La recherche a été financée avec des fonds de perfectionnement professionnel et de recherche de démarrage de l&#39;Université de l&#39;Ontario Institute of Technology (UOIT) au Dr John A. Samis et les Instituts de recherche en santé Santé bourse professionnelle de recherche pour étudiants à Irina Levit. Les auteurs tiennent à remercier Shannon Everett (centre d&#39;enseignement et d&#39;apprentissage, UOIT) pour son aide pour préparer la vidéo. Les auteurs remercient le Dr Michael E. Nesheim (Département de biochimie, Université Queen, Kingston, ON) pour son mentorat, la perspicacité, et des discussions utiles. Les auteurs remercient également le Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hémostase et Thrombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, Royaume-Uni) pour fournir les plasmas de patients DIC utilisés dans l&#39;étude.

1. Préparation de la VF-plasma humain déficient <ol><li> Cette méthode est une modification de la procédure décrite à l&#39;origine par Bloom et al 4. </li><li> Obtenir sang humain total d&#39;un bénévole adulte en bonne santé consentants (Homme ou Femme, 18 ans - 50 ans) qui n&#39;est pas de prendre tout médicament. Porter des gants en latex et un sarrau tout au long de la procédure. </li><li> Préparer 100 ml de 3,2% (p / v) de citrate trisodique dans de l&#39;eau distillée. Chargez 6,0 ml de cette solution dans 60 seringues distinctes ml. Retirer l&#39;air par appuyer sur le piston jusqu&#39;à la marque attentivement 6,0 ml sur la seringue. </li><li> Utilisez un tampon imbibé d&#39;alcool pour nettoyer la zone de la veine cubitale entre biceps et l&#39;avant-bras. Connect 20 appareils papillon jauge pour une seringue de 3 ml. Insérez l&#39;aiguille dans la veine cubitale papillon et tirer doucement sur le piston jusqu&#39;à ce que le sang remplit la barre des 3 ml. Jeter la seringue avec du sang. Cette étape est réalisée pour éliminer tout facteur tissulaire libéré de l&#39;endothélium endommagé à l&#39;aiguillesite de la lésion qui peut activer le processus de coagulation et d&#39;interférer avec la préparation de plasma déficient en FV. </li><li> Connectez aiguille à ailettes à «chargé» avec 60 ml seringue citrate trisodique 6,0 ml et tirer doucement sur le piston jusqu&#39;à ce que le sang atteint la marque de 60 ml sur la seringue. (Final 10.9mm concentration de citrate). </li><li> Retirer la seringue de l&#39;aiguille papillon et mélanger délicatement la seringue tout en gardant un doigt ganté ou le pouce sur la sortie de la seringue. </li><li> Continuer le prélèvement de sang en 60 seringues ml chacune remplie de 6,0 ml de citrate trisodique 3,2% tel que décrit ci-dessus. Il faut prévoir la récupération d&#39;environ 50% du volume de sang citraté que le plasma après centrifugation et que 50 pl de plasma déficient en FV est nécessaire par exemple dans le test microplaque. Notre laboratoire traite régulièrement 300-420 ml de sang citraté à la fois avec 7.5 x 60 seringues ml chacun avec 6,0 ml de citrate trisodique 3,2% / seringue. Cela est suffisant FV plasma déficient pour environ 3.000 microessais sur plaque (voir ci-dessous). </li><li> Retirer l&#39;aiguille du bras de papillon bénévole et appuyez sur une compresse de gaze stérile sur le site de la ponction veineuse pour 1,0 min. Couvrir site de ponction de la veine d&#39;un pansement stérile. </li><li> Centrifuger le sang citraté à 3300 xg pendant 20 min à température ambiante. Récupérer la couche supérieure de plasma jaune dans un bécher en plastique avec un barreau d&#39;agitation à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique en prenant soin de ne pas déranger la couche inférieure rouge et blanc de cellules de sang. </li><li> Mesurer le volume de plasma en ml et conserver 100 ul de plasma EDTA avant l&#39;addition de la glace pendant le temps de prothrombine caillot avenir (PT) test (voir ci-dessous). </li><li> Ajouter lentement solide EDTA à plasma citraté sous agitation douce à température ambiante pour atteindre 5 mM (concentration finale). Une fois que l&#39;EDTA est dissous, ajuster le pH à 7,0 par addition goutte à goutte de NaOH 1,0 M sous agitation douce. </li><li> Couvrir le bécher avec Saran Wrap et incuber pendant 8-10 heures sans agitation à 37 ° C. </li><li> Chaque h 2, de récupérer 100 ul d&#39;le plasma EDTA-traitée sur de la glace et de déterminer le terminal au moment de l&#39;incubation avec l&#39;EDTA et le comparer à PT de plasma avant l&#39;addition d&#39;EDTA (voir ci-dessus). </li><li> Pour les déterminations PT, amovibles se placent 8 bandes immunomodule ainsi en porte-gabarit en plastique et l&#39;insérer dans un lecteur de microplaques. </li><li> Bandes immunomodule Orient dans un lecteur de microplaques que: vide, vide, échantillons, vide, vide, échantillons, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. En outre, n&#39;utilisez que des puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande 8 immunomodule bien pour minimiser les interférences diffusion de la lumière par les bords des porte-gabarit en plastique. </li><li> Le dosage FV microplaque est capable de mesurer la formation de caillots de fibrine dans au moins 12 