Araştırma Mesleki Gelişim ve Araştırma Başlatma Fonları Teknoloji Ontario Enstitüsü (UOIT) arasında Üniversitesi&#39;nden Dr John A. Samis ve Irina Levit için Sağlık Araştırması Sağlık Profesyonel Öğrenci Araştırma Ödülü Kanadalı Enstitüleri ile desteklenmiştir. Yazarlar videoyu hazırlarken ona yardım için Shannon Everett (Öğretme ve Öğrenme Merkezi, UOIT) kabul etmektesiniz. Yazarlar kendi rehberlik, içgörü ve yararlı tartışmalar için Dr Michael E. Nesheim (Biyokimya Anabilim Dalı, ON Queen Üniversitesi, Kingston) kabul etmektesiniz. Yazarlar ayrıca çalışmada kullanılan DIC hasta plazmaları sağlamak için Dr Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostaz ve Tromboz Merkezi, Royal Liverpool Üniversite Hastanesi, Liverpool, İngiltere) kabul etmektesiniz.

1. FV-eksik İnsan Plazma hazırlanması <ol><li> Bu yöntem, ilk olarak Bloom ve ark 4 tarafından anlatılan prosedür bir modifikasyonudur. </li><li> Herhangi bir ilaç almayan - bir rıza sağlıklı erişkin gönüllü (50 yaş Bay veya Bayan, yaş 18) tam insan kanı edinin. Lateks eldiven ve işlem boyunca bir laboratuar ceket giyin. </li><li> % 3.2 (w / v) distile su içinde trisodyum sitrat, 100 ml hazırlayın. Ayrı bir 60 ml şırıngalar içine Bu çözeltinin 6.0 ml yerleştirin. Dikkatle şırınga 6.0 ml işaretine karartıcı piston tarafından havaya çıkarın. </li><li> Pazı ve önkol arasındaki kübital damarın alanını temizlemek için alkol bezi kullanın. 3 ml şırınga ile 20 gauge kelebek cihazları bağlayın. Kübital vene kelebek iğne takın ve kan 3 mL işaretine doldurana kadar pistonu hafifçe çizin. Kan şırınga atın. Bu adım iğnede hasarlı endotel salınan herhangi bir doku faktörü kaldırmak için yapılırpıhtılaşma sürecini etkinleştirmek ve FV-yoksun plazma hazırlanması uğratabilecek yaralanma sitesi. </li><li> Kelebek iğne 60 ml şırınga ile &#39;yüklü&#39; 6.0 ml trisodyum sitrat bağlanın ve kan şırınga 60 ml işaretine kadar pistonu hafifçe çizin. (Final sitrat konsantrasyonu 10.9mm). </li><li> Kelebek iğne şırınga çıkarın ve şırınga çıkışında eldivenli parmak veya başparmak tutarken yavaşça şırınga karıştırın. </li><li> 60 ml şırıngalar yukarıda tarif edildiği gibi% 3.2 trisodyum sitrat 6.0 ml ile doldurulmuş her biri içine kan çizim devam edin. Bir santrifüj sonrasında ve FV-eksik plazma 50 ul tahlil mikroplaka Her örnek için gerekli olan plazma gibi sitratlı kan hacminin yaklaşık olarak% 50 iyileşme tahmin etmek gerekir. Laboratuvarımız rutin% 3.2 trisodyum sitrat / şırınga 6.0 ml 5-7 x 60 ml şırınga kullanarak bir kerede sitratlı kan 300-420 ml işler. Bu yaklaşık 3,000 mikro için yeterli FV-yoksun plazma olduğunuplaka testler (aşağıya bakınız). </li><li> Gönüllü kolundan kelebek iğne çıkarın ve 1.0 dakika ven ponksiyonu site üzerinde steril bir gazlı bezle basın. Steril bir bandaj ile ven ponksiyonu site kaplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 3,300 x g sitratlı kan santrifüjleyin. Düşük kırmızı ve beyaz kan hücre tabakası rahatsız özen plastik transfer pipet kullanarak bir karıştırıcı ile plastik bir behere üst sarı plazma katmanı kurtarın. </li><li> Tedbir ml plazma hacmi ve gelecekteki protrombin pıhtı zamanı (PT) testi (aşağıya bakınız) için buz üzerinde EDTA eklenmesinden önce plazma 100 ul saklayın. </li><li> Yavaş yavaş 5mM elde etmek için, oda sıcaklığında nazik karıştırma ile sitratlı plazma için katı EDTA ilave edin (nihai konsantrasyon). EDTA çözündükten sonra, yumuşak bir karıştırma ile damla damla 1.0M NaOH çözeltisi ilave edilerek pH değeri 7.0 &#39;a ayarlayın. </li><li> 37 karıştırmadan 8-10 saat süreyle Saran Wrap ve inkübe ile kabı Kapak ° C </li><li> Her 2 saat, 100 ul kurtarmakEDTA ile tedavi edilen buz üzerinde plazma ve EDTA ile kuluçka sırasında PT belirlenmesi ve önceden EDTA ilavesi (yukarıya bakınız) için plazma PT ile karşılaştırın. </li><li> PT tespitler için mikroplak okuyucu içine plastik şablonu tutucu ve uç içine yer çıkarılabilir 8 de immunomodule şeritler. </li><li> Olarak mikroplak okuyucu Orient immunomodule şeritler: boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, numune içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için boş ve soldan şablon sahibinin sağ boş. Ayrıca, plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her 8 sıra immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın. </li><li> FV mikroplate assay aynı anda en az 12 farklı örnekleri (2 immunomodule şeritlerinüzerindeki immunomodule şerit başına 6 adet) fibrin pıhtı oluşumu ölçme yeteneğine sahiptir. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, için 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mm NaCl, pH 7.4) eklemekHer mikroplak örneğin her test edilmesi için. Tek bir pipet kullanarak, mikroplak kuyu ayırmak için EDTA ekledikten sonra EDTA ilavesinden önce veya çeşitli inkübasyon zamanlarda normal insan toplanmış referans plazma (NSP) veya plazma 50 ul ekleyin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, test edilecek plazma ile tüm mikroplak kuyularına 50 ul tromboplastin (hazırlama yöntemi için aşağıya bakın) ekleyin. 