, nous montrons un exemple de cette approche. Lorsque vole avec un pourcentage variant de saccharose dans leur alimentation ont été testés pour le temps de la fatigue, augmentation de la teneur en saccharose en corrélation avec la capacité d&#39;endurance accrue (figure 3B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> Figure 1. Le fonctionnement de la Power Tower. (AC) Le bras plié avec le rouleau motorisé joint tourne en sens horaire jusqu&#39;à ce qu&#39;il entre en contact avec le tube coudé carré. (D, E) Lebras pousse vers le bas sur le tube coudé carré, ce qui provoque la plate-forme qui est chargé de flacons de mouches à lever. (F) Comme le bras efface le tube de la plate-forme est autorisé à se replier vers le bas, forçant les mouches pour revenir à la partie inférieure de la flacon. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> Figure 2. Suggérée Protocole exercice. Mouches soumis au protocole de formation sont faits pour exercer pendant cinq jours par semaine en vertu d&#39;un régime de trois semaines rampe longue qui augmente progressivement la durée de l&#39;exercice des 2 premières heures de 30 minutes chaque semaine. Les analyses standard comprennent des essais de fatigue avant et après le programme d&#39;exercices et des tests de la semaine 1 RING jusqu&#39;à la semaine 5. Tous les tests sont effectués en double exemplaire sur un nombre égal de mouches non levées comme un contrôle négatif. Autres divers tests physiologiques ou biochimiques peuvent être effectuées tel que déterminé par le chercheur. <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Les exercices d&#39;endurance modifie les multiples aspects de la mobilité. (A) des dosages effectués RING longitudinalement à travers les âges dans une seule paire de mâles Y 1 W 67C23 cohortes. Appariés pour l&#39;âge, génétiquement identiques et les mouches de contrôle exercé non exercées ont été mesurées quotidiennement pour la vitesse moyenne de l&#39;escalade. Les résultats sont exprimés en termes d&#39;un indice d&#39;escalade qui est normalisée à la taille moyenne d&#39;escalade dans les trois premiers jours de mesure. Exercice formés mouches affiché une diminution liée à l&#39;âge diminution de la capacité géotaxie négative par rapport à appariés pour l&#39;âge frères et sœurs non exercées à travers les âges (2-way ANOVA, p &lt;0,005). (B) des essais de fatigue menée pendant 8 heures sur appariés pour l&#39;âge des mouches femelles Canton S montrent un effet significatif de la teneur en saccharose alimentaire sur le temps de la fatigue (log-rank, p &lt;0,0001). Avant d&#39;expérimenter, les mouches ont été nourris avec un régime de levure / saccharose / agar-agar, avec un poids de 10% / volume ouiconcentration er, et un pourcentage variant de saccharose alimentaire. Cinq flacons de 20 mouches chacune ont été testés pour chaque régime. Graphique affiche le nombre de flacons ont encore cinq ou plus des mouches en cours d&#39;exécution à un moment donné. Ces résultats peuvent être traitées statistiquement et graphiquement comme une survivance (ou le temps à l&#39;échec) la courbe, avec «échec» pour un flacon étant défini comme un point dans le temps où moins de cinq mouches continuent de répondre à un stimulus géotaxie négative. Notez que de nombreux autres modèles d&#39;étude possibles et les traitements statistiques sont possibles, et le traitement des données et de mesure doivent être adaptés à des fins individuelles.

<ol>
	<li>Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Prevalence+of+Diabetes:+Estimates+for+the+year+2000+and+projections+for+2030.">Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030.</a> Diabetes Care. 25, 1047-1053 (2004).</li><li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Ogden, L. C., Johnson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+Trends+in+Obesity+Among+US+Adults.">Prevalence and Trends in Obesity Among US Adults.</a> JAMA. 288, 1723-1727 (1999).</li><li>Hubert, H. B., Feinleib, M., McNamar, P. M., Castelli, W. 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W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

Je n&#39;ai rien à communiquer.

