Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation Ellison Medical (SDP, <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) et le NIH R01AG030593 (SDP). Ce travail a utilisé les ressources de la base Drosophila vieillissement (CAD) de l&#39;amortisseur Nathan Centre d&#39;excellence en biologie du vieillissement financée par le National Institute of Aging P30-AG-013283 ( <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Les auteurs tiennent à remercier le Laboratoire Pletcher pour des discussions utiles et notamment Brian Chung pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Nick Asher et Kathryn Borowicz de l&#39;aide pour la collecte de données.

Nous vous recommandons de conserver des aliments expérimentaux, la pâte de levure, et des plaques de gélose de raisin qui apparaissent dans le protocole à 4 ° C et les utiliser dans les 1-2 mois aussi longtemps que la moisissure et la sécheresse n&#39;ont pas mis po standard des conditions environnementales à la fois pour les larves et les adultes scène impliquent l&#39;entretien des mouches dans un incubateur à 25 ° C avec un cycle de lumière 12:12 h sombre et 60% d&#39;humidité relative. 1. Préparation de l&#39;alimentation expérimentale <ol><li> Pour la croissance larvaire, nous utilisons une version modifiée du Caltech Moyen 5, qui est abrégé dans ce protocole CT. </li><li> Nous recommandons un régime alimentaire pour adultes Drosophila (SY) qui se compose de sucre (saccharose) et de la levure (levure lyophilisée brasseur entier) dans une base de gélose à 2%, qui a été bouillie, supplémenté avec des antibiotiques et antifongiques, et distribué (10 ml par flacon) 6. Les aliments doivent être autorisés à se solidifier et évaporer pendant 12-24 heures avant l&#39;entreposage. Parce que le milieu nutritif peut substantiellelement la longévité d&#39;impact, la cohérence dans les processus de cuisson est essentiel à la fois dans une expérience de comparaison entre les expériences. </li><li> Si un agent pharmacologique doit être ajouté à la nourriture des adultes, ce médicament peut être mélangé dans un petit lot de nourriture et de couches (2 ml) à la surface des aliments, avec des flacons témoins recevant couches contenant véhicule seul. </li></ol> 2. Préparation d&#39;une pâte de levure direct Mélanger 5-6 ml d&#39;eau avec 3 g de levure sèche active et bien mélanger. La consistance de la pâte de levure doit être celle d&#39;un beurre d&#39;arachide crémeux. 3. Préparation d&#39;une plaque de gélose de raisin <ol><li> Ajouter un paquet d&#39;un prémélange agar raisin dans 500 ml d&#39;eau distillée dans une fiole de 1000 ml et suivez les instructions sur le paquet de dissoudre le mélange agar raisin. </li><li> Verser soigneusement une couche épaisse du mélange dans des boîtes de Pétri 100 mm, tout en évitant la formation de bulles. Un sachet de prémélange produit environ 14 graplaques de gélose pe. </li><li> Que les médias refroidir et se solidifier à la température ambiante avec des couvercles sur pendant 15 min. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C, enveloppé dans une pellicule plastique, ou utilisé immédiatement. </li></ol> 4. Collecte des oeufs synchronisés Tous les médias utilisés dans ce protocole, la levure soit, plaques de gélose de raisin, CT et 10% des aliments SY, doit être à température ambiante. <ol><li> Étaler une couche de 2-3 cm de diamètre de levure coller sur une plaque de gélose de raisin et mettre de côté. </li><li> Placez une cage gros œuf sur une collection de CO 2 pad avec le maillage vers le bas pour anesthésier les mouches. À base d&#39;azote anesthésie est une alternative à CO 2, utilisé par certains laboratoires, qui peut produire des résultats de haute qualité 7. </li><li> L&#39;aide d&#39;un entonnoir, transférer 150-200 paires de mouches dans la cage collecte des œufs. </li><li> Placer la plaque de gélose de raisin pour couvrir l&#39;extrémité ouverte de la cage et fixer avec un capuchon d&#39;extrémité. </li><li> Poser la cage sur le côté jusqu&#39;à ce que les mouches se réveiller.Ensuite, garder la cage, côté raisin plaque de gélose vers le bas, dans l&#39;incubateur pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, remettez la plaque de raisin avec une plaque de raisin nouvellement levure. Ne mettre environ 1 cm de diamètre de pâte de levure sur la surface de la plaque. Jetez la plaque 1 er jour de raisin. </li><li> Permettre de recueillir des embryons sur la surface de la plaque de gélose de raisin pour 16-22 heures. Une fois cela fait, recueillir la plaque de gélose de raisin et jeter les mouches parents. </li><li> Lavez la surface de la gélose de raisin avec 1x tampon phosphate salin (PBS). Les œufs peuvent être mobilisés en grattant doucement avec un coton-tige. Prenez soin de ne pas rayer, endommager ou gratter minces morceaux de gélose sur la surface de la plaque. Avec l&#39;aide d&#39;un entonnoir, versez les œufs lavés dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les