Ce protocole a été développé par notre travail au sein et en collaboration avec les laboratoires de Paul Martin et Antonio Jacinto. Nous remercions le Centre Stock Bloomington pour son excellent service et la communauté drosophile de continuer à partager les lignes voler. BS est actuellement financé par une subvention du BBSRC projet. WW est financé par une bourse du Wellcome Trust en développement de carrière.

Préparation <ol><li> Obtenir appropriés lignes drosophile contenant une hémocytes spécifiques Gal4 conducteur (p. ex srp-Gal4 2) et un journaliste codées génétiquement fluorescent sous SAMU de contrôle (par exemple, UAS-GFP). Les mouches homozygotes pour srp-Gal4, UAS-GMA 3 ou CRQ-Gal4, UAS-GFP 4, 5 sont particulièrement utiles à des fins d&#39;imagerie (nb GMA est la GFP fusionnée au domaine de liaison de l&#39;actine-moésine); voir ci-dessous pour une discussion sur la gamme de Gal4 pilotes et UAS constructions disponibles (le stock Bloomington centre contient une grande variété). </li><li> Typiquement traverse génétiques sont réalisées de telle sorte que des allèles mutants sont équilibrés avec les équilibreurs fluorescentes CTG ou TTG 6, avec Gal4 pilotes et des constructions réalisées sur le SAMU alternatives chromosomes homologues. Cela permet de sélectionner des mutants homozygotes sur la base de l&#39;absence de CTG / TTG-associé fluorescence de la GFP (cela se fait au stade de 2.11). </li><li> Amplifier stocks et des mouches dans une cage pose avec une plaque de gélose au jus de pomme 7. Les mouches ont besoin d&#39;au moins deux jours pour s&#39;acclimater à la cage, avant la pose suffisamment d&#39;embryons commencent à être établies. En général vingt mouches de chaque sexe doit être suffisante pour générer suffisamment d&#39;embryons pour l&#39;imagerie, mais il convient de noter que les différentes lignes ont différents degrés de fertilité. Nous utilisons des boîtes de Pétri 55mm qui s&#39;inscrivent dans le fond d&#39;un récipient en plastique, percé à sa base pour laisser l&#39;air circuler. Les moyens exacte de collecte d&#39;embryons est sans importance, mais les timings sont essentiels afin de collecter correctement mis en scène des embryons. </li><li> Recueillir des embryons à partir d&#39;une plaque de gélose au jus de pomme nuit maintenue à 25 ° C ou d&#39;une plaque chronométré. Pour ces derniers, nous permettent généralement les mouches à poser sur une plaque pré-chauffée pendant 4 heures, avant d&#39;enlever la plaque et en le plaçant à 18 ° C pour 15-16 heures avant le montage des embryons, ce qui fournit des embryons de stade avancé du 12 au à l&#39;étape 15 de développement. Une plaque nuit contient une plus grande diversité des stades, mais offre l&#39;avantage de la hausse des niveaux d&#39;expression rapporteur fluorescent dans les hémocytes due à une plus longue période de temps à 25 ° C comme le système de Gal4-SAMU est sensible à la température. </li></ol> Procédure <ol><li> Déloger les embryons de la plaque de gélose au jus de pomme, en utilisant une petite quantité d&#39;eau et un pinceau à pointe molle. Embryons délogés peuvent être vus facilement à l&#39;œil nu. </li><li> Transfert des embryons à un tamis cellulaire (Fisher) ou home-made panier 7 en versant l&#39;eau sur la plaque de gélose de pomme jus dans le panier a tenu plus d&#39;un bécher pour recueillir les eaux usées. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2 jusqu&#39;à ce que vous êtes satisfait, vous avez suffisamment d&#39;embryons transférés de la plaque de gélose de pomme jus. </li><li> Lavez les embryons dans une passoire cellules / panier avec de l&#39;eau. </li><li> Placez la cellule filtre / panier dans le couvercle boîte de Petri de la plaque de gélose de pomme jus et ajouter assez de javel soignée de suspendre embryons dans la passoire cellules / panier. </li><li> Suivez dechorionation des embryons sur un microscope de dissection sous fond clair: dechorionation est terminée lorsque les appendices dorsaux ont dissous, ce qui devrait se produire dans les deux minutes. </li><li> Retirez la cellule filtre / panier contenant des embryons de l&#39;eau de Javel et laver l&#39;eau de Javel résiduelle avec de l&#39;eau. Toutes les traces d&#39;eau de Javel doit être retiré avant de procéder à l&#39;étape 2.8. Une astuce pour déterminer si toutes les javel a été enlevée est d&#39;éponger hors de l&#39;eau résiduelle sur les tissus en laboratoire de couleur bleu - si il ya l&#39;eau de Javel résiduelle de la couleur bleue sera blanchi blanc / rose. </li><li> Blot hors de l&#39;eau restante en utilisant des tissus en laboratoire / mediwipes appliqué à la partie inférieure de la cellule de filtre / panier. </li><li> Placez une goutte d&#39;eau dans un couvercle de boîte de Pétri. Avec un pinceau fin, collecter toutes les embryons dechorionated du panier d&#39;embryons et de les remettre en suspension dans la gouttelette. Suivant sécher les embryons en aspirant l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;une micropipette ou soigneusement l&#39;absorber avec un tissu de laboratoire / mediwipes. </li><li> Une fois que les embryons ont été séchées, ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;VOLTALEF de couvrir tous les embryons. Mettre une goutte d&#39;huile de petite seconde à côté de la gouttelette contenant les embryons. NB nous avons été incapables de trouver un fournisseur britannique de l&#39;huile VOLTALEF; huile d&#39;halocarbures 700 (Sigma) peut être utilisé à la place. </li><li> Sous un microscope de dissection fluorescentes de sélectionner convenablement organisé embryons du génotype désiré