La ricerca è stata sostenuta con sviluppo professionale e dei fondi di ricerca di avvio presso l&#39;Università dell&#39;Ontario Institute of Technology (UOIT) per Dr. John A. Sami e Istituti canadesi di premio Salute Ricerca Ricerca professionale dello studente a Irina Levit. Gli autori riconoscono Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) per il suo aiuto la preparazione del video. Gli autori riconoscono Dr. Michael E. Nesheim (Dipartimento di Biochimica, Queen &#39;s University, Kingston, ON) per il suo mentore, l&#39;intuizione, e le utili discussioni. Gli autori riconoscono anche il Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Emostasi e Trombosi Centro, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) per la fornitura dei plasmi paziente DIC utilizzati nello studio.

1. Preparazione di FV-carente plasma umano <ol><li> Questo metodo è una modifica della procedura originariamente descritta da Bloom et al 4. </li><li> Ottenere sangue umano intero da un volontario consenziente adulto sano (maschio o femmina, età 18 - 50 anni) che non sta prendendo alcun farmaco. Guanti in lattice e un cappotto di laboratorio durante l&#39;intera procedura. </li><li> Preparare 100 ml di 3,2% (w / v) citrato trisodico in acqua distillata. Caricare 6,0 ml di questa soluzione in 60 ml siringhe separati. Eliminare l&#39;aria dal pistone deprimente con attenzione fino alla tacca 6,0 ml sulla siringa. </li><li> Utilizzare un tampone imbevuto di alcol per pulire l&#39;area della vena cubitale tra il bicipite e l&#39;avambraccio. Collegare 20 apparecchi farfalla calibro di una siringa da 3 ml. Inserire l&#39;ago a farfalla nella vena cubitale e tirare delicatamente lo stantuffo fino a quando il sangue riempie fino al segno 3 ml. Eliminare la siringa con il sangue. Questa fase viene eseguita per rimuovere qualsiasi fattore tissutale rilasciato dall&#39;endotelio danneggiato in corrispondenza dell&#39;agolesioni sito che può attivare il processo di coagulazione e interferire con la preparazione di FV-carente plasma. </li><li> Collegare ago a farfalla per siringa da 60 ml &#39;caricato&#39; con 6,0 ml di citrato trisodico e tirare delicatamente lo stantuffo fino a quando il sangue raggiunge i 60 ml segno sulla siringa. (Concentrazione finale 10.9mm citrato). </li><li> Rimuovere la siringa da ago a farfalla e mescolare delicatamente la siringa mantenendo un dito guantato o il pollice in uscita siringa. </li><li> Continua prelievo di sangue in 60 ml siringhe ognuno riempito con 6,0 ml di 3,2% di citrato trisodico come descritto sopra. Si dovrebbe prevedere il recupero di circa il 50% del volume del sangue citrato come plasma dopo centrifugazione e 50 pl di plasma carente di FV è richiesto per campione nel saggio micropiastra. Il nostro laboratorio i processi di routine 300-420 ml di sangue citrato alla volta, utilizzando 5-7 x 60 ml siringhe ciascuna con 6,0 ml di citrato trisodico 3,2% / siringa. Questo è sufficiente FV-carente plasma per circa 3.000 microsaggi piastra (vedi sotto). </li><li> Rimuovere l&#39;ago a farfalla dal braccio volontario e premere un tampone sterile garza sul sito di puntura venosa per 1,0 min. Copertina sede della puntura della vena con una benda sterile. </li><li> Centrifugare sangue citrato a 3.300 xg per 20 min a temperatura ambiente. Recupera strato superiore giallo plasma in un recipiente di plastica con un ancoretta con una pipetta di plastica trasferimento facendo attenzione a non disturbare inferiore rosso e bianco strato di cellule del sangue. </li><li> Misura il volume di plasma in ml e conservare 100 ul di plasma prima di aggiungere EDTA su ghiaccio per il tempo futuro coagulo di protrombina (PT) test (vedi sotto). </li><li> Aggiungere lentamente solida EDTA di plasma citrato con leggera agitazione a temperatura ambiente per ottenere 5 mM (concentrazione finale). Una volta che l&#39;EDTA è dissolto, aggiustare il pH a 7,0 per aggiunta goccia a goccia di NaOH 1.0M con leggera agitazione. </li><li> Coprire becher con pellicola trasparente e incubare per 8-10 ore, senza agitazione a 37 ° C. </li><li> Ogni 2 ore, recuperare il 100 ml diil plasma trattato con EDTA su ghiaccio e determinare il PT al tempo di incubazione con EDTA e confrontare la PT del plasma prima dell&#39;aggiunta EDTA (vedi sopra). </li><li> Per le determinazioni PT, posto rimovibili 8 strisce immunomodule e nel supporto dima in plastica ed inserirlo nel lettore di micropiastre. </li><li> Strisce immunomodule Orient in un lettore di micropiastre come: vuoto, vuoto, a campione, vuoto, vuoto, a campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Inoltre, utilizzare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo di ogni nastro 8 immunomodule bene per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. </li><li> Il saggio FV micropiastra è in grado di misurare la formazione di coaguli di fibrina in almeno 12 campioni diversi simultaneamente (6 campioni per striscia immunomodule oltre 2 strisce immunomodule). </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 ml di HBS (HEPES 20 mm, 150 mM NaCl, pH 7.4) aciascun pozzetto della micropiastra per ciascuno di campione da analizzare. Utilizzando una pipetta singola, aggiungere 50 ml di umano normale pool di plasma di riferimento (PHN) o al plasma prima dell&#39;aggiunta di EDTA o in tempi diversi di incubazione dopo l&#39;aggiunta di EDTA per separare i pozzetti. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di tromboplastina (Vedi sotto per metodo di preparazione) a tutti i pozzetti con plasma da dosare. Incubare in un lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante il 15-25 sec dell&#39;incubazione 1 min. </li><li> Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d&#39;onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per 5 secondi, e leggere l&#39;assorbanza a 405 nm ogni 5 sec per 6 min. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 ml di 25 mM in acqua distillata; 2.1mm finaconcentrazione l) a tutti i pozzetti, attendere 15 secondi, e premere l&#39;icona &#39;Start&#39; nel menu di micropiastra SoftMax Pro per iniziare il test. </li><li> Determinare il TP dai profili di assorbanza in funzione del tempo in SoftMax Pro come il tempo per raggiungere l&#39;aumento di mezzo massimo di assorbanza a 405nm (Il punto medio della curva della Assorbanza sigmoidale Ora prodotta dopo tromboplastina e cloruro di aggiunta di calcio. Vedi sotto, la figura 1). </li><li> Calcolare il 1 stadio FV attività trovate nella Clot Log (sec) vs Registro attività FV (Unità / ml), come illustrato di seguito nella Figura 2A. Per scopi di quantificazione, 1unità di attività FV è definita come l&#39;attività presente in 1,0 ml NHP prima dell&#39;attivazione intenzionale con aggiunta di trombina (Vedi sotto, analizzando campioni di plasma umano con la FV 1-stadio e 2-stadio saggio coagulazione micropiastra). </li><li> Preparare 4.0L di HEPES 20mm contenenti 0,15 M di NaCl in acqua distillata con leggera agitazione. Regolare il pH a 7,4 con dropw lentoInoltre ise di 5.0M NaOH (HBS, pH 7.4). </li><li> Ottenere una lunghezza sufficiente di tubo di dialisi e risciacquare abbondantemente con acqua distillata. Fare un nodo ad una estremità del tubo. Trasferimento EDTA trattati al plasma per tubi di dialisi con una pipetta di plastica trasferimento, rimuovere l&#39;aria, e fare un nodo l&#39;altra estremità del tubo. </li><li> Attenzione appendere il plasma EDTA-trattati nel tubo nel HBS con leggera agitazione. Coprire con pellicola trasparente e dializza per 14-16h con leggera agitazione a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione il plasma EDTA-treated/dialyzed in 3.0 ml aliquote in provette con tappo a vite 15,0 ml e conservare 100 pl per il dosaggio di PT &#39;finale&#39; FV-plasma carente su ghiaccio. Memorizzare il FV-plasma carente in a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. Nelle condizioni sopra descritte, l&#39;aumento PTs 10-15 sec prima dell&#39;aggiunta EDTA a 90-100 sec 8-10 ore dopo l&#39;aggiunta di EDTA. La FV-carente plasma preparato da questo metodo contiene routine meno dello 0,1% della presente attivo FV in partenzafresco plasma umano. </li></ol> 2. Preparazione di tromboplastina <ol><li> Dialisi è necessaria per rimuovere qualsiasi calcio da questo reagente per consentire appunto temporizzazione formazione del coagulo di fibrina dal tempo di aggiunta di cloruro di calcio per avviare processo di coagulazione. </li><li> Preparare 100 ml e 4.0l di HEPES 20 mM e NaCl 0,15 M in acqua distillata in un beaker di plastica con delicata agitazione. Portare il pH a 7,4 con lenta aggiunta goccia a goccia di NaOH 5.0M (HBS, pH 7,4). </li><li> Aggiungere 6,0 ml di HBS, pH 7,4 ad ogni flacone di reagente tromboplastina, sostituire il coperchio e agitare delicatamente per sciogliere. Incubare reagente in flaconi ridotta per 15 min a temperatura ambiente per sciogliere materiale essiccato. Agitare delicatamente per sciogliere completamente. </li><li> Tagliare una lunghezza sufficiente di tubo di dialisi, sciacquare bene con acqua distillata, e legare una estremità del tubo con un nodo. Trasferimento tromboplastina al tubo di dialisi, rimuovere l&#39;aria, e legare altra estremità del tubo con un nodo. </li><li> Carefully appendere tubo di dialisi in 4.0l di HBS, pH 7.4 e mescolare delicatamente coperto con pellicola trasparente a 4 ° C per 14-16 ore. </li><li> Trasferire 3,0 ml aliquote della tromboplastina dializzata per provette da 15 ml con tappo a vite e conservare a -80 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> 3. Preparazione di FV 1-stadio micropiastre coagulazione saggio di attività standard