oeufs se déposent au fond du tube et jeter le surnageant, en faisant attention de ne pas perdre les œufs. Le volume restant doit être d&#39;environ 2-3 ml. </li><li> Ajouter 8-10 ml de PBS dans le tube et répétez les étapes 2-3 ci-dessus more fois de se laver les œufs jusqu&#39;à ce que le surnageant soit clair. Se débarrasser de la levure résiduelle est la clé dans cette étape. </li><li> Après le lavage, vider toute surnageant jusqu&#39;à ce que le volume restant est de 2 ml. Aliquoter 32 ul d&#39;œufs dans des bouteilles CT à l&#39;aide d&#39;une pipette de gros calibre. Oeufs dans la pointe de la pipette doit être compact, avec peu ou pas de liquide aspiré. Ceci peut être réalisé en insérant la pointe de la pipette en profondeur dans le règlement d&#39;oeuf et en relâchant le piston pour aspirer. </li><li> Lieu tête de série CT bouteilles Retour dans l&#39;incubateur au long du développement mouche. </li></ol> 5. Collection d&#39;appariés selon l&#39;âge adulte Flies <ol><li> Les adultes seront généralement Eclose de jour 9. Jeter les mouches qui ont émergé dès le premier jour et bouteilles lieu de retour dans la nuit incubateur. Cette pratique permet d&#39;éviter la sélection accidentelle de début émergentes et permettre la collecte d&#39;un nombre maximum de mouches synchronisés. </li><li> 16-22 heures plus tard, transférer la journée adulte âgé de mouches into 10% des bouteilles alimentaires SY. Si nécessaire, un autre lot peut être prélevé le lendemain. </li><li> Retour vole de nouveau dans l&#39;incubateur et laisser les mouches pour atteindre la maturité sexuelle et s&#39;accouplent pendant deux jours. Notez la date du transfert à 10% des bouteilles SY comme le premier jour de l&#39;âge adulte. </li></ol> 6. Tri des mouches et configuration Expérience Longévité <ol><li> Anesthésier petits groupes de mouches sur le pavé anesthésie, puis les mâles et les femelles de tri en deux groupes à l&#39;aide d&#39;un pinceau. Si vous utilisez le CO 2, il est essentiel de minimiser l&#39;exposition à prévenir d&#39;éventuels problèmes de santé de longue durée qui peuvent compromettre l&#39;intégrité de l&#39;expérience longévité. </li><li> Placez 30 mouches du même sexe dans des flacons individuels. En supposant qu&#39;aucun chromosomes d&#39;équilibrage de la population et de la descendance saine, chaque bouteille devrait produire environ 3-4 flacons de chaque sexe. Aliquotage mouches dans des flacons individuels ne devrait pas prendre plus de 3-4 minutes, de sorte que, au total, les mouches ne sont exposés à l&#39;anesthésie pour un maximum de9-10 min. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.2 jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y 8-10 flacon répétitions pour chaque sexe et les traitements expérimentaux. </li></ol> 7. Configuration de la feuille de calcul Excel pour suivre la longévité Expérience <ol><li> Nous vous recommandons de randomisation position de flacon plutôt que des flacons de regroupement par condition expérimentale afin d&#39;éviter les biais associés à l&#39;emplacement flacon dans l&#39;incubateur et à masquer l&#39;identité flacon à l&#39;expérimentateur. Pour ce faire, d&#39;abord affecter un ID aléatoire numérique à chaque flacon dans une feuille de calcul, puis disposez les flacons en barquettes par numéro d&#39;identification. Si vous utilisez le logiciel de gestion dLife expérience, suivre le tutoriel sur le montage expérimental pour générer le numéro d&#39;identification de chaque flacon. </li><li> (Facultatif) Si vous utilisez un lecteur RFID ou lecteur de code à barres en association avec dLife, fixez une étiquette RFID ou étiquette code à barres sur chaque flacon et d&#39;associer la marque à l&#39;identifiant numérique du flacon dans dLife. Le programme reconnaît chaque flacon lors de la numérisation d&#39;un lecteuret guider une pour enregistrer les données dans l&#39;emplacement approprié dans une feuille de calcul. L&#39;utilisation d&#39;un lecteur d&#39;étiquettes en conjonction avec dLife réduit considérablement le temps de collecte de données et d&#39;erreurs d&#39;enregistrement. </li></ol> 8. Le maintien de l&#39;Expérience Longévité Les flacons contenant de la nourriture fraîche doit être à la température ambiante pour chaque transfert. <ol><li> Au cours de la période expérimentale, les mouches transfert sur de nouveaux flacons contenant de la nourriture fraîche tous les 2 jours (les jeunes filles), ou 3 fois par semaine (mâles ou femelles&gt; 3 semaines d&#39;âge). Cette étape permet de s&#39;assurer que l&#39;environnement d&#39;alimentation pour les jeunes femmes ne soit pas perturbé par la présence de larves. Ce transfert doit être effectué sans anesthésie, ce qui peut induire une mortalité élevée, en particulier dans les vieilles mouches (Pletcher, observations personnelles). </li><li> Lors de chaque transfert de flacon, enregistrer l&#39;âge, compter les mouches mortes dans le flacon vieux, et les