Name: Vidéo: Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 34.0K vues. University of Michigan. Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.

Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation Ellison Medical (SDP, <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) et le NIH R01AG030593 (SDP). Ce travail a utilisé les ressources de la base Drosophila vieillissement (CAD) de l&#39;amortisseur Nathan Centre d&#39;excellence en biologie du vieillissement financée par le National Institute of Aging P30-AG-013283 ( <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Les auteurs tiennent à remercier le Laboratoire Pletcher pour des discussions utiles et notamment Brian Chung pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Nick Asher et Kathryn Borowicz de l&#39;aide pour la collecte de données.

Nous vous recommandons de conserver des aliments expérimentaux, la pâte de levure, et des plaques de gélose de raisin qui apparaissent dans le protocole à 4 ° C et les utiliser dans les 1-2 mois aussi longtemps que la moisissure et la sécheresse n&#39;ont pas mis po standard des conditions environnementales à la fois pour les larves et les adultes scène impliquent l&#39;entretien des mouches dans un incubateur à 25 ° C avec un cycle de lumière 12:12 h sombre et 60% d&#39;humidité relative. 1. Préparation de l&#39;alimentation expérimentale <ol><li> Pour la croissance larvaire, nous utilisons une version modifiée du Caltech Moyen 5, qui est abrégé dans ce protocole CT. </li><li> Nous recommandons un régime alimentaire pour adultes Drosophila (SY) qui se compose de sucre (saccharose) et de la levure (levure lyophilisée brasseur entier) dans une base de gélose à 2%, qui a été bouillie, supplémenté avec des antibiotiques et antifongiques, et distribué (10 ml par flacon) 6. Les aliments doivent être autorisés à se solidifier et évaporer pendant 12-24 heures avant l&#39;entreposage. Parce que le milieu nutritif peut substantiellelement la longévité d&#39;impact, la cohérence dans les processus de cuisson est essentiel à la fois dans une expérience de comparaison entre les expériences. </li><li> Si un agent pharmacologique doit être ajouté à la nourriture des adultes, ce médicament peut être mélangé dans un petit lot de nourriture et de couches (2 ml) à la surface des aliments, avec des flacons témoins recevant couches contenant véhicule seul. </li></ol> 2. Préparation d&#39;une pâte de levure direct Mélanger 5-6 ml d&#39;eau avec 3 g de levure sèche active et bien mélanger. La consistance de la pâte de levure doit être celle d&#39;un beurre d&#39;arachide crémeux. 3. Préparation d&#39;une plaque de gélose de raisin <ol><li> Ajouter un paquet d&#39;un prémélange agar raisin dans 500 ml d&#39;eau distillée dans une fiole de 1000 ml et suivez les instructions sur le paquet de dissoudre le mélange agar raisin. </li><li> Verser soigneusement une couche épaisse du mélange dans des boîtes de Pétri 100 mm, tout en évitant la formation de bulles. Un sachet de prémélange produit environ 14 graplaques de gélose pe. </li><li> Que les médias refroidir et se solidifier à la température ambiante avec des couvercles sur pendant 15 min. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C, enveloppé dans une pellicule plastique, ou utilisé immédiatement. </li></ol> 4. Collecte des oeufs synchronisés Tous les médias utilisés dans ce protocole, la levure soit, plaques de gélose de raisin, CT et 10% des aliments SY, doit être à température ambiante. <ol><li> Étaler une couche de 2-3 cm de diamètre de levure coller sur une plaque de gélose de raisin et mettre de côté. </li><li> Placez une cage gros œuf sur une collection de CO 2 pad avec le maillage vers le bas pour anesthésier les mouches. À base d&#39;azote anesthésie est une alternative à CO 2, utilisé par certains laboratoires, qui peut produire des résultats de haute qualité 7. </li><li> L&#39;aide d&#39;un entonnoir, transférer 150-200 paires de mouches dans la cage collecte des œufs. </li><li> Placer la plaque de gélose de raisin pour couvrir l&#39;extrémité ouverte de la cage et fixer avec un capuchon d&#39;extrémité. </li><li> Poser la cage sur le côté jusqu&#39;à ce que les mouches se réveiller.Ensuite, garder la cage, côté raisin plaque de gélose vers le bas, dans l&#39;incubateur pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, remettez la plaque de raisin avec une plaque de raisin nouvellement levure. Ne mettre environ 1 cm de diamètre de pâte de levure sur la surface de la plaque. Jetez la plaque 1 er jour de raisin. </li><li> Permettre de recueillir des embryons sur la surface de la plaque de gélose de raisin pour 16-22 heures. Une fois cela fait, recueillir la plaque de gélose de raisin et jeter les mouches parents. </li><li> Lavez la surface de la gélose de raisin avec 1x tampon phosphate salin (PBS). Les œufs peuvent être mobilisés en grattant doucement avec un coton-tige. Prenez soin de ne pas rayer, endommager ou