échantillons différents simultanément (6 échantillons par bande immunomodule plus 2 bandes immunomodule). </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 50 ul de HBS (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) àchaque puits de microplaque pour chacun des échantillons à doser. En utilisant une pipette simple, ajouter 50 ul d&#39;un pool de plasma humain normal de référence (PSN) ou le plasma avant l&#39;addition de l&#39;EDTA ou à différents temps d&#39;incubation après addition d&#39;EDTA pour séparer les puits de la microplaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 50 ul de thromboplastine (Voir ci-dessous pour la méthode de préparation) à tous les puits de la microplaque avec plasma à doser. Incuber dans un lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l&#39;incubation de 1 min. </li><li> Utilisation de l&#39;ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d&#39;absorbance, longueur d&#39;onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant 5 sec, et lire l&#39;absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l&#39;eau distillée; 2.1mm final Concentration) à tous les puits de la microplaque, attendez 15 secondes, puis appuyez sur &quot;Démarrer&quot; icône sur le menu microplaque SoftMax Pro pour commencer le test. </li><li> Déterminer la TP à partir des profils d&#39;absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro comme le temps pour atteindre l&#39;augmentation d&#39;un demi maximum d&#39;absorbance à 405 nm (Le point médian de la courbe d&#39;absorbance sigmoïde vs Temps produite après la thromboplastine et plus de chlorure de calcium. Voir ci-dessous, Figure 1). </li><li> Calculer la FV 1-degré d&#39;activité de l&#39;heure Clot Connexion (s) en fonction de Log FV activité (unités / ml) comme illustré ci-dessous dans la figure 2A. À des fins de quantification, 1 unité d&#39;activité est définie comme FV l&#39;activité présente dans 1,0 ml PSN avant l&#39;activation intentionnelle avec la thrombine ajoutée (voir ci-dessous, le dosage des échantillons de plasma humain à l&#39;étape 1-FV et le 2-étape de test de coagulation microplaque). </li><li> Préparer 4.0l 20 mM d&#39;HEPES contenant 0,15 M de NaCl dans de l&#39;eau distillée en agitant doucement. Ajuster le pH à 7,4 avec dropw lenteplus de 5,0 M ise NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Obtenir une longueur suffisante de tube à dialyse et bien rincer avec de l&#39;eau distillée. Faire un nœud à une extrémité de la tubulure. Transfert EDTA plasma traité par un tube de dialyse avec une pipette de transfert en plastique, retirer l&#39;air et faire un noeud à l&#39;autre extrémité du tube. </li><li> Soigneusement accrocher le plasma EDTA-traitée dans le tube dans le HBS avec agitation douce. Couvrir avec le Saran Wrap et dialyser pendant 14-16h sous agitation douce à 4 ° C. </li><li> Retirez délicatement le plasma EDTA-treated/dialyzed en aliquots de 3,0 à 15,0 ml tubes à vis ml plafonnés et conserver 100 ul pour analyse de PT de «finale» FV plasma déficient sur de la glace. Stocker le plasma déficient en FV-à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Dans les conditions décrites ci-dessus, l&#39;augmentation des TP de 10 à 15 secondes avant l&#39;addition d&#39;EDTA à 90-100 sec 8-10 h après l&#39;addition d&#39;EDTA. Le plasma déficient en FV préparé par ce procédé contient habituellement moins de 0,1% de l&#39;actif présent dans le FV départplasma humain frais. </li></ol> 2. Préparation de thromboplastine <ol><li> Dialyse est nécessaire pour éliminer toute calcium à partir de ce réactif de manière à permettre la formation de caillots de synchronisation précisément fibrine à partir du moment de l&#39;addition du chlorure de calcium pour initier la coagulation processus. </li><li> Préparer 100 ml et 4.0l de HEPES 20 mM et NaCl 0,15 M dans de l&#39;eau distillée dans un bécher en plastique avec agitation douce. Ajuster le pH à 7,4 en ajoutant goutte à goutte lent de 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Ajouter 6,0 ml de HBS, pH 7,4 à chaque flacon de réactif thromboplastine, replacer le couvercle et secouer doucement pour dissoudre. Incuber en flacons capsulés réactif pendant 15 min à température ambiante pour dissoudre la matière séchée. Agiter doucement pour dissoudre complètement. </li><li> Couper une longueur suffisante de tube à dialyse, bien rincer avec de l&#39;eau distillée, et attacher une extrémité du tube avec un noeud. Transfert thromboplastine un tube de dialyse, retirer l&#39;air, et attacher l&#39;autre extrémité du tube avec un noeud. </li><li> Californierefully accrocher un tube de dialyse dans 4.0l de HBS, pH 7,4 et remuer doucement recouvert de Saran Wrap à 4 ° C pendant 14-16 heures. </li><li> Transfert 3,0 ml de la thromboplastine dialyse des tubes de 15 ml plafonnés à vis et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 3. Préparation des FV 1-étape de coagulation microplaques standard Courbes dosage de l&#39;activité <ol><li> Décongeler FV plasma déficient, PSN, et la thromboplastine à 37 ° C pendant 10 min. Mélanger délicatement FV plasma déficient et de thromboplastine indépendamment, transfert