Curve <ol><li> Scongelare FV-carente plasma, NHP, e tromboplastina a 37 ° C per 10 min. Mescolare delicatamente FV-carente plasma e tromboplastina in modo indipendente, il trasferimento di separare plastica vaschette di lavaggio, e incubare in ghiaccio. Conservare la NHP sul ghiaccio, dopo aver leggermente miscelazione. Negozio di cloruro di calcio (25 mM in acqua distillata) in un vassoio separato lavaggio a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 200 pl ciascuna delle diluizioni seriali 2 volte di NHP da 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512 volte in HBS, pH 7,4 con 1,5 ml microcentrifuga tubi. Vortex bene e incubare in ghiaccio. </li><li> Posizionare rimovibili 8 strisce immunomodule anche in pmodello di supporto lastic e inserirlo nella lettore di micropiastre. </li><li> Strisce immunomodule Orient in un lettore di micropiastre come: vuoto, vuoto, a campione, vuoto, vuoto, a campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Inoltre, utilizzare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo di ogni nastro 8 immunomodule bene per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. </li><li> Il saggio FV micropiastra è in grado di misurare la formazione di coaguli di fibrina in almeno 12 campioni diversi simultaneamente (6 campioni per striscia immunomodule oltre 2 strisce immunomodule). </li><li> Accendere il lettore di micropiastre e accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. </li><li> Usando una pipetta multicanale, effettuare aggiunte simultanee di FV-carente plasma (50 microlitri) a tutti pozzetti campione. Utilizzare una pipetta singola, aggiungere 50 ml di 10 diluizioni seriali di NHP preparati in precedenza per separare i pozzetti.</li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere tromboplastina (50 microlitri) a tutti i pozzetti. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante l&#39;15-25 sec dell&#39;incubazione 1 min. </li><li> Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d&#39;onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per i primi 5 secondi dopo l&#39;aggiunta di cloruro di calcio, e l&#39;assorbanza a 405nm misura ogni 5 secondi per 6 min dopo. L&#39;intervallo di 5 sec agitazione non è incluso nei tempi coagulo calcolati (Vedi sotto). </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 ml di 25 mM in acqua distillata; concentrazione finale da 3,5 mm) a tutti i pozzetti del campione, attendere 15 secondi, premere l&#39;icona &#39;Start&#39; nella domanda di micropiastra in SoftMax Pro dal computer per avviare il dosaggio. </li><li> Tha tempi di coagulo sono calcolati come il tempo in secondi per raggiungere il punto intermedio tra il minimo e il massimo assorbimento a 405 nm dopo aggiunta di tromboplastina e cloruro di calcio. </li><li> Le velocità iniziali di formazione del coagulo sono calcolati come tasso di aumento dell&#39;assorbanza a 405nm (mUnits / min), che comprendono i primi 5 punti di tempo di formazione del coagulo nella porzione lineare della curva di assorbanza Tempo. </li><li> La misura della formazione del coagulo è stato calcolato come differenza tra l&#39;assorbanza massima e minima a 405nm (unità) realizzato durante l&#39;evento formazione del coagulo. </li></ol> 4. Saggio campioni di plasma umano con il FV 1 stadio e 2 stadi Assay coagulazione Microplate <ol><li> Scongelare FV-carente plasma, NHP, plasmi campione, e tromboplastina a 37 ° C per 10 min. Mescolare delicatamente FV-carente plasma e tromboplastina in modo indipendente, il trasferimento di separare plastica vaschette di lavaggio ELISA, e incubare in ghiaccio. Conservare i plasmi NHP e del campione su ghiaccio, dopo aver leggermente miscelazione. Negozio di cloruro di calcio (25 mM in acqua distillata) in un apposito cassetto lavaggio ELISA a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 200 pl ciascuna delle 40 diluizioni dei plasmi NHP e del campione in HBS, pH 7.4 utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga. Vortex bene e incubare in ghiaccio. </li><li> Inserire rimovibili 8 strisce immunomodule e nel supporto dima in plastica e inserire nel lettore di micropiastre. </li><li> Strisce immunomodule alternativo vuoto, vuoto, campione, vuoto, vuoto, campione, vuoti, e vuoto da sinistra a destra nel supporto modello per minimizzare le interferenze diffondere la luce dalla vicina campione contenenti strisce. Usare solo i pozzetti 2-7 da cima a fondo in ogni striscia immunomodule per minimizzare le interferenze diffondere la luce dai bordi del supporto dima in plastica. </li><li> Accendere il lettore di micropiastre e accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere FV-carente plasma (50 microlitri) a tutti pozzetti campione. Utilizzo di un single pipetta, aggiungere 50 ml di 40 volte NHP diluito o plasma campione preparato in precedenza per separare i pozzetti. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere tromboplastina (50 microlitri) a tutti i pozzetti. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 ° C per 1 min e la programmazione del lettore di micropiastre a scuotere la piastra durante l&#39;15-25 sec dell&#39;incubazione 1 min. </li><li> Uso del computer interfacciato con il lettore per micropiastre, accesso SoftMax Pro software applicativo micropiastra. Impostare il lettore a Assorbanza, lunghezza d&#39;onda di 405nm, modalità Kinetic, la temperatura a 25 ° C, e programmare il lettore per micropiastre a tremare per i primi 5 secondi dopo l&#39;aggiunta di cloruro di calcio, e l&#39;assorbanza a 405nm misura ogni 5 secondi per 6 min dopo. L&#39;intervallo di 5 sec agitazione non è incluso nei tempi coagulo calcolati (Vedi sotto). </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere cloruro di calcio (50 pl di 25 mM in acqua distillata; 6.25mm concentrazione finale) per tutti i pozzetti campione e immediatamente prEss l&#39;icona &#39;Start&#39; nella domanda di micropiastra in SoftMax Pro dal computer per avviare il test. </li><li> Al termine della corsa, determinare il tempo, velocità iniziale, e l&#39;entità della formazione del coagulo per 40 volte di NHP campione diluito e plasmi dai profili di assorbanza rispetto al tempo in SoftMax Pro. </li><li> Tenendo conto della diluizione di 40 volte, utilizzare il tempo di coagulo per ciascun campione per calcolare l&#39;attività FV in Unità / ml dal FV 1-stadio curva di attività di tempo standard Log Clot vs Registro attività FV (Figura 2A). Questo rappresenta l&#39;attività FV-1 stadio o che senza attivazione &#39;intenzionale&#39; di trombina. </li><li> Poiché FV viene attivato con trombina attiva il cofattore, FVa 1, un secondo saggio dopo l&#39;aggiunta e incubazione con trombina è fondamentale per misurare accuratamente il 2-stadio attività FV di un campione di plasma (con attivazione &#39;intenzionale&#39; di aggiunta trombina). </li><li> Per il 2 stadi saggio FV, preparare 200-300 ml di trombina purificata 18 bist 100nm HBS, pH 7,4 e incubare in ghiaccio. Prevede di utilizzare 10 ml di trombina diluita per ciascun campione di plasma da analizzare con il 2-stadio saggio FV. </li><li> Diluire 120 microlitri della NHP sopra e plasmi campione da 40 volte a 100 volte con 170 microlitri di HBS, pH 7,4 contenente 2,8 cloruro di calcio. Aggiungere 10 microlitri di trombina (10 nM concentrazione finale) per ogni campione. Vortice bene per mescolare e incubare a 37 ° C per 1 min. </li><li> Diluire NHP e plasmi campione a 500 volte con l&#39;aggiunta di 400 pl di HBS, pH 7,4, vortice bene, e dosaggio 50 pl di ciascun campione di plasma nel FV 1-stadio micropiastra saggio come descritto sopra. </li><li> Determinare il tempo di coagulo per NHP e ciascun campione di plasma analizzato dai profili di assorbanza in funzione del tempo in SoftMax Pro. Tenendo conto della diluizione 500 volte, utilizzare il tempo di coagulo per ogni campione per calcolare il FV a 2 stadi attività dal FV 1-stadio curva standard del Tempo Log Clot vs Registro attività FV (Figura 2A). </li><li> Il totale FV le attivitàty può quindi essere calcolata come FV a 2 stadi di attività - FV 1-fase di attività. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di analisi cinetica micropiastra descrive lo sviluppo di un romanzo, tecnica rapida, economica e conveniente per la misurazione dell&#39;attività di coagulazione FV in campioni di plasma umano che non hanno (FV 1-stadio assay) o sono stati intenzionalmente attivato con aggiunta di trombina (FV 2 stadi saggio). Il dosaggio utilizza un lettore di micropiastre cinetico e tutti i materiali e reagenti necessari sono disponibili in commercio o possono essere realizzati internamente. Il dosaggio controlla continuamente la variazione della diffusione luminosa del plasma durante la formazione del coagulo di fibrina a 405 nm. Il dosaggio micropiastra ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione di plasma (microlitri) ed è riconducibile per l&#39;analisi di campioni multipli contemporaneamente (fino a 12). Questi attributi del saggio sono vantaggiosi quando costose attrezzature e reagenti vengono utilizzati (analizzatori automatici e Factor-deficient plasma); solo piccole quantità di campione sono disponibili (plasmi paziente) o di un grande numero di campioni (f Durante purificazione FVrom plasma). Il saggio FV micropiastra ha i vantaggi aggiunto che è conveniente, veloce e non richiede l&#39;isolamento e la purificazione dei componenti costitutivi richiesti. Rispetto manuale tilt-tubo 3, 4 e 5-7 FV saggi automatizzati che sono stati riportati, il dosaggio FV micropiastra è paragonabile gamma utile di volte coagulo (25-75 sec) e corrispondenti livelli FV nel campione (0,5-0,005 