研究はオンタリオ工科（UOIT）の大学から博士ジョンA. SAMISとイリーナ·レヴィットに保健研究保健専門学生研究賞のカナダの協会にプロフェッショナル開発と研究のスタートアップ資金でサポートされていました。著者らは、ビデオを準備する彼女の援助のためのシャノンエベレット（教育および学習センター、UOIT）を認める。作者は彼の指導、洞察力、および有用な議論博士マイケルE. Nesheim（生化学科、オンクイーンズ大学、キングストンを）認める。著者はまた、研究で使用されDIC患者プラズマを提供するための博士チェンホック桃李（ロアルド·ダールの止血および血栓症センター、ロイヤル·リヴァプール大学病院、リヴァプール、イギリス）を認める。

<ol>
	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. 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H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

カイネティックマイクロプレートアッセイ法は、安価、迅速、小説の展開について概説、およびFv凝固活性を測定するための便利な手法ではない持っているヒト血漿の試料（FV 1段階アッセイ）で、または意図的に添加トロンビン（FVで活性化されている2段アッセイ）。アッセイは、キネティックマイクロプレートリーダーを利用し、必要なすべての材料および試薬は市販されているか、社内で行うことができる。アッセイは、継続的に405nmのフィブリン塊形成時のプラズマの光散乱の変化をモニタします。マイクロプレートアッセイは、小さな血漿サンプルボリューム（μl）を使用することの利点を持っており、同時に複数のサンプル（最大12）の分析のために適している。高価な機器や試薬は（自動分析および因子欠損プラズマ）を使用している場合は、これらのアッセイの属性が有利であり、わずかなサンプル量が利用可能です（患者プラズマ）またはFV浄化fの間に多数のサンプルを（分析ROMプラズマ）。 FVマイクロプレートアッセイは、高速、便利であることが追加された利点を持っており、必要な構成成分の単離·精製を必要としません。マニュアルチルトチューブ3、4と報告されている自動化された5月7日 、FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、血栓倍の匹敵する有用な範囲（25から75秒）と、試料中の対応するFVレベル（0.5から0.005単位を持っている/ ml）を加え、感度/検出限界（20〜80pM）。血栓形成3、4の主観的な視覚的評価に苦しむマニュアルチルトチューブFVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、凝固時間の客観的かつ定量的な測定は、初期速度、およびフィブリンクロット形成の程度を可能にします。 5月7日高価な分析器と試薬の要件に苦しむ自動FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイ試薬および材料は、安価であり、必要なすべての材料がpurchaかもしれません市販sedや社内で行われた。マニュアルチルトチューブ3、図4および5月7日自動FVアッセイは、一般のみ血栓形成のための時間を提供し、時間ではなく、初速度、およびすべての正確FVマイクロプレートアッセイに分光光度計で測定され、フィブリン塊形成の程度。最後に、3,4チルトチューブ、手動および自動の5から7のFVアッセイは血漿検体ずつではFV活性を測定することができるという苦しむ; FVマイクロプレートアッセイ、ハイスループットに従順であり、12のサンプルは、かもしれないのに対し、同時にアッセイ。 マイクロプレートアッセイは9 DIC患者プラズマにおけるFVは遅れのため凝固時間とFV 1段アッセイにおける血栓形成の低い初期レートの組み合わせのNHPに比べて活性が低かったことを証明するために使用されていました。 DIC患者プラズマにおけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期のレートはNHPから変更されていませんでした。 DIC patienにおける血栓形成のエクステントトンプラズマはまた、FV 1段と2段のアッセイでNHPから変更されていませんでした。減少し、FV 1段、2段、合計活動はこの買収血液疾患の病態時に他の研究に応じて増加FV消費19および/ ​​または不活化6に起因している可能性があります。 NHPで観察されたように、DICプラズマにおける血栓形成の程度を考えると同じだった、この変数には、最も可能性の高い患者プラズマの特性に関連し、FV欠乏血漿およびnot inフィブリノーゲン濃度の結果であった。 マイクロプレートアッセイからの結果は、ヒト血漿試料中のFV活性の測定は、時間とFV 1段アッセイとFV 2からの血栓形成および総活性の時から血栓形成の初期速度から得ることができることが示された - 段階アッセイ。これは、tの血栓形成の程度に基づいて、血漿試料中のFV活性の定量的な測定値を得ることができませんでした彼FV 1 - および2段アッセイまたはFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度。