à séparer en plastique bacs de rinçage, et incuber sur de la glace. Rangez le PSN sur la glace après avoir délicatement le mélange. Chlorure de calcium magasin (25 mM dans de l&#39;eau distillée) dans un bac de lavage séparé à la température ambiante. </li><li> Préparer 200 pi chacun des 2-dilutions de produits de santé naturels de 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512 fois dans du HBS, pH 7,4 avec 1,5 microtubes ml. Vortex et incuber sur de la glace. </li><li> Placez 8 bandes amovibles immunomodule ainsi en pPorte modèle de Lastic et l&#39;insérer dans un lecteur de microplaques. </li><li> Bandes immunomodule Orient dans un lecteur de microplaques que: vide, vide, échantillons, vide, vide, échantillons, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. En outre, n&#39;utilisez que des puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande 8 immunomodule bien pour minimiser les interférences diffusion de la lumière par les bords des porte-gabarit en plastique. </li><li> Le dosage FV microplaque est capable de mesurer la formation de caillots de fibrine dans au moins 12 échantillons différents simultanément (6 échantillons par bande immunomodule plus 2 bandes immunomodule). </li><li> Allumez le lecteur de microplaques et l&#39;accès SoftMax Pro logiciel de microplaques. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, faire des ajouts simultanés de plasma déficient en FV (50 pi) à tous les puits de la microplaque échantillon. Utiliser une pipette simple, ajouter 50 ul des 10 dilutions en série de produits de santé naturels préparés ci-dessus pour séparer les puits de la microplaque.</li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter thromboplastine (50 pi) à tous les puits d&#39;échantillon. Incuber dans le lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l&#39;incubation de 1 min. </li><li> Utilisation de l&#39;ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d&#39;absorbance, longueur d&#39;onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant les 5 premières secondes après l&#39;addition de chlorure de calcium, et de mesurer l&#39;absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min par la suite. L&#39;intervalle de 5 sec secousse n&#39;est pas incluse dans les temps caillot calculées (voir ci-dessous). </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l&#39;eau distillée; concentration finale de 3,5 mm) à tous les puits de la microplaque échantillon, attendez 15 secondes, appuyez sur &quot;Démarrer&quot; icône dans l&#39;application de microplaques en SoftMax Pro de l&#39;ordinateur pour lancer le dosage. </li><li> Til caillot fois sont calculés comme le temps en secondes pour atteindre le point médian entre l&#39;absorbance minimale et maximale à 405 nm après la thromboplastine et plus de chlorure de calcium. </li><li> Les vitesses initiales de formation du caillot est calculée comme le taux d&#39;augmentation de l&#39;absorbance à 405 nm (mUnits / min) qui englobent les 5 premiers points dans le temps de formation du caillot dans la partie linéaire de la courbe d&#39;absorbance en fonction du temps. </li><li> L&#39;étendue de la formation d&#39;un caillot a été calculé comme la différence entre l&#39;absorbance maximale et minimale à 405 nm (unités) réalisés au cours de l&#39;événement formation de caillots. </li></ol> 4. Dosage des échantillons de plasma de l&#39;homme avec la FV 1-2-étape et l&#39;étape de test de coagulation microplaques <ol><li> Décongeler FV plasma déficient, PSN, les plasmas de l&#39;échantillon, et de thromboplastine à 37 ° C pendant 10 min. Mélanger délicatement FV plasma déficient et de thromboplastine indépendamment, transfert à séparer plateaux en plastique de lavage ELISA, et incuber sur de la glace. Stockez les produits de santé naturels plasmas et de l&#39;échantillon sur la glaceaprès en mélangeant doucement. Chlorure de calcium magasin (25 mM dans de l&#39;eau distillée) dans un bac de lavage ELISA séparé à la température ambiante. </li><li> Préparer 200 pi chacun des 40 dilutions de plasmas produits de santé naturels et d&#39;échantillon dans HBS, pH 7,4 avec 1,5 ml microtubes. Vortex et incuber sur de la glace. </li><li> Insérez 8 bandes amovibles immunomodule ainsi dans le porte-modèle en plastique et insérez-la dans un lecteur de microplaques. </li><li> Bandes immunomodule suppléant vide, vide, échantillon, vide, vide, échantillon, vides, vides et de gauche à droite dans le porte-modèle pour minimiser les interférences diffusion de la lumière à partir voisins échantillon contenant des bandes. Utiliser uniquement les puits 2-7 de haut en bas dans chaque bande afin de minimiser les interférences immunomodule diffusion de la lumière à partir des bords de support de matrice en matière plastique. </li><li> Allumez le lecteur de microplaques et l&#39;accès SoftMax Pro logiciel de microplaques. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter FV plasma déficient (50 pi) à tous les puits de la microplaque échantillon. L&#39;utilisation d&#39;un single pipette, ajouter 50 ul de 40 fois PSN dilué ou plasmas échantillons préparés ci-dessus pour séparer les puits de la microplaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter thromboplastine (50 pi) à tous les puits d&#39;échantillon. Incuber dans le lecteur de microplaques à 25 ° C pendant 1 min et le programme du lecteur de microplaques à agiter la plaque pendant le sec 15-25 de l&#39;incubation de 1 min. </li><li> Utilisation de l&#39;ordinateur interfacé avec le lecteur de microplaques, accès SoftMax logiciel Pro microplaque application. Réglez le lecteur d&#39;absorbance, longueur d&#39;onde 405 nm à, mode cinétique, la température à 25 ° C, et le programme du lecteur de microplaques à agiter pendant les 5 premières secondes après l&#39;addition de chlorure de calcium, et de mesurer l&#39;absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 6 min par la suite. L&#39;intervalle de 5 sec secousse n&#39;est pas incluse dans les temps caillot calculées (voir ci-dessous). </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter du chlorure de calcium (50 ul de 25 mM dans de l&#39;eau distillée; 6.25mm concentration finale) à tous les puits de la microplaque échantillon et immédiatement press &#39;Démarrer&#39; icône dans l&#39;application de microplaques en SoftMax Pro de l&#39;ordinateur pour commencer le test. </li><li> A la fin de la course, déterminer le temps, le taux initial et le degré de formation de caillots de 40 fois PSN dilué et plasmas échantillons à partir des profils d&#39;absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro. </li><li> En tenant compte de la dilution de 40 fois, utilisez le temps de coagulation pour chaque échantillon pour calculer l&#39;activité FV en unités / ml à partir de la courbe d&#39;activité FV 1-étape standard de temps de coagulation en fonction de Log Log FV Activité (figure 2A). Cela représente l&#39;activité FV-1 stade ou que, sans «intentionnelle» activation par la thrombine. </li><li> Depuis FV est activée par la thrombine pour le cofacteur actif, FVa 1, un deuxième test après addition et l&#39;incubation avec la thrombine est essentiel de mesurer avec précision la FV 2-stade activité d&#39;un échantillon de plasma (Avec «intentionnelle» activation par la thrombine ajoutée). </li><li> Pour la FV 2-phase test, préparer 200-300 ul de thrombine purifiée 18 at 100 nM dans du HBS, pH 7,4, et incuber sur de la glace. L&#39;intention d&#39;utiliser 10 ul de thrombine diluée pour chaque échantillon de plasma à doser avec la FV 2-phase test. </li><li> Diluer 120 pi au-dessus du PSN et les plasmas d&#39;échantillonnage de 40 fois à 100 fois avec 170 ul de HBS, pH 7,4, contenant du chlorure de calcium 2,8 mm. Ajouter 10 ul de thrombine (concentration finale 10 nM) à chaque échantillon. Vortex bien mélanger et incuber à 37 ° C pendant 1 min. </li><li> Diluer l&#39;échantillon PSN et les plasmas à 500 fois en ajoutant 400 ul de HBS, pH 7,4, puits-tourbillon, et le dosage 50 ul de chaque échantillon de plasma dans le test microplaque FV 1-étape, comme décrit ci-dessus. </li><li> Déterminer le temps de coagulation pour les PSN et chaque échantillon de plasma analysés à partir des profils d&#39;absorbance en fonction du temps dans SoftMax Pro. En tenant compte de la dilution d&#39;un facteur 500, utilisez le temps de coagulation pour chaque échantillon pour calculer la FV 2-stade d&#39;activité de la courbe FV 1 étage standard de temps de coagulation en fonction de Log Log FV Activité (figure 2A). </li><li> Le total FV activitésté peut alors être calculée comme FV 2 étages activité - FV 1 étage activité. </li></ol>

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	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode des microplaques cinétique d&#39;essai décrit l&#39;élaboration d&#39;un roman, une technique rapide, peu coûteux et pratique pour la mesure de l&#39;activité de coagulation FV dans des échantillons de plasma humain qui ne l&#39;ont pas (FV 1-phase test) ou ont été intentionnellement activé par la thrombine ajoutée (FV 2 étapes d&#39;analyse). Le test utilise un lecteur de microplaques cinétique et tous les matériaux et les réactifs nécessaires sont disponibles dans le commerce ou peuvent être réalisés en interne. L&#39;essai contrôle en permanence la variation de la dispersion de la lumière de plasma au cours de la formation du caillot de fibrine à 405 nm. Le test microplaque a l&#39;avantage d&#39;utiliser de petits volumes d&#39;échantillons plasmatiques (pl) et se prête à l&#39;analyse de plusieurs échantillons en même temps (jusqu&#39;à 12). Ces attributs d&#39;analyse sont avantageux lorsque des équipements coûteux et réactifs sont utilisés (analyseurs automatisés et facteur déficientes plasmas), seuls petits volumes d&#39;échantillon sont disponibles (plasmas de patients) ou l&#39;analyse d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons (f Pendant la purification FVrom plasma). Le test FV microplaque a l&#39;avantage supplémentaire qu&#39;il est pratique, rapide, et ne nécessite pas l&#39;isolement et la purification des éléments constitutifs nécessaires. En comparaison avec inclinaison manuelle du tube 3, 4 et 5-7 tests automatisés FV qui ont été signalés, le test FV microplaque a comparable gamme utile de