gratter minces morceaux de gélose sur la surface de la plaque. Avec l&#39;aide d&#39;un entonnoir, versez les œufs lavés dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les oeufs se déposent au fond du tube et jeter le surnageant, en faisant attention de ne pas perdre les œufs. Le volume restant doit être d&#39;environ 2-3 ml. </li><li> Ajouter 8-10 ml de PBS dans le tube et répétez les étapes 2-3 ci-dessus more fois de se laver les œufs jusqu&#39;à ce que le surnageant soit clair. Se débarrasser de la levure résiduelle est la clé dans cette étape. </li><li> Après le lavage, vider toute surnageant jusqu&#39;à ce que le volume restant est de 2 ml. Aliquoter 32 ul d&#39;œufs dans des bouteilles CT à l&#39;aide d&#39;une pipette de gros calibre. Oeufs dans la pointe de la pipette doit être compact, avec peu ou pas de liquide aspiré. Ceci peut être réalisé en insérant la pointe de la pipette en profondeur dans le règlement d&#39;oeuf et en relâchant le piston pour aspirer. </li><li> Lieu tête de série CT bouteilles Retour dans l&#39;incubateur au long du développement mouche. </li></ol> 5. Collection d&#39;appariés selon l&#39;âge adulte Flies <ol><li> Les adultes seront généralement Eclose de jour 9. Jeter les mouches qui ont émergé dès le premier jour et bouteilles lieu de retour dans la nuit incubateur. Cette pratique permet d&#39;éviter la sélection accidentelle de début émergentes et permettre la collecte d&#39;un nombre maximum de mouches synchronisés. </li><li> 16-22 heures plus tard, transférer la journée adulte âgé de mouches into 10% des bouteilles alimentaires SY. Si nécessaire, un autre lot peut être prélevé le lendemain. </li><li> Retour vole de nouveau dans l&#39;incubateur et laisser les mouches pour atteindre la maturité sexuelle et s&#39;accouplent pendant deux jours. Notez la date du transfert à 10% des bouteilles SY comme le premier jour de l&#39;âge adulte. </li></ol> 6. Tri des mouches et configuration Expérience Longévité <ol><li> Anesthésier petits groupes de mouches sur le pavé anesthésie, puis les mâles et les femelles de tri en deux groupes à l&#39;aide d&#39;un pinceau. Si vous utilisez le CO 2, il est essentiel de minimiser l&#39;exposition à prévenir d&#39;éventuels problèmes de santé de longue durée qui peuvent compromettre l&#39;intégrité de l&#39;expérience longévité. </li><li> Placez 30 mouches du même sexe dans des flacons individuels. En supposant qu&#39;aucun chromosomes d&#39;équilibrage de la population et de la descendance saine, chaque bouteille devrait produire environ 3-4 flacons de chaque sexe. Aliquotage mouches dans des flacons individuels ne devrait pas prendre plus de 3-4 minutes, de sorte que, au total, les mouches ne sont exposés à l&#39;anesthésie pour un maximum de9-10 min. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.2 jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y 8-10 flacon répétitions pour chaque sexe et les traitements expérimentaux. </li></ol> 7. Configuration de la feuille de calcul Excel pour suivre la longévité Expérience <ol><li> Nous vous recommandons de randomisation position de flacon plutôt que des flacons de regroupement par condition expérimentale afin d&#39;éviter les biais associés à l&#39;emplacement flacon dans l&#39;incubateur et à masquer l&#39;identité flacon à l&#39;expérimentateur. Pour ce faire, d&#39;abord affecter un ID aléatoire numérique à chaque flacon dans une feuille de calcul, puis disposez les flacons en barquettes par numéro d&#39;identification. Si vous utilisez le logiciel de gestion dLife expérience, suivre le tutoriel sur le montage expérimental pour générer le numéro d&#39;identification de chaque flacon. </li><li> (Facultatif) Si vous utilisez un lecteur RFID ou lecteur de code à barres en association avec dLife, fixez une étiquette RFID ou étiquette code à barres sur chaque flacon et d&#39;associer la marque à l&#39;identifiant numérique du flacon dans dLife. Le programme reconnaît chaque flacon lors de la numérisation d&#39;un lecteuret guider une pour enregistrer les données dans l&#39;emplacement approprié dans une feuille de calcul. L&#39;utilisation d&#39;un lecteur d&#39;étiquettes en conjonction avec dLife réduit considérablement le temps de collecte de données et d&#39;erreurs d&#39;enregistrement. </li></ol> 8. Le maintien de l&#39;Expérience Longévité Les flacons contenant de la nourriture fraîche doit être à la température ambiante pour chaque transfert. <ol><li> Au cours de la période expérimentale, les mouches transfert sur de nouveaux flacons contenant de la nourriture fraîche tous les 2 jours (les jeunes filles), ou 3 fois par semaine (mâles ou femelles&gt; 3 semaines d&#39;âge). Cette étape permet de s&#39;assurer que l&#39;environnement d&#39;alimentation pour les jeunes femmes ne soit pas perturbé par la présence de larves. Ce transfert doit être effectué sans anesthésie, ce qui peut induire une mortalité élevée, en particulier dans les vieilles mouches (Pletcher, observations personnelles). </li><li> Lors de chaque transfert de flacon, enregistrer l&#39;âge, compter les mouches mortes dans le flacon vieux, et les mouches mortes qui sont menées dans le flacon de nouveau. Enregistrer cette information séparément dansdeux colonnes dans une feuille de calcul (soit dLife ou votre propre feuille de calcul). Cela permettra d&#39;assurer que les mouches ne sont pas effectuées comptés deux fois. Le nombre total de décès (morts + réalisée) doit égaler au moins le nombre de mouches réalisées à partir du transfert précédent. Soustraire le nombre de mouches précédemment exercées par le nombre total de décès afin de déterminer le nombre de nouveaux décès. </li><li> Une mouche est considérée comme censurées à droite si elle a quitté l&#39;expérience avant la mort naturelle par la fuite ou la mort accidentelle. Animaux qui sortent de l&#39;expérience de cette manière doivent être saisies dans une colonne séparée sur la journée que la mouche est sorti de l&#39;expérience. Mouches censurés ne sont pas enregistrés comme décédés (voir ci-dessous). </li><li> Continuer à répéter les étapes 8.1 à 8.2 jusqu&#39;à ce que le dernier survivant est mort. Soyez conscient que l&#39;âge des mouches, des mouches peut se coucher sur le dos et semblent morts en raison de leur inactiveness. Par conséquent, lorsque le comptage des mouches effectuées (morts), appuyez sur le côté des flacons pour déterminer s&#39;il ya des mouvements de jambes. Si c&#39;est le cas, these mouches sont encore en vie. Dans le cas où les mouches restent collées à la nourriture dans le flacon vieux mais en vie, ils ne doivent pas être comptés comme morts et devrait encore être sauvé par tapotant le flacon pour déloger la volée. Censurer ces mouches doivent être utilisés avec prudence, car elle peut entraîner des biais expérimentaux. </li></ol> 9. Analyse des données <ol><li> La courbe de survie affiche la probabilité qu&#39;un individu survive à un âge donné et est généralement calculée en utilisant une approche de Kaplan-Meier (figure 1) 8. En l&#39;absence de données censurées à droite, la formule peut être simplifiée telle que la survie selon l&#39;âge à l&#39;âge x (S x) est calculé en divisant le nombre d&#39;individus vivants au début d&#39;un temps recensement à l&#39;âge x (N x) par le nombre total de mouches dans l&#39;expérience (N 0), S x = x N / N 0. 9.2 Les courbes de survie) sont la forme la plus courante de présentation des données, et ilspeuvent être testés pour l&#39;égalité entre les groupes à l&#39;aide d&#39;un test du log-rank. Inférence raisonnable ne peut être tirée d&#39;aussi peu que 50 à 100 individus d&#39;une cohorte. La survie est une mesure cumulative, cependant, et donc pas les morts qui ne sont pas liées au vieillissement, telles que celles tôt dans la vie, ralentira la survie tout au long de la durée de vie qui rend difficile de déterminer les effets spécifiques au vieillissement. </li><li> Une méthode de visualisation secondes données est la fonction de mortalité par âge, qui affiche le risque de mourir par chaque tranche d&#39;âge et présente une description plus nuancée de 9,10 données de survie. Mesures de la mortalité sont indépendants d&#39;un âge à l&#39;autre, et la forme de la courbe de mortalité est utile pour l&#39;inférence sur la dynamique du vieillissement, en particulier lorsque les traitements sont ajustés au cours de la vie adulte. Les estimations de la mortalité par âge, cependant, manquent à la fois précision et l&#39;exactitude des échantillons de petite taille, et nécessitent souvent plusieurs-vers-plusieurs centaines d&#39;individus par cohorte pour une es fiabletimate 11. </li><li> D&#39;autres méthodes pour estimer les différences de longévité comprennent paramétrique (par exemple Gompertz) et semi-paramétriques (par exemple, la régression de Cox) modèles. Ces modèles peuvent être puissants, mais doivent être appliquées avec prudence en raison des hypothèses faites sur la forme des courbes de mortalité et la nature des effets du traitement, ce qui pourrait conduire à l&#39;inférence incorrecte 11,12. </li></ol>

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	<li>Toivonen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+influence+of+Indy+on+lifespan+in+Drosophila+after+correction+for+genetic+and+cytoplasmic+background+effects.">No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects.</a> PLoS Genet. 3, e95 (2007).</li><li>Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+an+'aging+gene'+in+long-lived+drosophila+strains:+increased+longevity+depends+on+sex+and+genetic+background.">Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background.</a> Aging Cell. 2, 123-130 (2003).</li><li>Burnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+effects+of+Sir2+overexpression+on+lifespan+in+C.+elegans+and+Drosophila.">Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila.</a> Nature. 477, 482-485 (2011).