Units / ml), e la sensibilità / limiti di rivelazione (20-80pM). Rispetto manuali tilt-tube saggi FV che soffrono di una valutazione soggettiva visiva della formazione del coagulo 3, 4, il saggio FV micropiastra consente la misurazione oggettiva e quantitativa del tempo di coagulo, velocità iniziale, e l&#39;entità della formazione del coagulo di fibrina. Rispetto ai test automatizzati FV che soffrono dal requisito di analizzatori costosi e reagenti 5-7, i reagenti micropiastre saggio FV e materiali sono economici e tutti i materiali necessari possono essere acquised o resi in-house. Manuale tilt-tubo 3, 4 e saggi automatizzati 5-7 FV generalmente forniscono solo il tempo di formazione del coagulo, non il tempo, velocità iniziale, e l&#39;entità della formazione del coagulo di fibrina che sono tutti accuratamente misurata spettrofotometricamente con il test FV micropiastra. Infine, saggi 5-7 manuale tilt-tubo 3,4 e automatizzata FV soffrono solo essere in grado di misurare l&#39;attività FV in campioni di plasma, una alla volta, mentre il saggio FV micropiastra è suscettibile di alta produttività e 12 campioni possono essere dosati simultaneamente. Il dosaggio micropiastra è stata usata per dimostrare che il FV in 9 pazienti plasmi DIC era meno attiva rispetto NHP causa di una combinazione di volte coagulo ritardati e tassi più bassi iniziali della formazione del coagulo in uno stadio dosaggio FV. Le velocità iniziali di formazione del coagulo in due stadi FV saggio nei plasmi DIC paziente non sono stati modificati da NHP. Le estensioni di formazione di coaguli nel patien DICt plasmi sono stati, inoltre, non cambiato da NHP nel FV 1 stadio e 2 test monofase. Diminuzione FV 1 stadio, 2 stadi, e le attività totali può essere dovuto ad un aumento dei consumi FV 19 e / o l&#39;inattivazione di 6, secondo altri studi durante la patogenesi di questa malattia del sangue acquisito. Data l&#39;entità della formazione del coagulo nel plasma DIC era lo stesso osservato con NHP, questa variabile era probabilmente a causa della concentrazione di fibrinogeno nel plasma FV-carente e non correlati alle caratteristiche dei plasmi paziente. I risultati del saggio micropiastra indicato che la misurazione dell&#39;attività FV in campioni di plasma umano può essere ottenuto dal tempo e frequenza iniziale di formazione del coagulo dal 1 stadio FV dosaggio e il tempo di formazione del coagulo e attività totale della FV 2 - fase di test. Non è stato possibile ottenere la misura quantitativa dell&#39;attività FV in un campione di plasma basate sulla misura della formazione del coagulo in tegli FV 1 - e 2-test monofase o il tasso iniziale di formazione di coaguli nel FV a 2 stadi saggio. Dato tutte le reazioni raggiunto approssimativamente la stessa misura della formazione del coagulo di 0,35-0,45 unità tra l&#39;assorbanza iniziale prima e l&#39;assorbanza massima dopo tromboplastina e cloruro di calcio Inoltre, la misurazione del grado di formazione del coagulo non fornisce una valutazione quantitativa dell&#39;attività FV in dato campione di plasma. Il saggio micropiastra romanzo troveranno impiego nella ricerca e cliniche per la misurazione dell&#39;attività FV in campioni di plasma umano e frazioni durante la sua purificazione dal plasma umano e animale. Il saggio micropiastra può essere usato per misurare il tempo, velocità iniziale, e l&#39;entità della formazione del coagulo; parametri generalmente non controllati simultaneamente in manuali tilt-tube saggi e analizzatori di coagulazione automatizzati. Questa informazione fornisce più di una valutazione quantitativa completa del coinvolgimento FV durante l&#39;evento formazione del coagulonel plasma umano che è stato precedentemente riportato 3-7. Questa informazione è particolarmente importante sia nella ricerca e nei laboratori clinici quando si misurano variazioni significative dell&#39;attività FV in campioni di plasma o con purificato FV o FVa. Il dosaggio FV micropiastra può anche essere utilizzato per caratterizzare e misurare composti che possono attivare o disattivare FV e FVa, misurare l&#39;attività FV in pazienti a rischio di trombosi venosa come risultato della mutazione FV Leiden 20, 21 e per monitorare l&#39;attività di FV durante la sua purificazione dal plasma. Il saggio FV micropiastra è facilmente adattabile per misurare l&#39;attività di fattore della coagulazione del estrinseca, via intrinseca, o comuni utilizzando l&#39;apposito fattore carente di plasma e l&#39;avvio di reagenti per la formazione di fibrina. Il saggio aumenterà la nostra comprensione del FV biochimica attraverso una misurazione più accurata e completa della sua attività nel campo della ricerca e nei laboratori clinici. Finalely, queste informazioni avrà un impatto positivo ambienti sanitari attraverso la diagnosi precoce e lo sviluppo