1 dakika ile 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için programı mikroplaka okuyucu için 25 ° C sıcaklıkta mikroplaka okuyucu içinde inkübe edin. </li><li> Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm dalga boyu için, Kinetik, sıcaklık moduna ila 25 ° C, ve program mikroplaka okuyucu 5 saniye için çalkalanır, ve 6 dakika boyunca her 5 saniyede 405nm de absorbans okumak için. Için okuyucu ayarlama </li><li> 2.1mm fina; çok kanallı pipet kullanarak, (distile su 25mM 50 ul kalsiyum klorür ekleyinl konsantrasyon) mikroplak kuyu tümüne, 15 saniye bekleyin ve test başlamak için mikroplak SoftMax Pro menüsünden &#39;Başlat&#39; simgesine basın. </li><li> Zaman 405nm de absorbans yarısı maksimal artış (tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra üretilen Sigmoidal Absorbans vs Zaman eğrisinin orta noktası. Aşağıya bakınız, ulaşmak gibi SoftMax Pro Absorbans vs Zaman profillerden ÖLÇÜMÜ belirleyin Şekil 1). </li><li> Şekil 2A, aşağıda gösterildiği gibi Günlükler Pıhtı Süresi (sn) vs Günlükler FV Aktivitesi (Units / ml) FV 1 aşamalı aktivite hesaplayın. Kantitatif amaçlar için, FV aktivite 1unit önce eklendi trombin (FV 1-grup ve 2 aşamalı mikrolevha pıhtılaşma deneyi ile insan plazma numuneleri test edilmesi, aşağıya bakınız) ile kasıtlı aktivasyonu için 1.0 ml NHP içinde bir etkinliğinin söz konusu olduğu gibi tanımlanır. </li><li> Nazik karıştırma ile distile su 0.15m NaCl içeren 20 mM HEPES ve 4.0L hazırlayın. Yavaş dropw ile 7.4 pH ayarlama5.0M NaOH ilave ISE (HBS, pH 7.4). </li><li> Diyaliz boruları yeterli uzunlukta elde edilir ve distile su ile iyice durulayın. Hortumun bir ucunu bir düğüm. Transferi EDTA plastik bir transfer pipet ile diyaliz tüp plazma tedavi, havayı çıkarmak ve boru diğer ucunu bir düğüm. </li><li> Dikkatlice nazik karıştırma ile HBS içine tüp EDTA-tedavi plazma asın. Saran Wrap ile kaplayın ve 4 ° C&#39;de hafif karıştırma ile 14-16h için dialyze </li><li> Dikkatlice 15.0 ml vidalı kapaklı tüplere 3,0 ml alikotları EDTA-treated/dialyzed plazma çıkarın ve buz üzerinde &#39;final&#39; FV-yoksun plazma PT testi için 100 ul saklayın. -80 ° C Kullanım kadar içeri FV-yoksun plazma saklayın. Yukarıda tarif edilen koşullar altında, EDTA ilave edildikten sonra 90-100 saniye 8-10 saat için EDTA ilave edilmeden önce 10-15 sn &#39;den ÖLÇÜMÜ artar. Bu metod ile hazırlanan FV-eksikliği olan plazma rutin olarak aktif başlangıç ​​FV mevcut az% 0.1 &#39;den içerirtaze insan plazma. </li></ol> 2. Tromboplastin hazırlanması <ol><li> Diyaliz pıhtılaşma sürecini başlatmak için kalsiyum klorür ilave bir zaman tam zamanlama fibrin pıhtısı oluşumu izin vermek için bu reaktif herhangi bir kalsiyum kaldırmak için gereklidir. </li><li> Hafif karıştırarak, bir plastik beher içinde damıtılmış su içinde 100 ml ve 4.0L 20 mM HEPES ve 0.15m NaCl hazırlayın. 5.0M NaOH (HBS, pH 7.4) yavaş yavaş damla damla ilavesi ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. </li><li> Tromboplastin reaktifi her flakon HBS, pH 7.4, 6.0 ml ekleyin, kapağı değiştirin ve çözünmesi için yavaşça sallayın. Kuruyan malzeme çözünmesi için oda sıcaklığında 15 dakika için kapaklı şişe içinde reaktif inkübe edin. Tamamen çözünmesi için yavaşça sallayın. </li><li> , Diyaliz tüp yeterli uzunlukta kesin distile su ile iyice durulayın ve bir düğümle Hortumun bir ucunu kapalı kravat. Diyaliz hortumuna tromboplastin aktarın, hava kaldırmak ve bir düğümle Hortumun diğer ucunu kapalı kravat. </li><li> Carefully HBS, pH 7.4 4.0L diyaliz tüp takılmak ve yavaşça 14-16 saat süreyle 4 ° C&#39;de Saran Wrap ile kaplı karıştırın. </li><li> Kullanılan ° C kadar -80 15 ml vidalı kapaklı tüpler ve mağaza diyalizlenmiş tromboplastin 3.0 ml alikotları aktarın. </li></ol> 3. FV Hazırlık 1-aşamalı Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Aktivite Standart Eğriler <ol><li> 10 dk için 37 ° C &#39;de FV-eksik plazma, NHP, ve tromboplastin çözülme. Yavaşça, bağımsız FV-yoksun plazma ve tromboplastin karıştırın plastik çamaşır tepsiler ayırmak aktarmak ve buz üzerinde inkübe edin. Hafifçe karıştırıldıktan sonra buz üzerinde NSP saklayın. Oda sıcaklığında ayrı bir yıkama tepsi muhafaza kalsiyum klorür (distile su içinde 25mM). </li><li> , - 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256-200 ul 0 ila NHP 2-kat seri seyreltiler, her bir hazırlama, HBS içinde 512-kat, pH 7.4 içinde 1.5 kullanarak ml mikrosantrifüj tüpleri. Iyi Vortex ve buz üzerinde inkübe edin. </li><li> P içine çıkarılabilir 8 sıra immunomodule şeritler yerleştirinmikroplaka okuyucu Lastic şablonu tutucu ve uç. </li><li> Olarak mikroplak okuyucu Orient immunomodule şeritler: boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, numune içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için boş ve soldan şablon sahibinin sağ boş. Ayrıca, plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her 8 sıra immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın. </li><li> FV mikroplate assay aynı anda en az 12 farklı örnekleri (2 immunomodule şeritlerinüzerindeki immunomodule şerit başına 6 adet) fibrin pıhtı oluşumu ölçme yeteneğine sahiptir. </li><li> Mikroplaka okuyucu ve erişim SoftMax Pro mikroplak uygulama yazılımı açın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune mikroplak kuyularına FV-yoksun plazma (50 ul) eşzamanlı ekleme yapmak. Mikroplaka kuyu ayırmak için yukarıda hazırlanan NSP&#39;nin 10 seri dilüsyonları 50 ul ekle, tek bir pipet kullanın.</li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune kuyuları için tromboplastin (50 ul) ekleyin. 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için 1 dakika ve program mikroplaka okuyucu için 25 mikroplaka okuyucu ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm için Dalgaboyu, Kinetik, 25 ° bundan sonra 6 dakika boyunca her 5 sn 405nm C ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra ilk 5 saniye boyunca sallamak programı mikroplak okuyucu ve önlem absorbans. Moduna okuyucu ayarlayın 5 sn sallayarak aralığı (bakınız aşağıda) hesaplanan pıhtı zamanlar dahil değildir. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, kalsiyum klorür (distile su 25mM 50 ul; final konsantrasyon 3.5mm) eklemek tüm numune mikroplak kuyularına, başlamak için bilgisayardan 15 saniye basın SoftMax Pro mikroplak uygulamasında &#39;Başlat&#39; simgesini bekleyin tahlil. </li><li> TO pıhtı kez tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra 405nm de minimum ve maksimum absorbans arasındaki orta ulaşmak için saniye zaman olarak hesaplanır. </li><li> Pıhtı oluşumunun başlangıç ​​oranları absorbans vs zaman eğrisinin doğrusal kısmı içinde pıhtı oluşumu ilk 5 zaman noktalarında kapsamaktadır 405nm absorbanstaki artış oranı (mUnits / dk) olarak hesaplanır. </li><li> Pıhtı oluşumu ölçüde pıhtı oluşumu olay sırasında elde 405nm (Adet) de maksimal ve minimal absorbans arasındaki fark olarak hesaplanmıştır. </li></ol> 4. FV 1-evre ve 2 aşamalı Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz İnsan Plazma Örnekleri assaying <ol><li> 10 dk için 37 ° C &#39;de FV-eksik plazma, NHP, örnek plazmalar, ve tromboplastin çözülme. Yavaşça, bağımsız FV-yoksun plazma ve tromboplastin karıştırın plastik ELISA yıkama tepsiler ayırmak aktarmak ve buz üzerinde inkübe edin. Buz üzerinde NSP ve örnek plazmalar Mağazahafifçe karıştırıldıktan sonra. Oda sıcaklığında ayrı bir ELISA tepsisine yıkama muhafaza kalsiyum klorür (distile su içinde 25mM). </li><li> 200 ul 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak HBS, pH 7.4 &#39;te NSP ve örnek plazmasının 40 kat dilüsyonlarının her hazırlayın. Iyi Vortex ve buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Plastik şablonu yuvaya çıkarılabilir 8 sıra immunomodule şeritler yerleştirin ve mikroplaka okuyucu takın. </li><li> Soldan örnek içeren şeritler komşu ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için şablon sahibinin sağ Alternatif boş, boş, örnek, boş, boş, örnek, boş ve boş immunomodule şeritler. Plastik şablon sahibinin kenarlarından ışık saçılımı girişimi en aza indirmek için her immunomodule şeridi yukarıdan sadece kuyu 2-7 kullanın. </li><li> Mikroplaka okuyucu ve erişim SoftMax Pro mikroplak uygulama yazılımı açın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune mikroplak kuyularına FV-yoksun plazma (50 ul) ekleyin. Bir singl kullanmae pipetle, 40-kat seyreltilmiş NHP veya mikroplaka kuyu ayırmak için yukarıda belirtildiği gibi hazırlanan örnek plazmasının 50 ul ilave edin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm numune kuyuları için tromboplastin (50 ul) ekleyin. 1 dakika inkübasyondan 15-25 saniye boyunca plaka sallamak için 1 dakika ve program mikroplaka okuyucu için 25 mikroplaka okuyucu ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Mikroplaka okuyucu, erişim SoftMax Pro yazılımı mikroplak uygulaması ile arabirim bilgisayar kullanma. Absorbans, 405nm için Dalgaboyu, Kinetik, 25 ° bundan sonra 6 dakika boyunca her 5 sn 405nm C ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra ilk 5 saniye boyunca sallamak programı mikroplak okuyucu ve önlem absorbans. Moduna okuyucu ayarlayın 5 sn sallayarak aralığı (bakınız aşağıda) hesaplanan pıhtı zamanlar dahil değildir. </li><li> Tüm örnek mikroplak kuyularına ve hemen pr; çok kanallı pipet kullanarak, kalsiyum klorür (6.25mM nihai konsantrasyon distile su 25mM 50 ul) ekleyintahlil başlamak için bilgisayardan SoftMax Pro mikroplak uygulamasında &#39;Başlat&#39; simgesi ess. </li><li> Çalışma sonunda, zaman, ilk oran ve