約0.35の血栓形成の同程度に達し、すべての反応を考えると - トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後、初期吸光度の間に0.45ユニットの前と最大の吸光度を、血栓形成の程度の測定がでFV活動の定量的評価を提供していません血漿試料を与えられた。 小説マイクロプレートアッセイは、ヒトおよび動物の血漿からの精製過程でヒト血漿と分数のサンプルではFV活性の測定のための研究と臨床の現場で使用されています。マイクロプレートアッセイは、時間、初期速度、及び血栓形成の程度を測定するために使用されるかもしれません。パラメータは、通常、手動チルトチューブアッセイおよび自動血液凝固分析器で同時に監視されません。この情報は、血栓形成イベント中にFVの関与を完全に定量的評価の多くを提供していますヒト血漿中には、以前よりも3-7を報告されている。血漿のサンプルにおいてまたは精製FVまたはFVAとFV活性の有意な変化を測定する際に、この情報は、研究と臨床検査室の両方で特に重要です。 FVマイクロプレートアッセイはまた、特徴づけ、測定FVおよびFVAをアクティブまたは非アクティブにすることができる化合物を、静脈血栓症のリスクがある患者では、FV活性を測定FVライデン変異の結果として、20、21との活動を監視するために使用されるかもしれませんプラズマからの精製中FV。 FVマイクロプレートアッセイは、適切な因子欠乏血漿を使用していて、フィブリン形成のための試薬を開始する外因性、内因性、または共通の経路に任意の凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。アッセイは、研究と臨床の研究室で、その活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。究極のLYは、この情報は積極的に早期診断やDICなど凝固障害、に苦しんで個人のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>キネティックマイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>スペクトラマックス190 </td><td> SOFTMAX PRO 4.3 LSのソフトウェア</td></tr><tr><td>通常のプールしたヒト標準血漿</td><td>精密バイオ</td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTAを</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-欠乏ヒト血漿4 </td><td></td><td></td><td>新鮮なヒト血漿から作られており、-70℃でアリコートに格納℃の</td></tr><tr><td> 3と60mLシリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585と136898 </td><td></td></tr><tr><td>バタフライ装置</td><td>バキュテイナー</td><td> 367251 </td><td> 20ゲージ</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー</td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td>トロンボプラスチン</td><td>トリニティバイオテック</td><td> T1106 </td><td>透析した対HBS、pHは7.4、-70℃でアリコートに格納℃、 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトトロンビン15 </td><td></td><td></td><td>ヒト血漿から、50％で-20℃（v / v）グリセロールで保存した。 </td></tr><tr><td>透析膜</td><td>フィッシャー</td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDaの分子量カットオフ; 50ミリメートル×3mの。 </td></tr><tr><td>テンプレートホルダーと取り外し可能な8ウェルストリップ。 </td><td>ヌンク</td><td> 14-245-63と469957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISAの洗浄トレー</td><td> BioRad社</td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml微量と15mlのスクリューキャップチューブ。 </td><td>ザルスタット</td><td> 72690と62554205 </td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 2703630 </td><td> 8チャンネルモデル。 </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