à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces horlogers (numéro 5) de la gouttelette d&#39;huile. Ces pinces doivent être repliée vers l&#39;intérieur (figure 1) afin de ramasser les embryons sans perforer leur membrane vitelline. Transfert des embryons sélectionnés pour la gouttelette d&#39;huile secondes. Il est important que vous soyez capables de voir hémocytes fluorescentes sur le microscope de dissection afin d&#39;être en mesure de recueillir de bonnes images sur le microscope confocal (Figure 2). Nous généralement monter embryons au stade 13/14 à la migration des hémocytes image latérale sur la ligne médiane ventrale ou le stade de 15 embryonsà l&#39;image de la motilité des hémocytes après dispersion sur l&#39;embryon. </li><li> Bâton à deux lamelles (18x18mm, épaisseur 1) à la partie inférieure d&#39;un plat Petriperm / Lumox (Sarstedt), en utilisant deux petites gouttes d&#39;huile VOLTALEF, laissant environ 1 cm entre eux (figure 3); ils seront utilisés pour soutenir une lamelle placée au-dessus les embryons, afin de ne pas les écraser. Petriperm plats (diamètre 50mm) contiennent un revêtement hydrophobe, perméable aux gaz à membrane. Nous constatons que les plats deviennent plus faciles à utiliser une fois qu&#39;ils ont été utilisés à plusieurs reprises (les plats peuvent être essuyés avec 70% d&#39;éthanol et réutilisées). </li><li> Sous fond clair sur le microscope de dissection, ramasser des embryons sélectionnés un par un avec la pince et la ligne qui les plié face ventrale et parallèle au bord de l&#39;lamelles (figure 3). Il est possible d&#39;aligner jusqu&#39;à 15 embryons de cette manière, selon votre dextérité et votre patience. Il est important de manipuler les embryons en douceur à la fois comme des embryons et la membrane plat Petriperm sont fragiles et peuvent facilement être rompu. </li><li> Une fois que les embryons sont alignés ajouter une petite goutte d&#39;huile et laisser répandre pour former une couche homogène entre les deux lamelles. Après le pétrole s&#39;est répandu (cela peut prendre quelques minutes) vérifier que les embryons sont toujours face ventrale en place. Si les embryons ont roulé un peu, les repositionner à nouveau avec la pince. </li><li> Enfin, en utilisant une pince à épiler (numéro 3) placer une lamelle (18x18mm, épaisseur 1) sur les embryons, reposant sur les deux lamelles préalablement adhéré. Coller cette lamelle à la lamelle permet l&#39;utilisation de vernis à ongles (figure 3). </li><li> Prenez le plat avec des embryons Petriperm monté sur le microscope confocal ou à champ large et de monter le plat Petriperm sur la scène en utilisant un adaptateur approprié. Soit un microscope droite ou inversée peut être utilisé, avec l&#39;objectif concentrant travers la lamelle (par opposition à travers la membrane). </li></ol> Résultat représentant: Ce protocole décrit comment monter des embryons de drosophile pour l&#39;imagerie en direct de hémocytes sur la face ventrale de l&#39;embryon. Si fait correctement, il sera facile de générer des images fixes ou des films ou des hémocytes. Le principal déterminant est le microscope utilisé pour l&#39;image de la hémocytes (en particulier l&#39;objectif), mais la nature des images acquises dépendra aussi du stade de développement, la température des embryons ont été soulevées et les lignes au GAL4 et UAS utilisés. Des niveaux élevés d&#39;expression de protéines fluorescentes permettra hémocytes à imager avec plus de facilité, il est donc important d&#39;être capable de voir quand les hémocytes embryons sont au stade du protocole de 2,11 (figure 2 contient des exemples de hémocytes clair dans les embryons, prises avec un appareil équipé d&#39;un microscope à dissection). Nombre a donc augmenté de Gal4 et les constructions UAS permettre une plus grande un signal à bruit. De plus cela réduit le besoin pour des intensités laser de haute ou de temps d&#39;exposition accrue lorsque l&#39;imagerie, qui permet à son tour le comportement hémocytes à suivre pour de plus longues périodes. Des niveaux très élevés d&#39;expression de la GFP s&#39;affichera fins détails de la morphologie des hémocytes, en particulier les fines lamelles en forme de feuilles qui entourent le corps de la cellule circulaire (figure 4A-B). Circulaire régions hors GFP représentent phagosomes (figure 4A-C). Finger-like filopodes peut aussi être vu sortant de l&#39;lamelles (figure 4B). Deux pilotes Gal4 demeurent suffisants pour voir ces processus (figure 4C), surtout si un ou plusieurs sont srp-Gal4 (voir la discussion), mais des vitesses de balayage plus lent ou plus grande puissance laser sur le microscope confocal peut être nécessaire. Comme les niveaux d&#39;expression diminue, il devient plus difficile à l&#39;image des saillies d&#39;hémocytes; néanmoins il est toujours possible de suivre la migration des hémocytes dans ces conditions que le corps cellulaire reste évident même quand saillies sont moins claires (figure 4D). Au stades de développement précoces (jusqu&#39;au stade 13) hémocytes migrent en contact étroit les uns aux autres et il est souvent difficile de distinguer les cellules individuelles. À la fin de l&#39;étape 13 hémocytes ont formé une seule ligne en bas de la ligne médiane ventrale (figure 5A), puis, de plus en plus mobiles, migrer latéralement sur les bords de la corde nerveuse ventrale (figure 5B). Le cytosquelette d&#39;actine dans les protubérances dynamique des hémocytes peuvent être directement observés à travers l&#39;expression de la GMA (figure 5C) ou cerise moésine. Montage des embryons de cette manière permet les échanges gazeux et prévient la déshydratation et les embryons restent viables d&#39;imagerie suivants. Si l&#39;embryon est endommagé lors du montage, il est généralement évident que le contenu embryon de fuite à travers sa membrane vitelline. Si un embryon ne commence à se déshydrater, cela peut souvent été vus par des déformations de la membrane vitelline. Parfois un embryon va rouler pendant le cours d&#39;un film timelapse, mais cela a seulement tendance à être problématique pour les films plus délais. LastlY, le montage de plusieurs embryons à la fois donne l&#39;expérimentateur les meilleures chances d&#39;obtenir un embryon dans l&#39;orientation idéale pour leur expérience. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pinces pour la manipulation des embryons dechorionated. Les conseils des horlogers pince (numéro 5 taille) devrait être repliée vers l&#39;intérieur afin de façonner un outil pour ramasser les embryons comme montré ici. La surface extérieure de la région plié est également utile pour manipuler des embryons lors du positionnement sur la membrane Petriperm car ils possèdent pas de bords coupants qui pourraient percer l&#39;embryon. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Des images représentant des embryons qui donneront de bons résultats d&#39;imagerie en direct. Images d&#39;embryons dans l&#39;huile dechorionated VOLTALEF (au stade du protocole de 2,11) prises sur un microscope à fluorescence de dissection. Vues latérales du stade 13 (A) et l&#39;étape 15 (B) srp-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP embryons. Vue latérale d&#39;une étape 15 srp-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, embryon uas-GFP/uas-N17Rac (C) dans laquelle hémocytes ont échoué à migrer hors de la tête, montrant ce que les embryons ressembler quand hémocytes ne sont pas apparentes sur leurs itinéraires migratoires. Vue latérale d&#39;un stade de 17 srp-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP embryon montrant la structure alambiquée de l&#39;intestin à ce stade de développement (D); l&#39;apparition de la contraction des muscles empêche imagerie en temps réel des embryons au-delà de cette stade de développement. Vues ventrale de l&#39;étape 13 (E) et l&#39;étape 14 (F) srp-Gal4, UAS-rouge embryons stinger montrant la dispersion des hémocytes avec des noyaux marqués par fluorescence. L&#39;observation des hémocytes par fluorescence au stade 2.11 du protocole est une condition préalable pour obtenir d&#39;excellentes images; antérieure est à la droite pour toutes les images. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Montage des embryons sur un plat Petriperm / Lumox. Deux lamelles 18x18mm (épaisseur 1) sont collés sur la face inférieure de l&#39;antenne Petriperm utilisant une petite goutte d&#39;huile, séparés par environ 1cm comme indiqué. Les embryons sont ensuite alignés face ventrale avec leur axe long (antéro-postérieure) sur les bords de la lamelle et recouvert d&#39;une petite goutte d&#39;huile. Une fois l&#39;huile s&#39;est répandue pour combler l&#39;écart entre les deux lamelles d&#39;une lamelle tiers (épaisseur de 18x18mm 1) est placé délicatement sur le dessus des embryons recouverte de pétrole en utilisant les deux lamelles préalablement respectées comme un pont pour empêcher les embryons d&#39;être écrasé. Cette lamelle est ensuite collée à l&#39;aide de deux ponts lamelle deux petites gouttes de vernis à ongles. Une fois réglée, les embryons peuvent être visualisés sur un microscope à droite ou inversée avec la lentille de l&#39;objectif se concentrant à travers la lamelle (par opposition à travers la membrane Petriperm). <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie en direct de hémocytes GFP étiqueté. Z-projections d&#39;hémocytes sur la face ventrale d&#39;un stade de 14 srp-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP embryon (AB). (A) est une image plus faible grossissement tels que ceux utilisés pour contrôler les migrations hémocytes de développement dans les films timelapse. (B) est un grossissement plus élevé encore de hémocytes sur la ligne médiane ventrale, montrant des détails fins de leur morphologie. (C) est une simple tranche de 1 m de hémocytes sur la ligne médiane ventrale dans un stade de 14 srp-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, UAS-GFP + / embryon, révélant que le nombre de copies inférieur de Gal4 pilotes et UAS les constructions sont également suffisantes pour générer de bonnes images. (D) affiche un z-projection des hémocytes dans un stade de 14 CRQ-Gal4, UAS-GFP embryon. Voici saillies hémocytes sont moins évidentes raison de la baisse d&#39;expression de la GFP, mais il est encore possible de faire des films et de suivre la migration des hémocytes avec cette combinaison de Gal4 conducteur et UAS construire. Les images ont été prises sur un microscope confocal Leica LSM510; antérieure est en hausse dans toutes les images, les anneaux à la périphérie des images sont causés par autofluorescence membrane vitelline. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie en direct de hémocytes GMA exprimer. Z-projections d&#39;hémocytes sur la ligne médiane ventrale de l&#39;étape 13 (A) et le stade 14 (B) srp-Gal4, UAS-GMA embryons, tirées de films timelapse pour montrer les migrations de développement des hémocytes. Des informations détaillées sur la dynamique de l&#39;actine peuvent être obtenus par imagerie plus fort grossissement de hémocytes exprimant GMA (C). GMA est constitué de la GFP fusionnée au domaine liant l&#39;actine des filaments d&#39;actine moésine et des étiquettes. Antérieure est en hausse dans toutes les images, les images ont été prises sur un microscope confocal.