SoftMax Pro de absorbans-zaman profilleri ile 40-kat seyreltilmekte ve NHP örnek için plazma pıhtı oluşumu miktarını belirler. </li><li> Hesaba 40 kat seyreltme alarak, Birimleri / FV Günlükler Pıhtı Zaman vs Günlükler FV Aktivitesi (Şekil 2A) 1-evre aktivitesi standart eğriden ml FV aktivite hesaplamak için her bir örnek için pıhtı zaman kullanabilirsiniz. Bu trombin tarafından &#39;kasten&#39; aktivasyonsuz FV-1 aşama aktivite ya da temsil eder. </li><li> FV aktif kofaktör ile trombin ile aktive olduğu için, FVa 1, trombin ile ilave edildi ve inkübasyon sonrasında ikinci bir tahlil doğru bir plazma numunesinin FV 2-kademeli aktivitesi (trombin ile katma &quot;kasıtlı &#39;aktivasyon ile) ölçmek için çok önemlidir. </li><li> FV 2-aşamalı yöntem için, trombin 18 saflaştırılmış 200-300 ul hazırlamakt HBS, pH 7.4 &#39;te 100nM ve buz üzerinde inkübe edin. FV 2-aşamalı yöntem ile test edilecek her plazma örneği için seyreltilmiş trombin 10 ul kullanmayı planlayın. </li><li> 2.8mm kalsiyum klorür içeren HBS, pH 7.4 içinde 170 ul ile 100-kat ila 40 kat dan yukarıda NHP ve örnek plazmasının 120 ul seyreltin. Her bir örnek için 10 ul trombin (10nm nihai konsantrasyon) ilave edilir. Girdap da 1 dakika için 37 ° C sıcaklıkta karıştırılır ve inkübe etmek. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi aşama 1-mikrolevha tahlil FV içinde her bir plazma örneği 50 ul HBS, pH 7.4, 400 ul ekleyerek, girdap de, ve tahlil ile 500-kat için NHP ve örnek plazma seyreltilir. </li><li> NHP ve SoftMax Pro Absorbans vs Zaman profilleri tahlil her plazma numune için pıhtı zamanı belirleyin. Hesaba 500 kat seyreltme alarak, FV FV 2 aşamalı aktivite hesaplamak için her bir örnek için pıhtı zaman kullanabilirsiniz Günlükler Pıhtı Zaman vs Günlükler FV Faaliyet 1-kademeli standart eğrisi (Şekil 2A). </li><li> Toplam FV aktivitelerFV 1 aşamalı aktivite - ty sonra FV 2 aşamalı faaliyet olarak hesaplanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factor+V+activation+paradox.">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li><li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa.">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li><li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V.">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li><li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma.">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis.">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li><li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation.">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li><li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency.">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li><li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol.">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li><li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays.">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li><li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates.">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li><li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies.">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li><li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+coagulation+assays.">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li><li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma.">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li><li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation.">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li><li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation:+Findings+in+346+patients.">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li><li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets.">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li><li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+prothrombinase+complex.">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li><li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+TAFI,+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor.">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li><li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disseminated+intravascular+coagulation+(DIC).">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li><li>Dahlb&#228;ck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C:+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C.">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li><li>Dahlb&#228;ck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders.">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kinetik mikroplate assay yöntemi bir roman, yok (FV 1-aşamalı yöntem) veya insan plazma örnekleri FV koagülasyon aktivitesi ölçümü için, hızlı, ucuz ve uygun tekniğin gelişimi özetliyor bilerek katma trombin (FV ile aktive edilmiştir 2-aşamalı