損傷に応答して、血液凝固が活性化され、凝固プロテアーゼ、トロンビンの生成をもたらす。トロンビンは、出血を停止不溶性血餅を形成するフィブリンにフィブリノゲンを切断する。その活性化された形態、FVA、でV因子（FV）はナーゼ 1、2の一部としてフィブリン塊形成時のトロンビン生成のプロテアーゼFXaおよびアクセラレータのための重要な補因子である。マニュアルのFVアッセイは3、4に記載されているが、彼 ​​らは時間を要し、主観的である。自動化されたFVアッセイは5-7報告されていますが、アナライザおよび試薬は高価であり、一般的に凝固時間ではなく、フィブリン形成の速度と程度を提供してきた。マイクロプラットフォームがあるため利便性の酵素触媒イベントを測定するために好まれる、時間、コスト、小音量、継続的監視、9、8、高スループット。マイクロプレートアッセイは、血栓溶解10、血小板凝集のために報告されている11、および凝固因子12ではなく、ヒト血漿中のFV活性のために。メソッドの目的は、ヒト血漿中のフィブリン形成時のFV活性を測定マイクロプレートアッセイを開発することでした。 この小説マイクロプレート法は、ヒト血漿中のFV活性の、シンプルで安価、かつ迅速な分析方法を概説します。アッセイは、ヒト血漿中のフィブリン形成（ 図1）は、13時の405nmの吸光度変化を監視するために運動をマイクロプレートリーダーを利用しています。アッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。これは、プラズマの唯一の添加量が必要で6分で完了し、高スループットであり、24 80pM FVに敏感であり、意図せずに活性化量（1段活性）とトロンビン活性化FV（2段活性を測定1段活動） - ）は、その合計機能活性（2段活動の完全な評価を得ることができる。 播種intravascular凝固症候群（DIC）が最も多く、既存の感染症14から発達取得凝固障害である。 DICは、既存の病理15上記の予後不良と増加の死亡率に関連付けられています。アッセイは、DIC、FV 1段、2段、合計活動患者9例で、通常のプールされたヒトと比較して、それぞれ、54％、44％、42％、平均的には、減少していたことを示すために使用されました参照血漿（NHP）。 FVマイクロプレートアッセイは、どの凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。このアッセイは、研究と臨床の現場での活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。この情報は、積極的に早期診断やDICなど凝固障害、のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。