</li><li>Bokov, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+reduced+IGF-1R+signaling+in+Igf1r+/-+mice+alter+aging?.">Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?.</a> PLoS One. 6, e26891 (2011).</li><li>Lewis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+standard+food+medium.">A new standard food medium.</a> Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).</li><li>Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+composition+specifies+consumption,+obesity,+and+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Aging Cell. 7, 478-490 (2008).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metab. 14, 623-634 (2011).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations.">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).</li><li>Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+the+Tithonus+Error:+Genetic+Analysis+of+Mortality+Phenotypes.">Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes.</a> Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).</li><li>Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+life+spans+differ?+Partitioning+mean+longevity+differences+in+terms+of+age-specific+mortality+parameters.">Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).</li><li>Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Below-threshold+mortality:+implications+for+studies+in+evolution,+ecology+and+demography.">Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography.</a> Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).</li><li>Pletcher, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+fitting+and+hypothesis+testing+for+age-specific+mortality+data.">Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data.</a> Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).</li><li>Partridge, L., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+for+ageing+studies.">Benchmarks for ageing studies.</a> Nature. 450, 165-167 (2007).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Ford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drosophila+life+span+using+conditional,+tissue-specific+expression+of+transgenes+triggered+by+doxycyline+or+RU486/Mifepristone.">Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone.</a> Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).</li><li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging.">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56, 927-935 (2002).</li><li>Smith, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns.">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).</li><li>Sorensen, J. G., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+crowding+in+Drosophila+melanogaster+induces+Hsp70+expression,+and+leads+to+increased+adult+longevity+and+adult+thermal+stress+resistance.">Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance.</a> J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).</li><li>Bass, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+dietary+restriction+protocols+in+Drosophila.">Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).</li><li>Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+the+life+span,+vitality+and+fine+structure+of+Drosophila+melanogaster.">Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).</li><li>Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+longevity+as+a+function+of+circadian+resonance+in+Drosophila+melanogaster.">Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).</li><li>Joshi, A., Mueller, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+crowding+effects+on+longevity+in+Drosophila+melanogaster:+Increase+in+age-dependent+mortality.">Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality.</a> Current Science. 72, 255-260 (1997).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila:+New+insights+from+nutritional+geometry.">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour produire des mesures reproductibles de la longévité des adultes chez la drosophile qui est adaptable pour l&#39;évaluation des ressources génétiques, des interventions pharmacologiques et environnementaux. Aspects cruciaux du protocole comprennent un contrôle minutieux de l&#39;environnement de développement larvaire, la réduction du stress des adultes, et minimiser les biais entre les groupes expérimentaux et de contrôle. Nous présentons égaleme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> De levure sèche active </td><td> Fleishmann levure </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Grape Premix Poudre Agar </td><td> Genesee scientifique </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes cages de collecte d&#39;embryons </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Embouts de rechange grandes </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 Bouteilles once fond carré, en polypropylène </td><td> Genesee scientifique </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Fermetures pour Bouteilles flugs stock </td><td> Genesee scientifique </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaFlacons, large, polystyrène </td><td> Genesee scientifique </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Fermetures pour flacons à large flugs </td><td> Genesee scientifique </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Conseils de larges orifices Pipet Aardvark, 200 ul </td><td> Denville scientifique </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, taille standard </td><td> Genesee scientifique </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon tubes de 15 ml à centrifuger coniques </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-70C </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand boîtes de Pétri avec couvercles clairs, surélevée Ridge, 100 mm x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware flacons de 1000 ml jaune </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10x </td><td> EnVitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Gelidium </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> La levure de bière </td><td> MP Biomédical </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Sucre granulé </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee scientifique </td><td> 20-266 </td><td> Fly Conservateur alimentaire </td></tr><tr><td> Acide propionique, 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly Conservateur alimentaire </td></tr><tr><td> Le sulfate de kanamycine </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tétracycline HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

Le vieillissement est un phénomène qui se traduit par une détérioration physiologique stable dans pratiquement tous les organismes dans lesquels il a été examiné, conduisant à des performances physiques réduites et un risque accru de la maladie. Vieillissement individuel est manifeste au niveau de la population comme une augmentation de la mortalité liée à l&#39;âge, ce qui est souvent mesurée en laboratoire en observant la durée de vie dans les grandes cohortes d&#39;individus appariés selon l&#39;âge. Les expériences qui cherchent à quantifier la mesure dans laquelle génétique ou l&#39;impact environnemental des manipulations durée de vie dans des organismes modèles simples ont connu un succès remarquable pour comprendre les aspects du vieillissement qui sont conservés entre les taxons et d&#39;inspirer de nouvelles stratégies pour étendre la durée de vie et la prévention des maladies liées à l&#39;âge chez les mammifères . La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle intéressant pour l&#39;étude des mécanismes de vieillissement en raison de sa relativement courte durée de vie, l&#39;élevage pratique et la génétique faciles.Toutefois, les mesures démographiques du vieillissement, notamment l&#39;âge de la survie spécifique et la mortalité, sont extrêmement sensibles aux variations, même mineures dans la conception expérimentale et de l&#39;environnement, et le maintien de bonnes pratiques de laboratoire strictes pour la durée des expériences de vieillissement est nécessaire. Ces considérations, ainsi que de la nécessité de pratiquer un contrôle minutieux du contexte génétique, sont essentielles pour générer des mesures robustes. En effet, il existe de nombreuses controverses entourant notables inférence à partir des expériences de longévité chez la levure, les vers, les mouches et des souris qui ont été tracées à des artefacts environnementaux ou génétiques 1-4. Dans ce protocole, nous décrivons un ensemble de procédures qui ont été optimisés pendant de nombreuses années de mesure de la longévité chez la drosophile en utilisant des flacons de laboratoire. Nous décrivons également l&#39;utilisation du logiciel dLife, qui a été développé par notre laboratoire et est disponible en téléchargement ( <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / logiciel). dLife accélère le débit et la promotion de bonnes pratiques en intégrant la conception expérimentale optimale, ce qui simplifie la manipulation mouche et la collecte de données, et en normalisant l&#39;analyse des données. Nous discuterons également les nombreux pièges potentiels dans la conception, la collecte et l&#39;interprétation des données de durée de vie, et nous fournissons des mesures pour éviter ces dangers.

Un schéma simplifié du protocole est présenté à la figure 1, où les étapes clés sont décrits. La partie de synchronisation du protocole peut être utilisé pour différents essais qui nécessitent mouches adultes appariés par l&#39;âge. Courbes de survie typiques de mouches de type sauvage sont présentés dans la figure 2a, en utilisant le logiciel de gestion dLife expérience (Figure 2b, c). Les mâles adultes vivent généralem...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.

Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

measurement-of-lifespan-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

34.0K vues.  University of Michigan. Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...