fois caillot (25-75 sec) et les niveaux correspondants de FV dans l&#39;échantillon (0,5 à 0.005 unités / ml), et la sensibilité / limites de détection (20-80pM). Par rapport aux analyses manuelles FV inclinaison du tube qui souffrent d&#39;une évaluation visuelle subjective de formation de caillots 3, 4, le test FV microplaque permet de mesurer objective et quantitative du temps de coagulation, taux initial, et l&#39;étendue de la formation du caillot de fibrine. En comparaison avec les tests automatisés FV qui souffrent de la condition des analyseurs et des réactifs coûteux 5-7, les réactifs de dosage FV microplaques et les matériaux sont peu coûteux et tout le matériel nécessaire peut être purchased commercialement ou faits maison. Inclinaison manuelle du tube 3, 4 et 5-7 dosages automatiques FV généralement seulement fournir le temps de formation du caillot; pas le temps, la fréquence initiale, et l&#39;étendue de la formation du caillot de fibrine, qui sont tous exactement mesuré par spectrophotométrie avec le dosage FV microplaque. Enfin, manuel d&#39;inclinaison du tube 3,4 et automatisé 5-7 dosages FV souffrent de ne pouvoir mesurer l&#39;activité FV dans des échantillons de plasma un à la fois, tandis que le test FV microplaque se prête à haut débit et 12 échantillons peuvent être dosés simultanément. Le test microplaque a été utilisée pour démontrer que la FV dans 9 plasmas de patients DIC a été moins active que dans les produits de santé naturels en raison d&#39;une combinaison de temps caillot retardés et la baisse des taux initiaux de la formation de caillots dans le FV 1-étape de dosage. Les vitesses initiales de formation de caillots dans le FV 2-phase test dans les plasmas de patients DIC n&#39;ont pas été modifiées de PSN. Les degrés de formation de caillots dans le patien DICt plasmas ont été également pas changé depuis les PSN dans le FV 1-2-étape et l&#39;étape des essais. Diminution de la FV 1 étage, 2 étages, et l&#39;activité totale peut être dû à une consommation accrue FV 19 et / ou de l&#39;inactivation 6 conformément à d&#39;autres études au cours de la pathogenèse de cette maladie du sang acquise. Compte tenu de l&#39;étendue de la formation de caillots dans les plasmas DIC était la même que celle observée avec les produits de santé naturels, cette variable est très probablement le résultat de la concentration de fibrinogène dans le plasma déficient en FV et non liés aux caractéristiques des plasmas de patients. Les résultats de l&#39;essai indiqué que microplaque de mesure de l&#39;activité FV dans des échantillons de plasma humain peut être obtenu à partir de la vitesse initiale et le temps de formation de caillot dans le FV-une étape de dosage et le temps de formation du caillot et l&#39;activité totale de la FV 2 - test scène. Il n&#39;a pas été possible d&#39;obtenir une mesure quantitative de l&#39;activité FV dans un échantillon de plasma en fonction du degré de formation de caillots dans til FV 1 - et 2-phase des essais ou de la vitesse initiale de formation de caillots dans le FV 2-phase test. Compte tenu de toutes les réactions atteint à peu près la même mesure de la formation de caillots de 0,35 à 0,45 unités entre l&#39;absorbance initiale avant et après l&#39;absorbance maximale thromboplastine et plus de chlorure de calcium, la mesure de l&#39;ampleur de la formation de caillots ne fournit pas une évaluation quantitative de l&#39;activité FV dans un proposée échantillon de plasma. Le test microplaque roman trouveront une utilisation dans la recherche et les milieux cliniques pour la mesure de l&#39;activité FV dans des échantillons de plasma humain et les fractions lors de sa purification à partir du plasma humain et animal. Le dosage microplaque peut être utilisé pour mesurer le temps, la fréquence initiale, et l&#39;étendue de la formation de caillot; paramètres ne sont généralement pas surveillés simultanément en mode d&#39;inclinaison du tube et des dosages de coagulation automatisés. Cette information fournit plus d&#39;une évaluation quantitative complète de l&#39;implication des FV lors de l&#39;événement formation de caillotsdans le plasma humain que ce qui a été précédemment rapporté 3-7. Cette information est particulièrement importante dans la recherche et les laboratoires cliniques lors de la mesure des changements significatifs dans l&#39;activité FV dans des échantillons de plasma ou purifiée FV ou FVa. Le test FV microplaque peut également être utilisé pour caractériser et mesurer les composés qui peuvent activer ou inactiver FV et FVa, mesurer l&#39;activité FV chez les patients à risque de thrombose veineuse à la suite de la mutation FV Leiden 20, 21 et de surveiller l&#39;activité de FV lors de sa purification à partir du plasma. Le test FV microplaque est facilement adaptable pour mesurer l&#39;activité d&#39;un facteur de coagulation dans le extrinsèque, voie intrinsèque ou commune utilisant le facteur approprié du plasma déficient et d&#39;initier des réactifs pour la formation de fibrine. Le test permettra de mieux comprendre la biochimie de la VF par une mesure plus précise et plus complète de son activité dans la