Le protocole général présenté ici a réussi à documenter les effets physiologiques qui suivent une formation. Toutefois, plusieurs domaines de ce protocole sont sujettes à modification en fonction des besoins particuliers expérimentales. Par exemple, la durée de la formation et le nombre de combats pourrait être modifiée pour rendre le programme plus ou moins difficile, comme vous le souhaitez. La hauteur du conteneur dans lequel la capacité est mesurée géotaxie négative pourrait être modifiée pour augmenter la surface disponible pour l&#39;amélioration doit être documenté. Diverses méthodes d&#39;automatisation de la quantification de la vitesse de montée peut également être applicable. En principe, n&#39;importe quel logiciel capable de distinguer une mouche de fond peut être utilisée pour accélérer le processus de collecte des données. Certains aspects du protocole devrait être modifiée qu&#39;avec une grande prudence, cependant. Par exemple, des expériences préliminaires indiquent fortement que au moins un jour de repos par semaine tend à favoriser une plus grande imprOUVEMENT que l&#39;exercice quotidien implacable. En outre, les rythmes circadiens de la température et sont connus pour affecter la circulation des animaux à sang froid. Le moment de la journée que la formation a lieu peut être modifiée, mais doit toujours être conforme au sein de groupes particuliers en vertu de comparaison, afin d&#39;éviter la possibilité d&#39;effets confondants des rythmes circadiens. Contrôle de la température est également essentiel, et nous recommandons une salle dédiée à la température constante à l&#39;équipement d&#39;exercice maison. Enfin, les mâles et les femelles doivent être élevés et mesurées séparément, afin d&#39;éviter le risque d&#39;effets confondants de différences de fécondité et le sexe dans la capacité d&#39;exercice. Les applications potentielles de cette méthodologie sont limitées que par l&#39;imagination du chercheur. Dans un travail préliminaire, nous avons utilisé cette méthodologie en trois applications principales: <ol><li> Pour mesurer l&#39;effet de l&#39;exercice d&#39;endurance sur différents aspects de la biologie de type sauvage à travers les âges. </li><li> To mesurer l&#39;effet de l&#39;exercice d&#39;endurance sur certains phénotypes mutants. </li><li> Pour dépister les facteurs génétiques qui sont nécessaires pour exécuter les bienfaits de l&#39;exercice </li></ol> Chacune de ces applications englobe un large éventail de possibilités spécifiques. Basé sur notre expérience préliminaire, phénotypes mutants ont tendance à varier avec le niveau d&#39;exercice autant qu&#39;ils varient avec le régime. L&#39;utilisation de modèles d&#39;invertébrés afin de mieux comprendre la relation entre l&#39;alimentation, l&#39;exercice, et de la physiologie du vieillissement est peut-être l&#39;application générale la plus importante de ce protocole.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Dayton Motoréducteur </td><td> Grainger </td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco Boîte électrique </td><td> Grainger </td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Raco de couverture </td><td> Grainger </td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Fusible </td><td> Grainger </td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td> Titulaire Cooper Bussmann Fusible </td><td> Grainger </td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td> Carling Technologies Commutateur </td><td> Grainger </td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td> Dayton contrôle, AC / DC Vitesse </td><td> Grainger </td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Flugs pour Narrow flacons en plastique </td><td> Genesee scientifique </td><td> 49-102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

Un des problèmes les plus urgents auxquels est confrontée modernes chercheurs en médecine est la flambée des niveaux d&#39;obésité, avec l&#39;augmentation conséquente de troubles associés tels que le diabète et les maladies cardiovasculaires 1-3. Un sujet important de la recherche sur ces problèmes de santé associés implique le rôle de l&#39;exercice d&#39;endurance comme une intervention bénéfique. L&#39;entraînement physique est un moyen peu coûteux et non invasif d&#39;intervention avec plusieurs résultats bénéfiques, y compris la réduction de l&#39;excès de graisse dans le corps 4, une sensibilité accrue d&#39;insuline dans le muscle squelettique 5, augmenté des réponses anti-inflammatoires et anti-oxydante 6, et l&#39;amélioration de la capacité contractile dans les cardiomyocytes 7. Exercices de faible intensité est connue pour augmenter l&#39;activité mitochondriale et la biogenèse chez les humains et les souris 8, avec la transcription coactivateur PGC1-α comme un intermédiaire important 9,10. Despite l&#39;importance de l&#39;exercice comme un outil pour lutter contre plusieurs importantes maladies liées au vieillissement, de vastes études longitudinales génétiques ont été entravés par l&#39;absence d&#39;un protocole de formation d&#39;endurance pour une espèce à vie courte du modèle génétiques. La variété des outils génétiques disponibles pour une utilisation avec la drosophile, conjointement avec son entretien durée de vie et peu coûteux à court, en font un modèle attractif pour une étude plus approfondie de ces mécanismes génétiques. C&#39;est dans cet esprit que nous avons développé un nouvel appareil, connu sous le nom Power Tower, à grande échelle par l&#39;exercice de formation chez Drosophila melanogaster 11. Le Power Tower utilise le comportement des mouches instinctive géotaxie négative de façon répétitive induire rapide ascension. Chaque fois que les ascenseurs de la machine, puis descend, la plate-forme de mouches, les mouches sont amenés à monter. Les mouches continuent de répondre tant que la machine est en fonctionnement ou jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent trop fatigué pour répondre. Ainsi, le chercheur peut utiliser cette machine pour fournir sla formation imultaneous à un grand nombre de mouches appariés pour l&#39;âge et génétiquement identiques. En outre, nous décrivons des tests associés utiles pour suivre les progrès longitudinal de cohortes de mouches pendant la formation.

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Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Nous décrivons le protocole première formation d&#39;endurance pour une espèce importante du modèle génétiques,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Et de définir plusieurs tests pour tracer des améliorations en matière de formation suivant la mobilité.

Protocole entraînement d&#39;endurance et de performance Tests longitudinales pour Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K vues.  University of Michigan Medical School. Nous décrivons le protocole première formation d'endurance pour une espèce importante du modèle génétiques, Drosophila melanogaster, Et de définir plusieurs tests pour tracer des améliorations en matière de formation suivant la mobilité.

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High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

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Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.