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7, 73-84 (2004).</li><li>Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+morphogenetic+movements+in+Drosophila+using+Gal4-UAS-driven+expression+of+GFP+fused+to+the+actin-binding+domain+of+moesin.">Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin.</a> Genesis. 34, 146-151 (2002).</li><li>Stramer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34, 135-138 (2002).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120, 1829-1837 (1994).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135, 621-626 (2008).</li><li>Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PAR-1+in+regulating+the+polarised+microtubule+cytoskeleton+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium.</a> Development. 130, 3965-3975 (2003).</li><li>Olofsson, B., Page, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+the+central+nervous+system+in+embryonic+Drosophila+is+inhibited+by+blocking+hemocyte+migration+or+neural+activity.">Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity.</a> Dev Biol. 279, 233-243 (2005).</li><li>Paladi, M., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+Rho+GTPases+in+embryonic+blood+cell+migration+in+Drosophila.">Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila.</a> J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).</li><li>Vlisidou, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryos+as+model+systems+for+monitoring+bacterial+infection+in+real+time.">Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time.</a> PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).</li><li>Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin-based+epithelial+adhesion+and+cell+matching+during+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.</a> Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+movement+during+dorsal+closure+in+Drosophila+embryos.">Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos.</a> Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).</li><li>Kunwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tre1+GPCR+initiates+germ+cell+transepithelial+migration+by+regulating+Drosophila+melanogaster+E-cadherin.">Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin.</a> J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).</li></ol>