recherche et les laboratoires cliniques. Ultimement, cette information aura un impact positif environnements de soins de santé grâce à un diagnostic plus précoce et au développement de traitements plus efficaces pour les personnes atteintes de troubles de la coagulation, tels que DIC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Kinetic lecteur de microplaques </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> SOFTmax PRO 4.3 Logiciel LS </td></tr><tr><td> Un pool de plasma normal de référence humain </td><td> Precision Biologicals </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Citrate trisodique </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV plasma déficient humain 4 </td><td></td><td></td><td> Fabriqué à partir de plasma humain frais et conservé en aliquotes à -70 ° C. </td></tr><tr><td> 3 et 60seringues ml </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 136898 et </td><td></td></tr><tr><td> Appareil de papillon </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> Calibre 20 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastine </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Dialysée contre HBS, pH 7,4 et stockées en aliquots à -70 ° C. </td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> Thrombine humaine 15 </td><td></td><td></td><td> À partir de plasma humain; stocké à -20 ° C dans 50% (v / v) de glycérol. </td></tr><tr><td> Membrane de dialyse </td><td> Pêcheur </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa coupure de poids moléculaire; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Porte-modèle et amovible barrettes de 8 puits. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 et 469957 </td><td></td></tr><tr><td> Bacs de lavage ELISA </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml et 15 ml tubes à vis plafonnés. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 et 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette multicanaux </td><td> Pêcheur </td><td> 2703630 </td><td> Modèle 8 canaux. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

En réponse à la blessure, la coagulation du sang est activé et entraîne la production de la protéase de coagulation, la thrombine. La thrombine clive le fibrinogène en fibrine qui forme un caillot insoluble qui arrête l&#39;hémorragie. Facteur V (FV) dans sa forme activée, FVa, est un co-facteur critique pour la protéase Xa et accélérateur de génération de thrombine au cours de la formation du caillot de fibrine dans le cadre de prothrombinase 1, 2. Manuel des tests FV ont été décrits 3, 4, mais elles prennent du temps et subjective. FV automatisés tests ont été rapportés 5-7, mais l&#39;analyseur et des réactifs sont coûteux et généralement fournir que le temps de coagulation, et non le taux et l&#39;étendue de la formation de fibrine. La plate-forme de microplaques est préférable pour mesurer catalysées par des enzymes événements raisons de commodité, le temps, le coût, faible volume, la surveillance continue et à haut débit 8, 9. Tests en microplaques ont été rapportés pour 10 lyse du caillot, l&#39;agrégation plaquettaire11, facteurs de coagulation et 12, mais pas pour l&#39;activité FV dans le plasma humain. L&#39;objectif de la méthode est de développer un test qui mesure l&#39;activité de microplaques FV au cours de la formation de fibrine dans le plasma humain. Cette méthode en microplaque roman décrit un test simple, peu coûteux et rapide de l&#39;activité FV dans le plasma humain. Le dosage utilise un lecteur de microplaques cinétique de suivre l&#39;évolution de l&#39;absorbance à 405 nm lors de la formation de fibrine dans le plasma humain (figure 1) 13. Le test mesure avec précision le temps, le taux initial et le degré de formation d&#39;un caillot de fibrine. Elle exige que des quantités ul de plasma, est complète en 6 minutes, a haut débit, est sensible à la 24-80pM FV, et mesure la quantité d&#39;actionnement involontaire (1-étape de l&#39;activité) et la thrombine activée par FV (2-phase d&#39;activité ) pour obtenir une évaluation complète de son activité fonctionnelle totale (2-phase d&#39;activité - 1-étape de l&#39;activité). Intravasculaire disséminéeculier la coagulation (CIVD) est une coagulopathie acquise que développe le plus souvent à partir maladies infectieuses préexistantes 14. DIC est associée à un mauvais pronostic et la mortalité augmente au-dessus de la pathologie préexistante 15. Le test a été utilisé pour montrer que chez 9 patients avec DIC, le FV 1-phase, 2 étages, et des activités totales ont diminué, en moyenne, de 54%, 44% et 42%, respectivement, par rapport à la normale de l&#39;homme mis en commun plasma de référence (PSN). Le test FV microplaque est facilement adaptable pour mesurer l&#39;activité de toute facteur de coagulation. Ce test permettra de mieux comprendre la biochimie de la VF par une mesure plus précise et plus complète de son activité dans la recherche et les milieux cliniques. Cette information aura un impact positif environnements de soins de santé grâce à un diagnostic plus précoce et au développement de traitements plus efficaces pour les troubles de la coagulation, tels que DIC.