yöntem). Tahlil, bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır ve gerekli olan tüm malzemeleri ve reaktifler, ticari olarak temin edilebilir ya da in-house yapılabilir. Tahlil sürekli 405nm de fibrin pıhtı oluşumu sırasında plazma ışık saçma değişikliğini takip. Mikroplate assay küçük plazma numune hacimleri (ul) kullanmanın avantajı vardır ve aynı anda birden fazla örnekleri (12) analizi için müsait olduğunu. Pahalı ekipman ve reaktifler (Otomatik analizör ve Faktör-eksik plazmalar) kullanıldığında bu tahlil öznitelikler avantajlıdır; sadece küçük bir örnek hacimleri mevcuttur (Hasta plazmalar) veya FV arıtma f sırasında örnekleri çok sayıda (analizrom plazma). FV mikroplaka tahlil, hızlı ve uygun olduğu ilave avantajlara sahiptir, ve gerekli kurucu bileşenlerin izolasyon ve saflaştırma gerekli değildir. Manuel eğim tüpü 3, 4 ve rapor edilmiştir otomatikleştirilmiş 5-7 FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı kez karşılaştırılabilir yararlı aralığı (25-75 sn) ve örnek gelen FV düzeyleri (0,5-,005 Birimleri var / ml) ve duyarlılık / algılama sınırları (20-80pM). Pıhtı oluşumunu 3, 4 öznel bir görsel değerlendirme muzdarip manuel eğim-tüp FV deneyleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplate assay pıhtı zaman objektif ve kantitatif ölçümü, başlangıç ​​hızı, ve fibrin pıhtı oluşumu ölçüde izin verir. 5-7 pahalı analizörleri ve reaktiflerin gereksinimi muzdarip otomatik FV testleri ile karşılaştırıldığında, FV mikroplak test reaktifleri ve malzeme ucuz ve gerekli tüm malzemeleri purcha olabilirticari sed veya evde yapılmış. Elle eğim tüpü 3, 4 ve otomatik 5-7 FV deneyler genellikle sadece pıhtı oluşumu için zaman sağlanır; değil süresi, başlangıç ​​hızı, ve tüm doğru FV mikroplate assay ile spektrofotometrik olarak ölçülür fibrin pıhtısı oluşumu derecesi. Son olarak, 3,4 eğim tüpü manuel ve otomatik 5-7 FV deneyleri sadece plazma örnekleri bir defada biri FV aktivitesini ölçmek edememek muzdarip; FV mikroplate assay high-throughput mükellef olup 12 örnek olabilir oysa aynı anda test. Mikroplaka tahlil 9 DIC hasta plazmalardaki FV çünkü gecikmeli pıhtı kez ve FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu daha düşük başlangıç ​​oranları bir bileşimi NHP içinde daha az aktif olduğunu göstermek için kullanılmıştır. DIC hasta plazmalarda FV 2-aşamalı yöntem pıhtı oluşumunun başlangıç ​​hızları NSP değişti değildi. DIC patien içinde pıhtı oluşumu uzantılart plazmalar da FV 1-evre ve 2 aşamalı deneylerde NSP değişti değildi. FV Azalmış 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri bu kazanılmış kan bozukluğu patogenezinde sırasında diğer çalışmalara göre artan FV tüketimi 19 ve / veya inaktivasyonu 6 nedeniyle olmuş olabilir. DIC Plazma içinde pıhtı oluşumu dereceye kadar NHP ile gözlenen aynı olduğu göz önüne alındığında, bu değişken en FV-eksik plazma fibrinojen konsantrasyonu sonucunda muhtemel ve hastanın plazmasının özellikleri ile ilgili değildir. Mikroplak tahlilinden gelen sonuçlar, insan plazma örnekleri içinde FV aktivite ölçümü FV 1-aşamalı yöntem gelen pıhtı oluşumu zamanı ve başlangıç ​​hızı ve FV 2 pıhtı oluşumu ve toplam aktivite süresi elde edilebilir belirtilmedikçe - aşamalı yöntem. Bu t pıhtı oluşumu ölçüde dayalı bir plazma örneği FV aktivitesinin kantitatif ölçümü elde etmek mümkün değildio FV 1 - ve 2 aşamalı deneyleri ya da FV 2-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumunun başlangıç ​​hızı. Tüm reaksiyonlar yaklaşık 0.35 pıhtı oluşumu aynı ölçüde ulaştı Verilen - öncesi başlangıç ​​absorbansı ve tromboplastin ve kalsiyum klorür ilavesinden sonra maksimal absorbans arasındaki 0.45 Üniteleri, pıhtı oluşumu ölçüde ölçümü FV aktivitesinin kantitatif değerlendirmesini sağlamaz plazma örneği verilmiştir. Roman mikroplate assay insan ve hayvan plazma kendi arıtma sırasında insan plazma ve kesirler örnekleri FV aktivitesi ölçümü için araştırma ve klinik ortamlarda kullanımı bulacaksınız. Mikroplate assay zaman, ilk oran ve pıhtı oluşumunu ölçmek için kullanılmaktadır edilebilir; parametreler, genellikle manuel eğim tüpü deneyleri ve otomatik analiz eş zamanlı olarak pıhtılaşma denetlenmemektedir. Bu bilgiler, pıhtı oluşumu olay sırasında FV tutulumu tam bir nicel değerlendirmenin fazlasını sağlarinsan plazması içinde daha önceden 3-7 rapor edilmiştir. Plazma örneklerinde FV aktivite veya FV veya FVa saflaştırılmış ile önemli değişiklik ölçerken Bu bilgiler araştırma ve klinik laboratuvarlarda hem de özellikle önemlidir. FV mikroplate assay da belirlerler ve ölçmek FV ve FVa etkinleştirmek veya inaktive olabilir bileşikler, venöz tromboz riski olan hastalarda FV aktivitesini ölçmek mutasyonun bir sonucu olarak 20, 21 ve etkinliğini izlemek için kullanılan olabilir plazmadan kendi arıtma sırasında FV. FV mikroplate assay uygun etken eksikliği olan plazma kullanılarak