mouches mortes qui sont menées dans le flacon de nouveau. Enregistrer cette information séparément dansdeux colonnes dans une feuille de calcul (soit dLife ou votre propre feuille de calcul). Cela permettra d&#39;assurer que les mouches ne sont pas effectuées comptés deux fois. Le nombre total de décès (morts + réalisée) doit égaler au moins le nombre de mouches réalisées à partir du transfert précédent. Soustraire le nombre de mouches précédemment exercées par le nombre total de décès afin de déterminer le nombre de nouveaux décès. </li><li> Une mouche est considérée comme censurées à droite si elle a quitté l&#39;expérience avant la mort naturelle par la fuite ou la mort accidentelle. Animaux qui sortent de l&#39;expérience de cette manière doivent être saisies dans une colonne séparée sur la journée que la mouche est sorti de l&#39;expérience. Mouches censurés ne sont pas enregistrés comme décédés (voir ci-dessous). </li><li> Continuer à répéter les étapes 8.1 à 8.2 jusqu&#39;à ce que le dernier survivant est mort. Soyez conscient que l&#39;âge des mouches, des mouches peut se coucher sur le dos et semblent morts en raison de leur inactiveness. Par conséquent, lorsque le comptage des mouches effectuées (morts), appuyez sur le côté des flacons pour déterminer s&#39;il ya des mouvements de jambes. Si c&#39;est le cas, these mouches sont encore en vie. Dans le cas où les mouches restent collées à la nourriture dans le flacon vieux mais en vie, ils ne doivent pas être comptés comme morts et devrait encore être sauvé par tapotant le flacon pour déloger la volée. Censurer ces mouches doivent être utilisés avec prudence, car elle peut entraîner des biais expérimentaux. </li></ol> 9. Analyse des données <ol><li> La courbe de survie affiche la probabilité qu&#39;un individu survive à un âge donné et est généralement calculée en utilisant une approche de Kaplan-Meier (figure 1) 8. En l&#39;absence de données censurées à droite, la formule peut être simplifiée telle que la survie selon l&#39;âge à l&#39;âge x (S x) est calculé en divisant le nombre d&#39;individus vivants au début d&#39;un temps recensement à l&#39;âge x (N x) par le nombre total de mouches dans l&#39;expérience (N 0), S x = x N / N 0. 9.2 Les courbes de survie) sont la forme la plus courante de présentation des données, et ilspeuvent être testés pour l&#39;égalité entre les groupes à l&#39;aide d&#39;un test du log-rank. Inférence raisonnable ne peut être tirée d&#39;aussi peu que 50 à 100 individus d&#39;une cohorte. La survie est une mesure cumulative, cependant, et donc pas les morts qui ne sont pas liées au vieillissement, telles que celles tôt dans la vie, ralentira la survie tout au long de la durée de vie qui rend difficile de déterminer les effets spécifiques au vieillissement. </li><li> Une méthode de visualisation secondes données est la fonction de mortalité par âge, qui affiche le risque de mourir par chaque tranche d&#39;âge et présente une description plus nuancée de 9,10 données de survie. Mesures de la mortalité sont indépendants d&#39;un âge à l&#39;autre, et la forme de la courbe de mortalité est utile pour l&#39;inférence sur la dynamique du vieillissement, en particulier lorsque les traitements sont ajustés au cours de la vie adulte. Les estimations de la mortalité par âge, cependant, manquent à la fois précision et l&#39;exactitude des échantillons de petite taille, et nécessitent souvent plusieurs-vers-plusieurs centaines d&#39;individus par cohorte pour une es fiabletimate 11. </li><li> D&#39;autres méthodes pour estimer les différences de longévité comprennent paramétrique (par exemple Gompertz) et semi-paramétriques (par exemple, la régression de Cox) modèles. Ces modèles peuvent être puissants, mais doivent être appliquées avec prudence en raison des hypothèses faites sur la forme des courbes de mortalité et la nature des effets du traitement, ce qui pourrait conduire à l&#39;inférence incorrecte 11,12. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour produire des mesures reproductibles de la longévité des adultes chez la drosophile qui est adaptable pour l&#39;évaluation des ressources génétiques, des interventions pharmacologiques et environnementaux. Aspects cruciaux du protocole comprennent un contrôle minutieux de l&#39;environnement de développement larvaire, la réduction du stress des adultes, et minimiser les biais entre les groupes expérimentaux et de contrôle. Nous présentons égaleme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> De levure sèche active </td><td> Fleishmann levure </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Grape Premix Poudre Agar </td><td> Genesee scientifique </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes cages de collecte d&#39;embryons </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Embouts de rechange grandes </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 Bouteilles once fond carré, en polypropylène </td><td> Genesee