Les résultats représentatifs - Préparation des FV 1-étape de coagulation microplaques courbes de dosage d&#39;activité type Un exemple représentatif de la formation du caillot de fibrine dans le test FV au fil du temps généré par le lecteur de microplaques est illustré à la figure 1. Le test FV mesure avec précision le temps, le taux initial et le degré de formation d&#39;un caillot de fibrine. Inspection des puits à l&#39;issue test a confirmé que la formation du caillot s&#39;est produite. Toutes les réactions ont atteint à peu près la même mesure de la formation de caillot avec un changement général de l&#39;absorbance à 405 nm de 0,35 à 0,45 unités entre l&#39;absorbance de départ avant et après l&#39;absorbance maximale thromboplastine et plus de chlorure de calcium. Des exemples représentatifs des courbes d&#39;activité FV 1-étape standard de temps de coagulation Connexion (en secondes) en fonction de Log FV activité (unités / ml) et Log Taux initial de formation de caillots (en mUnits / min) en fonction de Log FV activité (unités / ml ) pour des dilutions en série de produits de santé naturels est indiqué dans <strong&gt; Figure 2A et 2B figure, respectivement. Montage de la parcelle Log-Log du temps Clot vs FV 1-Activité indiqué une forte corrélation entre ces variables après l&#39;analyse de régression linéaire (figure 2A; R 2 = 0,980). Montage de la parcelle Log-Log du taux initial de formation de caillots vs Activité FV a également indiqué une forte corrélation entre ces variables après l&#39;analyse de régression linéaire (figure 2B, R 2 = 0,983). La relation entre les deux temps de coagulation de journal et la vitesse initiale de formation en fonction de Log Clot FV activité est restée linéaire pour les PSN diluée jusqu&#39;à 512 fois. Depuis FV circule dans les PSN à environ 12 40nm 16, le test microplaque est sensible à environ 24 80pM FV dans les PSN. Étant donné que la constante de l&#39;interaction de FVa-FXa-lipide dans prothrombinase dissociation est d&#39;environ 1 nM 17, le dosage FV microplaque est entièrement adapté à la mesure des niveaux de FV dans le plan physiologique pertinenplage des nM t pour la fonction FVa dans prothrombinase. En utilisant le test FV microplaque, il a été déterminé que la plage normale de l&#39;activité dans l&#39;essai FV FV activité 1-étape de 15 plasmas témoins sains (hommes et femmes, âge 18-20ans) était (moyenne ± écart type; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Cette concorde bien avec l&#39;activité normale et saine FV et la plage (0.66-1.14U/ml) déclarés par Cutler et al. pour la FV 1-étape de l&#39;activité déterminée avec un analyseur automatique 7. La variabilité intra-essai de la durée, l&#39;importance et le taux initial de formation de caillots dans le FV 1-étape de test dans 6 puits sur 8 jours différents a été de 3,4%, 4,4% et 3,1%, respectivement. La variabilité inter-essai de la durée, l&#39;importance et le taux initial de formation de caillots dans le FV 1-étape de test dans 6 puits de 8 expériences différentes, réparties sur 8 jours différents a été de 7,1%, 7,8% et 9,2%, respectivement. Ainsi, la variabilité intra-et inter-essai de ces mesu troisvariables rouges était à un niveau faible et acceptable pour les performances du test robuste au sein et entre les microplaques d&#39;essai de plusieurs échantillons simultanément (jusqu&#39;à 12). Les résultats représentatifs - Dosage échantillons de plasma humain avec la FV 1-2-étape et l&#39;étape de test de coagulation microplaque La courbe standard de Clot Log Time vs journal d&#39;activité FV (figure 2A) a été utilisé pour mesurer l&#39;activité FV dans les PSN et 9 plasmas de patients DIC qui n&#39;ont pas été intentionnellement activé par la thrombine ajoutée (FV 1-étape de l&#39;activité) ou ont été intentionnellement activé avec ajouté thrombine (FV 2-stade d&#39;activité) et les résultats sont présentés dans le tableau 1. Les 9 plasmas de patients exposés DIC FV 1-scène des activités et des taux initiaux de la formation de caillots qui ont été a diminué en moyenne de 54% et 18%, respectivement, de PSN. Les degrés de formation de caillots dans le FV 1-étape de dosage dans les patients DIC ne sont pas largement différente de PSN, et a augmenté en moyenne de 13% par rapport PSN. <html> L&#39;activation du PSN avec de la thrombine générée une participation d&#39;environ 8-multiplication par 2-FV degré d&#39;activité au-dessus du FV 1-étape de l&#39;activité (tableau 1). Ceci indique que la FV dans les PSN est principalement présent sous sa forme non activée et est d&#39;accord avec les résultats précédemment rapportés en utilisant manuel d&#39;inclinaison du tube tests FV 3, 4 et automatisés essais FV 5-7. Le FV 2-scène et l&#39;activité totale ont également diminué chez les patients DIC en moyenne, de 44% et 42%, respectivement, à partir des PSN. Les vitesses initiales et les prolongements de formation de caillots dans le FV 2-phase test chez les patients DIC ne sont pas significativement différentes de produits de santé naturels, et varie en moyenne d&#39;environ 9% et 4%, respectivement, par rapport à celle observée avec les PSN. Ces résultats indiquent que par rapport à la FV dans les PSN, le FV dans les plasmas de patients DIC a entraîné une période prolongée et une diminution du taux de formation de caillots de fibrine et que le FV patient était en moyenne, seulement 56% activable par la thrombine ainsi. ent &quot;fo: keep-together.within pages =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Formation de caillots dans de plasma normal de référence commun humain mesuré avec la cinétique FV microplaque test de coagulation 1-scène. Formation d&#39;un caillot de fibrine en produits de santé naturels a été