ve fibrin oluşumunun başlatılması için reaktifler dış, içsel, ya da ortak bir yoldan herhangi bir pıhtılaşma faktörü etkinliği ölçmek için kolaylıkla uyarlanabilir. Tahlil araştırma ve klinik laboratuvarlar faaliyetinin daha doğru ve eksiksiz bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Nihaily, bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi koagülasyon bozuklukları ile tutulmuş bireyler için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorum (İsteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Kinetik mikroplak okuyucu </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> SoftMax Pro 4.3 LS yazılımı </td></tr><tr><td> Normal havuzlanmış insan referans plazma </td><td> Hassas Biyolojik </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trisodyum sitrat </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-eksik insan plazma 4 </td><td></td><td></td><td> Taze insan plazma yapılmış ve -70 alikots içinde saklanmıştır ° C. </td></tr><tr><td> 3 ve 60ml şırınga </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309.585 ve 136.898 </td><td></td></tr><tr><td> Kelebek aparatı </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 çap </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Tromboplastin </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Diyalizlenmiş vs HBS, pH 7.4 ve -70 alikots içinde saklanmıştır ° C. </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan trombin 15 </td><td></td><td></td><td> İnsan plazmasından, en az% 50 içinde -20 ° C (v / v) gliserol depolanır. </td></tr><tr><td> Diyaliz membran </td><td> Balıkçı </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa moleküler ağırlık kesim; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Şablon tutucu ve çıkarılabilir 8 de şeritler. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 ve 469.957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISA yıkama tekneleri </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml mikrofuge&#39;de ve 15 ml vidalı kapaklı tüpler. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 ve 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Kanallı pipet </td><td> Balıkçı </td><td> 2703630 </td><td> 8 kanal modeli. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

Hasarına yanıt olarak, kan pıhtılaşma aktive edilir ve pıhtılaşma proteaz, trombin oluşumu ile sonuçlanır edilir. Fibrinojenin Trombin parçalayarak fibrinojen hangi kanama durur çözülmeyen bir pıhtı oluşturur. Onun aktif formu, FVa, faktör V (FV) protrombinaz 1, 2 bir parçası olarak fibrin pıhtısı oluşumu sırasında Trombin üretiminin proteaz FXa ve hızlandırıcı için kritik bir kofaktörüdür. Manuel FV deneyleri 3, 4 tarif edilmiştir, ancak zaman alıcı ve subjektiftir. Otomatik FV deneyleri 5-7 bildirdi, ancak analiz ve reaktifler pahalı ve genellikle sadece pıhtı zamanı değil, fibrin oluşumunun hızı ve kapsamı sağlamak vardır oylandı. Mikroplak platformu nedeniyle kolaylık enzim-katalizli olayları ölçmek için tercih edilir, zaman, maliyet, küçük hacimli, sürekli izleme ve 9, 8 yüksek verimli. Mikroplaka deneyleri pıhtı lizis 10, trombosit agregasyon bildirilmiştir11, 12 ve pıhtılaşma faktörleri, fakat insan plazma FV faaliyeti için. Yöntemin amacı, insan plazma içinde fibrin oluşumu sırasında FV aktivitesini ölçer bir mikroplaka tahlil geliştirmektir. Bu roman mikroplak yöntemi insan plazmasında FV faaliyet basit, ucuz ve hızlı bir tahlil özetliyor. Tahlil, insan plazması içinde fibrin formasyonu (Şekil 1) 13 boyunca 405nm de absorbans değişikliği izlemek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanmaktadır. Tahlil doğru zaman, ilk oran ve fibrin pıhtısı oluşumu ölçüde ölçer. Bu plazma sadece ul miktarda gerektirir 6 dakika içinde tamamlandıktan sonra, yüksek verimli olan, 24-80pM FV hassastır ve miktarını ölçer istem aktif (1-evre aktivite) ve trombin ile aktive FV (2-kademeli etkinlik 1-grup etkinliği) -), toplam işlevsel aktivitesini tam bir değerlendirmesi (2-kademeli etkinlik elde edilir. Dissemine intravaskülerküler pıhtılaşma (DIC) genellikle önceden varolan enfeksiyonlar 14 gelişir bir kazanılmış koagülopati olup. DIC evvelce mevcut patolojinin 15 üzerinde bir kötü prognozu ve mortalitesi ile ilişkilidir. Tahlil DIC, FV 1-kademeli, 2-aşamalı ve toplam faaliyetleri ile 9 hastada normal toplanmış insan ile karşılaştırıldığında, sırasıyla,% 54,% 44 ve% 42, ortalama düşüş olduğunu göstermek için kullanılan Referans plazma (NSP). FV mikroplate assay herhangi bir pıhtılaşma faktörü aktivitesini ölçmek için kolayca adapte edilebilir. Bu test, araştırma ve klinik ortamlarda faaliyetinin daha doğru ve tam bir ölçüm yoluyla FV biyokimya anlayışımızı artacaktır. Bu bilgiler pozitif erken tanı ve böyle DIC gibi pıhtılaşma bozuklukları, daha etkili tedavilerin geliştirilmesi yoluyla sağlık ortamları etkileyecektir.