di trattamenti più efficaci per gli individui affetti da disturbi della coagulazione, come DIC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Kinetic lettore di micropiastre </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> SoftMax Pro 4.3 software LS </td></tr><tr><td> Normale pool di plasma umano di riferimento </td><td> Precisione Biologicals </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Citrato trisodico </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-carente plasma umano 4 </td><td></td><td></td><td> Fatto da plasma umano fresco e conservato in aliquote a -70 ° C. </td></tr><tr><td> 3 e 60ml siringhe </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 e 136898 </td><td></td></tr><tr><td> Farfalla apparecchi </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> Calibro 20 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Tromboplastina </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Dializzato contro HBS, pH 7,4 e conservato in aliquote a -70 ° C. </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina umana 15 </td><td></td><td></td><td> Dal plasma umano; conservato a -20 ° C in 50% (v / v) di glicerolo. </td></tr><tr><td> Dialisi membrana </td><td> Pescatore </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa taglio di peso molecolare; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Modello di supporto e rimovibile strips da 8 pozzetti. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 e 469.957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISA lavaggio vassoi </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microcentrifuga e provette da 15 ml con tappo a vite. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 e 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta multicanale </td><td> Pescatore </td><td> 2703630 </td><td> 8 canali modello. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

In risposta al danno, coagulazione del sangue viene attivato e provoca la generazione della proteasi di coagulazione, la trombina. Trombina scinde il fibrinogeno in fibrina, che forma un coagulo insolubile che si ferma l&#39;emorragia. Fattore V (FV) nella sua forma attivata, FVa, è un cofattore essenziale per la FXa proteasi e acceleratore della generazione di trombina durante la formazione di coaguli di fibrina come parte di protrombinasi 1, 2. Manuali FV saggi sono stati descritti 3, 4, ma sono tempo e personale. Automatizzati saggi FV sono stati segnalati 5-7, ma l&#39;analizzatore e reagenti sono costosi e in genere forniscono solo il tempo coagulo, non la velocità e l&#39;entità della formazione di fibrina. La piattaforma micropiastra è preferito per misurare catalizzate da enzimi eventi della sua convenienza, tempo, costo, piccolo volume, monitoraggio continuo e ad alta velocità 8, 9. Saggi micropiastre sono stati riportati per lisi del coagulo 10, aggregazione piastrinica11, e fattori della coagulazione 12, ma non per l&#39;attività di FV nel plasma umano. L&#39;obiettivo del metodo è di sviluppare un saggio che misura l&#39;attività micropiastra FV durante la formazione di fibrina nel plasma umano. Questo metodo micropiastra romanzo delinea un saggio semplice, economico e rapido delle attività FV nel plasma umano. Il dosaggio utilizza un lettore di micropiastre cinetico per monitorare la variazione di assorbanza a 405 nm durante la formazione di fibrina nel plasma umano (Figura 1) 13. Il test misura con precisione il tempo, velocità iniziale, e l&#39;estensione della formazione del coagulo di fibrina. Richiede solo quantità pl di plasma, è completa in 6 minuti, ha alta produttività, è sensibile al 24 80pM FV, e misura la quantità di moto involontariamente (1-stadio attività) e trombina-activated FV (2-stadio attività ) per ottenere una valutazione completa della sua attività totale funzionale (a 2 stadi di attività - 1 stadio attività). Intravas disseminatalare coagulazione (CID) è una coagulopatia acquisita che più spesso si sviluppa da malattie infettive preesistenti 14. DIC è associato ad una prognosi infausta e mortalità aumenta sopra il preesistente patologia 15. Il saggio è stato usato per dimostrare che in 9 pazienti con coagulazione intravascolare disseminata, il FV 1 stadio, 2 stadi, e le attività totali sono diminuite, in media, del 54%, 44%, e 42%, rispettivamente, rispetto umano normale pool riferimento plasma (PHN). Il saggio FV micropiastra è facilmente adattabile per misurare l&#39;attività di fattore della coagulazione. Questo test aumenterà la nostra comprensione del FV biochimica attraverso una misurazione più accurata e completa della sua attività di ricerca e clinica. Queste informazioni saranno un impatto positivo ambienti sanitari attraverso la diagnosi precoce e lo sviluppo di trattamenti più efficaci per i disordini della coagulazione, come DIC.