surveillée en permanence à 405 nm en utilisant un lecteur de microplaques cinétique. L&#39;intrigue est la sortie du lecteur de microplaques d&#39;une réaction 6 min de 32 fois PSN dilué, du plasma déficient en FV, la thromboplastine, et le chlorure de calcium dans un puits de microplaque. L&#39;axe vertical représente la variation de l&#39;absorbance à 405 nm qui se sont produits à la suite de la formation de fibrine dans le plasma. Le temps de la formation de fibrine a été défini comme le temps nécessaire pour atteindre l&#39;augmentation d&#39;un demi maximum d&#39;absorbance ou du milieu de la courbe (36,40 s). La vitesse initiale de formation de caillot a été défini comme le taux de variation de l&#39;absorbance à 405 nm au cours des 5 premiers points dans le temps de l&#39;augmentation linéaire de la partie de la courbe d&#39;absorbance (611,88 mUnits / min). L&#39;exTente de formation du caillot est définie comme la différence entre l&#39;absorbance maximum et minimum à 405 nm (0,35 unités). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Courbes standard de temps et de vitesse initiale de formation de caillots vs activité du facteur V de plasma normal de référence commun humain en utilisant le test microplaque FV 1-scène. PSN a été dilué en série (0 - 512 fois dans HBS) et testés avec le test microplaque FV 1-étape, comme décrit dans le protocole. Log-Log parcelles du temps et de vitesse initiale de formation de caillots vs activité FV FV dans le test microplaque 1-étape sont présentés après un modèle de régression linéaire des données dans les parties A et B, respectivement. <table border="1"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> Activité essai 1-étape (unités / ml) </td><td> Mesure test 1-étape (unités) </td><td&gt; 1-étape de test Taux initial (mUnits / min) </td><td> Activité d&#39;essai à 2 étages (unités / ml) </td><td> Mesure d&#39;essai à 2 étages (unités) </td><td> Taux d&#39;essai 2-Phase initiale (mUnits / min) </td><td> L&#39;activité totale (unités / ml) </td></tr><tr><td> PSN </td><td> 1,02 </td><td> 0,363 </td><td> 744,96 </td><td> 7,93 </td><td> 0,433 </td><td> 375,84 </td><td> 6,91 </td></tr><tr><td> Patient 1 </td><td> 0,36 </td><td> 0,404 </td><td> 583,80 </td><td> 3,84 </td><td> 0,432 </td><td> 249,96 </td><td> 3,48 </td></tr><tr><td> Patient 2 </td><td> 0,67 </td><td> 0,416 </td><td> 704,04 </td><td> 5,28 </td><td> 0,469 </td><td> 323,16 </td><td> 4,61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Patient 3 </td><td> 0,31 </td><td> 0,435 </td><td> 562,08 </td><td> 3,92 </td><td> 0,453 </td><td> 294,96 </td><td> 3,61 </td></tr><tr><td> Patient 4 </td><td> 0,39 </td><td> 0,435 </td><td> 617,04 </td><td> 4,14 </td><td> 0,462 </td><td> 372,60 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Patient 5 </td><td> 0,73 </td><td> 0,401 </td><td> 641,40 </td><td> 5,91 </td><td> 0,433 </td><td> 354,24 </td><td> 5,18 </td></tr><tr><td> Patient 6 </td><td> 0,45 </td><td> 0,403 </td><td> 600,72 </td><td> 4,16 </td><td> 0,445 </td><td> 393,96 </td><td> 3,71 </td></tr><tr><td> Patient 7 </td><td> 0,49 </td><td> 0,395 </td><td> 575,40 </td><td> 4,89 </td><td> 0,449 </td><td> 357,48 </td><td> 4,40 </td></tr><tr><td> Patient 8 </td><td> 0,19 </td><td> 0,448 </td><td> 489,00 </td><td> 2,89 </td><td> 0,450 </td><td> 330,48 </td><td> 2,70 </td></tr><tr><td> Patiente 9 </td><td> 0,64 </td><td> 0,423 </td><td> 699,48 </td><td> 5,11 </td><td> 0,455 </td><td> 417,24 </td><td> 4,47 </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Activité FV dans les PSN et dans 9 patients qui ont développé la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). La FV 1-phase, 2 étages, et l&#39;activité totale dans les PSN et 9 plasmas de patients DIC ont été déterminées à partir de la FV 1-étape de test microplaque standard courbe du temps de formation du caillot vs activité FV (figure 2A) et sont donnés en unités / ml. Les vitesses initiales (taux initial d&#39;augmentation des A405nm sur les cinq premiers points dans le temps dans mUnits / min) et les extensions (maximum A405nm - Minimum A405nm) de formation de caillots dans le FV 1 - et le dosage de microplaques à 2 étages sont également indiquées.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Cette étude décrit un essai de microplaque roman qui mesure l&#39;activité de coagulation FV lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain qui n&#39;a pas été signalé précédemment. Le procédé utilise un lecteur de microplaques cinétique de mesurer en continu la variation de l&#39;absorbance à 405 nm lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain.

La mesure de l&#39;activité du facteur V dans le plasma humain en utilisant un test de coagulation microplaques

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.8K vues.  University of Ontario Institute of Technology. Cette étude décrit un essai de microplaque roman qui mesure l'activité de coagulation FV lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain qui n'a pas été signalé précédemment. Le procédé utilise un lecteur de microplaques cinétique de mesurer en continu la variation de l'absorbance à 405 nm lors de la formation du caillot de fibrine dans le plasma humain.

Vidéo: Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Recherche

Immunologie et infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Une méthode simple et efficace pour détecter l&#39;activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Une méthode rapide pour le traitement du sang pour augmenter le rendement des niveaux peptidiques plasma dans le sang humain

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Mesure de<em&gt; In vitro</em&gt; Activité d&#39;intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...