scientifique </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Fermetures pour Bouteilles flugs stock </td><td> Genesee scientifique </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaFlacons, large, polystyrène </td><td> Genesee scientifique </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Fermetures pour flacons à large flugs </td><td> Genesee scientifique </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Conseils de larges orifices Pipet Aardvark, 200 ul </td><td> Denville scientifique </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, taille standard </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon tubes de 15 ml à centrifuger coniques </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-70C </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand boîtes de Pétri avec couvercles clairs, surélevée Ridge, 100 mm x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware flacons de 1000 ml jaune </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10x </td><td> EnVitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Gelidium </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> La levure de bière </td><td> MP Biomédical </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Sucre granulé </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee scientifique </td><td> 20-266 </td><td> Fly Conservateur alimentaire </td></tr><tr><td> Acide propionique, 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly Conservateur alimentaire </td></tr><tr><td> Le sulfate de kanamycine </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tétracycline HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

Le vieillissement est un phénomène qui se traduit par une détérioration physiologique stable dans pratiquement tous les organismes dans lesquels il a été examiné, conduisant à des performances physiques réduites et un risque accru de la maladie. Vieillissement individuel est manifeste au niveau de la population comme une augmentation de la mortalité liée à l&#39;âge, ce qui est souvent mesurée en laboratoire en observant la durée de vie dans les grandes cohortes d&#39;individus appariés selon l&#39;âge. Les expériences qui cherchent à quantifier la mesure dans laquelle génétique ou l&#39;impact environnemental des manipulations durée de vie dans des organismes modèles simples ont connu un succès remarquable pour comprendre les aspects du vieillissement qui sont conservés entre les taxons et d&#39;inspirer de nouvelles stratégies pour étendre la durée de vie et la prévention des maladies liées à l&#39;âge chez les mammifères . La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle intéressant pour l&#39;étude des mécanismes de vieillissement en raison de sa relativement courte durée de vie, l&#39;élevage pratique et la génétique faciles.Toutefois, les mesures démographiques du vieillissement, notamment l&#39;âge de la survie spécifique et la mortalité, sont extrêmement sensibles aux variations, même mineures dans la conception expérimentale et de l&#39;environnement, et le maintien de bonnes pratiques de laboratoire strictes pour la durée des expériences de vieillissement est nécessaire. Ces considérations, ainsi que de la nécessité de pratiquer un contrôle minutieux du contexte génétique, sont essentielles pour générer des mesures robustes. En effet, il existe de nombreuses controverses entourant notables inférence à partir des expériences de longévité chez la levure, les vers, les mouches et des souris qui ont été tracées à des artefacts environnementaux ou génétiques 1-4. Dans ce protocole, nous décrivons un ensemble de procédures qui ont été optimisés pendant de nombreuses années de mesure de la longévité chez la drosophile en utilisant des flacons de laboratoire. Nous décrivons également l&#39;utilisation du logiciel dLife, qui a été développé par notre laboratoire et est disponible en téléchargement ( <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / logiciel). dLife accélère le débit et la promotion de bonnes pratiques en intégrant la conception expérimentale optimale, ce qui simplifie la manipulation mouche et la collecte de données, et en normalisant l&#39;analyse des données. Nous discuterons également les nombreux pièges potentiels dans la conception, la collecte et l&#39;interprétation des données de durée de vie, et nous fournissons des mesures pour éviter ces dangers.

Un schéma simplifié du protocole est présenté à la figure 1, où les étapes clés sont décrits. La partie de synchronisation du protocole peut être utilisé pour différents essais qui nécessitent mouches adultes appariés par l&#39;âge. Courbes de survie typiques de mouches de type sauvage sont présentés dans la figure 2a, en utilisant le logiciel de gestion dLife expérience (Figure 2b, c). Les mâles adultes vivent généralem...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

33.8K vues.  University of Michigan. Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.