代表的な結果 - FV 1段マイクロ凝固アッセイアクティビティ標準曲線の作製マイクロプレートリーダーを用いて生成された時間以上のFVアッセイにおけるフィブリン血栓形成の代表的な例を図1に示します。 FVアッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。アッセイの終了時に井戸の検査は血栓形成が起きていることを確認した。以前に開始された吸光度とトロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後の最大吸光度の間に0.45単位 - 全ての反応は0.35の405nmでの吸光度の一般的な変化に伴う血栓形成とほぼ同じ程度に達した。 FVの代表的な例としては、1段ログクロット時間の活動の標準曲線（秒単位）とログのFV活性（単位/ ml）と血栓形成の初期速度をログに記録する（mUnits /分）とログのFV活性（単位/ ml NHPの連続希釈用）は、以下の例で示され<stronそれぞれグラム&gt;図2Aおよび図2B、。 FV対凝固時間のlog-logプロットをフィット1-活性（ 図2A、R 2 = 0.980）線形回帰分析の後に、これらの変数の間に強い関係を示した。 FV活動対血栓形成の初期速度のlog-logプロットをフィッティングすることも（であり、R 2 = 0.983 図2B）線形回帰分析した後、これらの変数の間に強い関係を示した。両方のログ餅時間の関係と初期血栓形成のレート対ログFVのアクティビティをログには、512倍まで希釈NHPに対してリニアに推移しました。 FVは約12-40nmの16でNHPに循環するので、マイクロプレートアッセイはNHPで約24 80pM FVに敏感です。 ナーゼでFVA-FXA-脂質の相互作用の解離定数は約1nmの17であることを考えると、FVマイクロプレートアッセイは、生理学的にrelevanでFVレベルの測定のために完全に適していますナーゼでFVA関数のtのnM範囲。 FVマイクロプレートアッセイを使用して、それはまた、15人の健康な対照プラズマのFV 1段活性アッセイ（男性と女性、年齢18-20yrs）でFV活動の正常範囲（平均値±標準偏差、範囲）であったことが判明した： 0.96±0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml。これはカトラーらによって報告され、通常の健康なFVの活動および範囲（0.66-1.14U/ml）とよく一致している。自動分析装置7で決定FV 1段活性のために。時間のアッセイ内変動性、範囲、および8つの異なる日に6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ3.4％、4.4％、および3.1％であった。時間のアッセイ間変動性、範囲、および8つの異なる日には8つの異なる実験の6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ7.1％、7.8％、および9.2％であった。したがって、これら3 measuのイントラ及びアッセイ間変動性赤変数（最大12）内と、同時に複数のサンプルのマイクロプレートアッセイの間に強固なアッセイ性能は低く、許容できるレベルであった。 代表的な結果 - FV 1段と2段のマイクロ凝固アッセイによるヒト血漿サンプルをアッセイログ餅時間とログのFV活性の標準曲線（ 図2A）を意図的に添加されたトロンビン（FV 1段活性）により活性化されていなかったか、意図的に活性化したNHPと9 DIC患者プラズマ中のFV活性を測定するために使用されたトロンビン（FV 2段活性）を追加し、結果を表1に示す。全9 DIC患者プラズマは、FV 1ステージ活動およびNHPから、それぞれ、54％、18％、平均で減少した血栓形成の初期速度を示した。 DIC患者におけるFV 1段階アッセイにおける血栓形成のエクステントがNHPと大きく異なっていなかった、とNHPから13％、平均で増加した。 <html>トロンビンとNHPのアクティベーションは、FVで約8倍に増加して生成されたFV 1段階の活動（表1）上記2段活動。これはNHPでFVはその活性化されていない形で主に存在していたと5-7マニュアルチルトチューブFVアッセイ3,4、および自動FVアッセイを使用して以前に報告された結果と一致することを示しています。 FV 2段、総活性はまた、NHPから、それぞれ、44％および42％、平均でDIC患者で減少した。 DIC患者におけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度、エクステントはNHPで観察されたものから、それぞれ、NHPから有意差は認められなかったと、約9％と4％で、平均的に変化した。これらの結果は、NHPでFVと比べて、DIC患者プラズマにおけるFVは長時間をもたらし、フィブリン塊形成の速度を低下させ、患者FVは同様にトロンビンで活性化可能なように、平均でわずか56％であったことが示された。 ENT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="図1" /> 図1運動マイクロFV 1段階凝固アッセイを用いて測定し、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成。 NHPにおけるフィブリン血栓形成を連続キネティックマイクロプレートリーダーを用いて405nmでモニターした。プロットはウェルマイクロプレートでFV欠乏血漿、トロンボプラスチン、塩化カルシウム、32倍希釈したNHPの6分間反応のマイクロプレートリーダーの出力です。縦軸は、血漿中のフィブリン形成の結果として発生した波長405nmにおける吸光度の変化を表しています。フィブリン形成の時間は吸光度や曲線の中点（36.40秒）の半分の最大増加に達するまでの時間として定義されていました。血栓形成の初期速度は曲線（611.88 mUnits /分）の吸光度の部分の線形増加の最初の5つの時点にわたって405nmでの吸光度の変化率と定義した。前の血栓形成のテントは405 nm（0.35単位）での最大値と最小値の吸光度の差として定義されていました。 <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：時間とFV 1段マイクロプレートアッセイを使用して、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成対V因子活性の初期速度の標準曲線。 NHPは連続的に希釈した（0から512倍までHBS中）され、プロトコルで説明したように、FV 1段マイクロプレートアッセイでアッセイ。 FV 1段マイクロプレートアッセイにおける血栓形成対FV活動の時間と初期速度のlog-logプロットはそれぞれ、パネルAおよびBのデータの線形回帰モデルの後に表示されています。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> 1段アッセイ活性（単位/ ml） </td><td> 1段アッセイ範囲（単位） </td><tD&gt; 1段検定初速度（mUnits /分） </td><td> 2段検定アクティビティ（単位/ ml） </td><td> 2段アッセイ範囲（単位） </td><td> 2段検定初速度（mUnits /分） </td><td> 総活性（単位/ ml） </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> 患者1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> 患者2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt;患者3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> 患者4 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 患者5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> 患者6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 患者7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> 患者8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> 患者9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> 表1 NHPと播種性血管内凝固症候群（DIC）を開発9患者におけるFVの活動。FV 1段、2段、およびNHPと9 DIC患者プラズマの総活性は、FV 1段マイクロプレートアッセイ標準から決定した血栓形成対FV活動の時間の曲線（ 図2A）と単位/ mlで与えられる。初期速度（mUnits /分の最初の5つの時間点以上A405nmの増加の初期速度）およびエクステント（最大A405nm - 最小A40FV 1における血栓形成の5nmの） - および2段マイクロプレートアッセイも示されている。

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.9K ビュー.  University of Ontario Institute of Technology. この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

蛍光灯<em&gt;その場で</em蚊の分裂期染色体上&gt;ハイブリダイゼーション

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...