Les éléments les plus importants de cette procédure sont à la sélection d&#39;embryons sains avec hémocytes clairement étiquetés et de les monter avec soin sans les endommager. Une fois que les embryons sont des halocarbures dans l&#39;huile ils sont résistants à la déshydratation et une fois montée peut être imagée pendant plusieurs heures. Dans nos mains, nous pouvons hémocytes d&#39;image pendant trois heures, avec une déshydratation négligeable de l&#39;embryon ou du photo-dommages évidents, en pre...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

Beaucoup de migration cellulaire des études utilisant l&#39;adresse<em&gt; In vitro</emMéthodes&gt;, alors que l&#39;environnement physiologiquement pertinente est celle de l&#39;organisme lui-même. Nous présentons ici un protocole pour le montage<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embryons et ultérieures imagerie en temps réel des hémocytes marqués par fluorescence, les macrophages embryonnaire de cet organisme. En utilisant le système UAS-Gal4<sup&gt; 1</sup&gt; Nous conduisons l&#39;expression d&#39;une variété d&#39;organismes génétiquement codés, des marqueurs de fluorescence marqués dans les hémocytes de suivre leur dispersion à travers le développement de l&#39;embryon. Après la collecte d&#39;embryons au stade de développement souhaité, le chorion externe est enlevée et les embryons sont ensuite montés dans l&#39;huile d&#39;halocarbures entre un hydrophobe, perméable aux gaz de membrane et une lamelle de verre pour l&#39;imagerie en direct. En plus de paramètres brute migrateurs tels que la vitesse et la directivité, de l&#39;imagerie haute résolution couplée à l&#39;utilisation des reporters fluorescents de F-actine et les microtubules peuvent fournir des informations plus détaillées concernant la dynamique de ces composants du cytosquelette.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations at JoVE.com

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l&#39;ensemble de l&#39;embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l&#39;image de ces migrations à partir d&#39;embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K vues.  University of Bath. Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

Vidéo: Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Recherche

Biologie

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Préparation individuelle Drosophila Œuf Chambres pour l&#39;imagerie en direct

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...