Rappresentante dei risultati - Preparazione del FV 1-stadio micropiastra coagulazione saggio curve standard di attività Un esempio rappresentativo di formazione del coagulo di fibrina nel saggio FV nel tempo generato dal lettore di micropiastra è illustrato nella figura 1. Il saggio FV misura con precisione il tempo, velocità iniziale, e l&#39;estensione della formazione del coagulo di fibrina. Ispezione dei pozzetti dopo il completamento del test ha confermato che la formazione del coagulo è verificato. Tutte le reazioni raggiunto approssimativamente la stessa misura della formazione del coagulo con un generale cambiamento di assorbanza a 405 nm di 0,35-0,45 unità tra l&#39;assorbanza iniziale prima e l&#39;assorbanza massima dopo tromboplastina aggiunta di calcio e cloruro. Esempi rappresentativi di FV 1-stadio le curve di attività di tempo standard Log Clot (in secondi) vs Registro attività FV (Unità / ml) e Log velocità iniziale di formazione del coagulo (in mUnits / min) vs Registro attività FV (Unità / ml ) per diluizioni seriali di NHP è mostrata nella <strong&gt; Figura 2A e la Figura 2B, rispettivamente. Montaggio del log-log plot del tempo Clot vs FV 1-Attività indicato una forte relazione tra queste variabili, dopo l&#39;analisi di regressione lineare (Figura 2A, R 2 = 0,980). Montaggio del log-log grafico della velocità iniziale di formazione del coagulo vs Attività FV anche indicato una forte relazione tra queste variabili, dopo l&#39;analisi di regressione lineare (Figura 2B, R 2 = 0,983). Il rapporto di entrambi Tempo Clot Log e Log velocità iniziale di formazione del coagulo vs Registro attività FV rimasta lineare per NHP diluito fino a 512 volte. Dal FV circola in NHP a circa 12-40nm 16, il saggio micropiastra è sensibile a circa 24 80pM FV in NHP. Dato che la costante dell&#39;interazione di FVa-FXa-lipide in protrombinasi dissociazione è di circa 1 nM 17, il saggio FV micropiastra è interamente adatto per la misurazione dei livelli di FV nel fisiologicamente relevant gamma nM per la funzione FVa in protrombinasi. Utilizzando il test FV micropiastra, è stato anche stabilito che la normale gamma di attività FV in 1 stadio saggio di attività FV di 15 plasmi di controllo sani (Maschio e Femmina, Età 18-20yrs) era (media ± deviazione standard; Range): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Questo ben si accorda con la normale attività sana FV e la gamma (0.66-1.14U/ml) riportata da Cutler et al. per il FV 1-stadio dell&#39;attività determinata con un analizzatore automatico 7. La variabilità intra-analisi della misura del tempo, e la velocità iniziale di formazione di coaguli nel 1 stadio saggio FV in 6 pozzetti su 8 diversi giorni è stata del 3,4%, 4,4%, e 3,1%, rispettivamente. La variabilità inter-analisi della misura del tempo, e la velocità iniziale di formazione di coaguli nel 1 stadio saggio FV in 6 pozzetti di 8 diversi esperimenti su 8 giorni diversi è stato del 7,1%, 7,8% e 9,2%, rispettivamente. Pertanto, la variabilità intra-ed inter-saggio di queste tre misuvariabili rosse era ad un livello basso e accettabile per le prestazioni del dosaggio solida all&#39;interno e tra i test micropiastra di campioni contemporaneamente (fino a 12). Rappresentante Risultati - Saggio campioni di plasma umano con il FV 1 stadio e 2 stadi saggio di coagulazione micropiastra La curva standard di Grumo Log Tempo vs Registro attività FV (Figura 2A) è stato utilizzato per misurare l&#39;attività FV in NHP e 9 DIC plasma dei pazienti che non sono stati intenzionalmente attivati ​​con l&#39;aggiunta di trombina (FV 1-stadio attività) o sono stati intenzionalmente attivati ​​con aggiunta trombina (FV due stadi attività) ed i risultati sono mostrati nella Tabella 1. Tutti i 9 DIC plasma dei pazienti esposti FV 1-stadio attività e tassi iniziali della formazione del coagulo, che sono diminuiti in media, del 54% e 18%, rispettivamente, da NHP. Le estensioni di formazione di coaguli nel 1 stadio FV dosaggio nei pazienti con CID non erano molto diversi dai NHP, e sono aumentati in media, del 13% da NHP. <html> Attivazione di NHP con trombina generato un approssimativo di 8 volte aumento di FV a 2 stadi di attività al di sopra del 1 stadio attività FV (Tabella 1). Ciò indica che il FV in NHP è principalmente presente nella sua forma disattivo e concorda con i risultati riportati in precedenza con inclinazione manuale-tube test FV 3, 4 e automatizzati saggi FV 5-7. Il FV a 2 stadi e l&#39;attività totale, erano diminuiti nei pazienti DIC in media, del 44% e 42%, rispettivamente, da NHP. Le tariffe iniziali e le estensioni di formazione di coaguli nel FV a 2 stadi dosaggio nei pazienti DIC non erano significativamente differenti da NHP, e varia in media, di circa il 9% e 4%, rispettivamente, da quella osservata con NHP. Questi risultati indicavano che rispetto al FV in NHP, la FV nei plasmi paziente DIC determinato un tempo prolungato e ridotta velocità di formazione del coagulo di fibrina e che il paziente FV era in media, solo il 56% come attivabile con trombina pure. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formazione di coaguli nel normale pool di plasma umano di riferimento misurato con la cinetica micropiastra FV 1-fase di test della coagulazione. Formazione di coaguli di fibrina in NHP è stata continuamente monitorata a 405 nm usando un lettore di micropiastre cinetica. La trama è l&#39;uscita del lettore per micropiastre di reazione 6 min di 32 volte NHP diluita, FV-carente plasma, tromboplastina, e cloruro di calcio in una micropiastra. L&#39;asse verticale rappresenta il cambiamento di assorbanza a 405nm avvenuti a seguito della formazione di fibrina nel plasma. Il tempo di formazione della fibrina è stata definita come il tempo per raggiungere il massimo incremento di assorbanza mezzo o il punto centrale della curva (36,40 sec). Il tasso iniziale di formazione del coagulo è stato definito come il tasso di variazione di assorbanza a 405nm nei primi 5 punti temporali del aumento lineare della porzione di assorbanza della curva (611,88 mUnits / min). La valutazione extenda di formazione del coagulo è stato definito come la differenza tra l&#39;assorbanza massima e minima a 405 nm (0,35 unità). <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Curve standard di tempo e di velocità iniziale di formazione del coagulo vs V Fattore di attività nel normale pool di plasma umano di riferimento con il FV 1-fase di test micropiastra. NHP è stato diluito serialmente (0 - a 512 volte in HBS) e dosati con il FV 1-fase di test micropiastra come descritto nel protocollo. Log-Log trame del tempo e la velocità iniziale di formazione del coagulo contro l&#39;attività nel FV FV 1-fase di test micropiastra sono visualizzabili i modelli di regressione lineare dei dati nei pannelli A e B, rispettivamente. <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> 1 stadio Attività saggio (Unità / ml) </td><td> 1 stadio Estensione test (unità) </td><td&gt; 1-fase di analisi Velocità iniziale (mUnits / min) </td><td> 2 stadi di attività test (Unità / ml) </td><td> A 2 stadi Portata test (unità) </td><td> 2 stadi Vota test iniziale (mUnits / min) </td><td> L&#39;attività totale (Unità / ml) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1,02 </td><td> 0,363 </td><td> 744,96 </td><td> 7,93 </td><td> 0,433 </td><td> 375,84 </td><td> 6,91 </td></tr><tr><td> Paziente 1 </td><td> 0,36 </td><td> 0,404 </td><td> 583,80 </td><td> 3,84 </td><td> 0,432 </td><td> 249,96 </td><td> 3,48 </td></tr><tr><td> Paziente 2 </td><td> 0,67 </td><td> 0,416 </td><td> 704,04 </td><td> 5,28 </td><td> 0,469 </td><td> 323,16 </td><td> 4,61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Paziente 3 </td><td> 0,31 </td><td> 0,435 </td><td> 562,08 </td><td> 3,92 </td><td> 0,453 </td><td> 294,96 </td><td> 3,61 </td></tr><tr><td> Paziente 4 </td><td> 0,39 </td><td> 0,435 </td><td> 617,04 </td><td> 4,14 </td><td> 0,462 </td><td> 372,60 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Paziente 5 </td><td> 0,73 </td><td> 0,401 </td><td> 641,40 </td><td> 5,91 </td><td> 0,433 </td><td> 354,24 </td><td> 5,18 </td></tr><tr><td> Paziente 6 </td><td> 0,45 </td><td> 0,403 </td><td> 600,72 </td><td> 4,16 </td><td> 0,445 </td><td> 393,96 </td><td> 3,71 </td></tr><tr><td> Paziente 7 </td><td> 0,49 </td><td> 0,395 </td><td> 575,40 </td><td> 4,89 </td><td> 0,449 </td><td> 357,48 </td><td> 4,40 </td></tr><tr><td> Paziente 8 </td><td> 0,19 </td><td> 0,448 </td><td> 489,00 </td><td> 2,89 </td><td> 0,450 </td><td> 330,48 </td><td> 2,70 </td></tr><tr><td> Paziente 9 </td><td> 0,64 </td><td> 0,423 </td><td> 699,48 </td><td> 5,11 </td><td> 0,455 </td><td> 417,24 </td><td> 4,47 </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Attività FV in NHP e in 9 pazienti che hanno sviluppato coagulazione intravascolare disseminata (CID). L&#39;FV 1 stadio, 2 stadi, e l&#39;attività totale in NHP e 9 DIC plasma dei pazienti sono stati determinati dalla FV 1-stadio micropiastra saggio standard curva del tempo di formazione del coagulo vs attività FV (Figura 2A) e sono espressi in Unità / ml. Le tariffe iniziali (tasso iniziale di incremento A405nm su primi cinque punti di orario di mUnits / min) ed estensioni (Massimo A405nm - minimo A405nm) di formazione di coaguli nel FV 1 - e 2-fase di test vengono visualizzati anche micropiastra.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Questo studio descrive un nuovo metodo di analisi micropiastra che misura l&#39;attività di coagulazione FV durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano che non sono state precedentemente riportate. Il metodo utilizza un lettore di micropiastre cinetico per misurare continuamente la variazione di assorbanza a 405 nm durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano.

Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.8K Views.  University of Ontario Institute of Technology. Questo studio descrive un nuovo metodo di analisi micropiastra che misura l'attività di coagulazione FV durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano che non sono state precedentemente riportate. Il metodo utilizza un lettore di micropiastre cinetico per misurare continuamente la variazione di assorbanza a 405 nm durante la formazione di coaguli di fibrina nel plasma umano.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un metodo semplice ed efficace per rilevare l&#39;attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...