Temsilcisi Sonuçlar - FV Hazırlık 1-aşamalı mikroplak koagülasyon testi etkinliği standart eğrileri Mikroplaka okuyucu tarafından üretilen saat boyunca FV tahlil içinde fibrin pıhtısı oluşumu temsili bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. FV tahlil doğru zaman, ilk oran ve fibrin pıhtısı oluşumu ölçüde ölçer. Tahlil tamamlanması üzerine kuyuların Teftiş pıhtı oluşumu meydana geldiğini doğruladı. Daha önce başlangıç ​​absorbans ve tromboplastin ve kalsiyum klorür ilave edildikten sonra, maksimum absorbans arasında 0.45 birimleri - Bütün reaksiyonlar 0.35 405nm de absorbans genel bir değişiklik ile pıhtı oluşumu yaklaşık olarak aynı ölçüde yükselmiştir. FV Temsilcisi örnekleri 1-aşamalı Günlükler Pıhtı Zaman aktivitesi standart eğrileri (saniye) vs Günlükler FV Aktivitesi (Units / ml) ve pıhtı oluşumu Başlangıç ​​Hızı Girişi (mUnits / dak) vs Günlükler FV Aktivitesi (Adet / ml NSP&#39;nin seri seyreltiler) gösterilir <stronsırasıyla g&gt; Şekil 2A ve Şekil 2B,. FV vs Clot Zaman Log-Log arsa takılması 1-Aktivite (; R 2 = 0.980 Şekil 2A) lineer regresyon analizinden sonra bu değişkenler arasında güçlü bir ilişki belirlenmiştir. FV Aktivite vs pıhtı oluşumu İlk Puan Log-Log arsa takılması da (; R 2 = 0,983 Şekil 2B) lineer regresyon analizinden sonra bu değişkenler arasında güçlü bir ilişki belirlenmiştir. NHP 512 kat kadar seyreltilir için hem Log Pıhtı Zaman ilişkisi ve pıhtı oluşumu vs Günlükler FV Faaliyet Başlangıç ​​Hız oturum lineer kalmıştır. FV 12-40nm yaklaşık 16 at NSP içinde deveran mikroplate assay yaklaşık NSP 24-80pM FV duyarlıdır. Protrombinaz yılında FVa-FXa-lipid etkileşim sabiti ayrışma yaklaşık 1nM dozu 17 olduğu göz önüne alındığında, FV mikroplate assay fizyolojik relevan FV seviyelerinin ölçümü için tamamen uygundurprotrombinaz yılında FVa fonksiyonu için t nM aralığı. FV mikroplate assay kullanarak, o da 15 sağlıklı kontrol plazmasının FV 1 aşamalı aktivite assay (Erkek ve Kadın, Yaş 18-20yrs) FV aktivitenin normal sınırlarda (± Standart sapma; Aralığı) olduğu tespit edilmiştir: 0.96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Bu Cutler ve ark tarafından bildirilen normal sağlıklı FV aktivitesi ve aralık (0.66-1.14U/ml) ile de aynı fikirde. FV 1-grup etkinliği bir otomatik analiz cihazı 7 ile tespit edilmiştir. Intra-analiz zaman, ne ölçüde değişkenlik ve 8 farklı günlerde 6 kuyuda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç ​​hızı sırasıyla% 3.4,% 4.4 ve% 3.1 idi. Inter-assay zaman, ne ölçüde değişkenlik, ve 8 farklı günlerde 8 farklı deneyler 6 kuyuda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç ​​hızı sırasıyla% 7.1,% 7.8 ve% 9.2 idi. Böylece, bu üç measu arasında intra ve inter-assay değişkenliğikırmızı değişkenler (Up to 12) içinde ve aynı anda birden fazla numune mikroplate assay arasında sağlam çalışma performans için düşük ve kabul edilebilir düzeyde idi. Temsilcisi Sonuçlar - FV 1-evre ve 2 aşamalı mikroplak koagülasyon yöntemi ile insan plazma örnekleri assaying Log Clot Zaman vs Günlükler FV Faaliyet standart eğri (Şekil 2A) kasıtlı katma trombin (FV 1-evre aktivitesi) ile devreye alınmadı veya kasıtlı aktive edilerek NHP ve 9 DIC hasta plazmalarda FV aktivitesini ölçmek için kullanılan trombin (FV 2-kademeli etkinlik) ilave edildi ve sonuçlar Tablo 1 &#39;de gösterilmektedir. Tüm 9 DIC hasta plazmaları 1 aşamalı faaliyetleri ve NSP göre sırasıyla% 54 ve% 18, ortalama azaldı pıhtı oluşumunu başlangıç ​​oranları FV sergiledi. DIC hastalarda FV 1-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu uzantılar NHP büyük ölçüde farklı değildi ve NSP dan% 13 oranında, ortalama artış göstermiştir. <html> Trombin ile NHP aktivasyonu, FV olarak yaklaşık 8 kat artış elde FV 1-grup etkinliği (Tablo 1) yukarıdaki aşama 2-aktivitesi. Bu NHP yılında FV onun devre dışı bırakın formunda ağırlıklı olarak bulunan ve manuel eğim-tüp FV deneyleri 3, 4 ve otomatik FV deneyleri 5-7 kullanarak önceden bildirilen sonuçlar ile uyumlu olduğunu gösterir. FV 2-aşamalı ve toplam aktivite de NSP göre sırasıyla% 44 ve% 42, ortalama DIC hastalarda azalmıştır. FV DIC hastalarda 2-aşamalı yöntem içinde pıhtı oluşumu başlangıç ​​hızları ve kapsamlarını NSP anlamlı olarak farklı değildi ve NSP ile gözlenen sırasıyla yaklaşık% 9 ve% 4, tarafından, ortalama değişiyordu. Bu sonuçlar uzun bir zaman sonuçlandı ve fibrin pıhtı oluşumu oranı azalmıştır DIC hastanın plazmalarda NSP, FV yılında FV ile karşılaştırıldığında ve hasta FV ortalama sadece% 56 ve trombin ile aktive olarak olduğunu belirtti. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kinetik mikroplate FV 1-evre koagülasyon yöntemi ile ölçülen normal bir havuzlanmış insan referans plazmasında pıhtı oluşumu. NHP fibrin pıhtısı oluşumu sürekli olarak bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanılarak 405nm de izlenmiştir. Arsa 32 kat seyreltilmiş, NHP, FV-eksik plazma, tromboplastin, ve iyi bir mikrolevhadaki kalsiyum klorit ihtiva eden bir 6 dk reaksiyon mikroplaka okuyucu çıkarılır. Dikey eksen plazma içinde fibrin oluşumunun bir sonucu olarak meydana gelen 405nm de absorbans değişikliği temsil eder. Fibrin oluşumunun zaman absorbans yarı maksimum artış ya da eğri (36.40 san) orta noktası ulaşmak için geçen süre olarak tanımlanmıştır. Pıhtı oluşumu başlangıç ​​hızı eğrisi (611,88 mUnits / dak) absorbansı kısmının doğrusal artış ilk 5 kez puan üzerinden 405nm de absorbans değişim oranı olarak tanımlandı. Expıhtı oluşumu çadırı 405 nm (0.35 adet) maksimum ve minimum absorbans arasındaki fark olarak tanımlandı. <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Zaman ve FV 1 kademeli mikroplate assay kullanarak normal havuzlanmış insan referans plazmasında pıhtı oluşumu vs Faktör V faaliyetin başlangıç ​​hızı standart eğrileri. NHP seri olarak seyreltildi (0-512 kat ile HBS içinde) ve protokolde tarif edildiği gibi FV 1-grup mikrolevha yöntemi ile ölçüldü. Zaman ve FV içinde pıhtı oluşumu vs FV etkinliği 1-evre mikroplaka testin başlangıç ​​hızı Log-Log araziler panellerine veri A ve B, sırasıyla lineer regresyon modelleme sonra gösterilmektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> 1-aşamalı yöntem Aktivitesi (Units / ml) </td><td> 1-aşamalı yöntem Kapsamı (Adet) </td><td&gt; 1-aşamalı yöntem Başlangıç ​​Hızı (mUnits / dak) </td><td> 2-aşamalı yöntem Aktivitesi (Units / ml) </td><td> 2-aşamalı yöntem Kapsamı (Adet) </td><td> 2-aşamalı yöntem Başlangıç ​​Hızı (mUnits / dak) </td><td> Toplam faaliyet (Adet / ml) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> Hasta 1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> Hasta 2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Hasta 3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> Hasta 4 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> Hasta 5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> Hasta 6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> Hasta 7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> Hasta 8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> Hasta 9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> NHP ve intravasküler koagülasyon (DIC) Dissemine geliştirilen 9 Hastalarda Tablo 1 FV Aktivitesi. FV 1-kademeli, 2-aşamalı ve NHP ve 9 DIC hasta plazmalarda toplam aktivite mikroplate assay standart FV-1. aşama belirlenmiştir FV etkinlik (Şekil 2A) vs pıhtı oluşumu zamanı eğrisi ve birim / ml &#39;de verilmiştir. Başlangıç ​​hızları (mUnits / dak ilk beş kez puan üzerinden A405nm artış başlangıç ​​hızı) ve kapsamlarını (Maksimum A405nm - Minimum A40FV 1 içinde pıhtı oluşumu 5nm) - ve 2-evre mikrolevha tahlil de gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay at JoVE.com

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Bu çalışma daha önce bildirilmemiştir insan plazma fibrin pıhtı oluşumu sırasında FV koagülasyon aktivitesini ölçer bir roman mikroplate assay açıklanır. Yöntem sürekli olarak insan plazması içinde fibrin pıhtısı oluşumu sırasında 405nm de absorbans değişikliği ölçmek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır.

Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.8K Görüntüleme.  University of Ontario Institute of Technology. Bu çalışma daha önce bildirilmemiştir insan plazma fibrin pıhtı oluşumu sırasında FV koagülasyon aktivitesini ölçer bir roman mikroplate assay açıklanır. Yöntem sürekli olarak insan plazması içinde fibrin pıhtısı oluşumu sırasında 405nm de absorbans değişikliği ölçmek için bir kinetik mikroplaka okuyucu kullanır.

Video: Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...