Les auteurs tiennent à remercier Norman Krüger pour son excellent support technique.

1. Partie 1: Culture de hNPCs dans PuraMatrix <ol><li> À l&#39;avance pour la génération d&#39;un échafaudage avec une concentration de 0,25% PuraMatrix sans laminine on a besoin pour préparer les solutions suivantes </li><li> Préparer une solution contenant du saccharose à 20% et une solution contenant 10% de saccharose dissous dans de l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Pour la solution 1 mix 120 pl de la solution de saccharose à 20% avec 120 pi d&#39;eau distillée dans un tube de 1,5 ml conique. </li><li> Pour la solution 2 mix 60 pl de la solution avec 60 ul PuraMatrix de solution de saccharose à 20% dans un tube de 1,5 ml conique. </li></ol> Pour une préparation d&#39;un échafaud avec une concentration de 0,25% PuraMatrix complétée par la laminine (8 pg pour 100 Matrice ul) on a besoin pour préparer les solutions suivantes. <ol class="lroman"><li> Pour la solution 1 mix 72 ul d&#39;eau distillée avec 120 pi de solution de saccharose à 20% et 48 ul laminine dans un tube de 1,5 ml conique. </li><li>Pour la solution 2 mélanger 60 solution PuraMatrix ul avec 60 ul de la solution de saccharose à 20% dans un tube de 1,5 ml conique. </li></ol><ol start="5"><li> Pour l&#39;ancrage des cellules dans le PuraMatrix préparer une plaque de 4 puits de culture cellulaire et le lieu un glissement de verre stérilisés couvercle (diamètre 13 mm) dans deux puits. Magasin de la plaque dans le banc de nettoyage pour les utiliser plus tard. Lamelles de verre sont utilisés uniquement pour les études immunocytochimiques. Si aucune des colorations immunocytochimiques sont destinés, l&#39;étape peut être sautée. </li></ol> Pour préparer le hNPCs pour l&#39;encapsulation dans une échafaudages 3D doit préparer les solutions suivantes. Diluer le Benzonase dans la solution de trypsine / EDTA, en utilisant un facteur de dilution de 1:10.000. Pour un mélange solution Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsine-inhibiteur (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Détacher les cellules en ajoutant 500 ul de trypsine / Benzonase solution et incuber pendant 5 min dans un incubateur (37 ° C CO, 5% 2). Arrêter la réaction avec une solution Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Par la suite centrifuger les cellules détachées pendant 5 min à 3000 x g. Laver les cellules avec 5 ml de solution de saccharose à 10% et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans une solution de saccharose à 10%, la solution finale des cellules doit contenir 1x10 6 cellules / ml. </li></ol> Les prochaines étapes, 01/08 à 01/11, devrait être fait aussi vite que possible, en raison de la faible pH de la solution PuraMatrix, ce qui pourrait être nocif pour les cellules. <ol start="8"><li> Mélanger 60 pi de suspension cellulaire avec la solution 1. </li><li> Ajouter 120 ul de la solution 1, contenant les cellules, le tube conique avec la solution 2 et mélanger soigneusement. </li><li> Placer 100 ul du mélange immédiatement sur chaque couvercle glisse résidé dans la plaque 4-même. </li><li> Ajouter lentement 200 pl de milieu de culture cellulaire par puits et après 2-3 minutes, un autre ul 200. Ceci lancera l&#39;auto-assemblage de la matrice. </li><li> Incuber caunes à 37 ° C, pour 1h dans le banc de nettoyage sur une plaque chauffante ou dans la zone chauffée de votre banc propre. Autant que possible, ne pas déplacer la plaque car cela pourrait nuire à l&#39;assemblage des matrices. </li><li> Retirer la plupart des moyennes, mais pas tous, pour éviter les matrices tomber à sec, avec une pipette 1000 pi. Ajouter 500 pi de milieu pour laver les matrices pendant 10 min. Enfin éliminer le milieu et ajouter 500 pl de milieu frais et placer la plaque de culture dans un incubateur (37 ° C CO, 5% 2). Comme les matrices sont sensibles aux chocs des plaques doivent être déplacés le moins possible et stockés, si possible, dans un incubateur séparés. </li><li> Le hNPCs utilisé ici ont été multipliées pendant 7 jours dans les échafaudages 3D et de la différenciation a été initié par le retrait des 13 facteurs de croissance. Milieu a été changé tous les 2-3 jours. </li></ol> 2. Partie 2: coloration immunocytochimique des matrices entière <ol><li> En avance à la procédure de coloration on a besoin de se préparer: à partir desolution tampon de blocage composée de sérum de chèvre normal de 5% et 0,3% de Triton X-100 (dissous dans du PBS, une solution de paraformaldéhyde à 4% sur la base PBS 0,1 M, et si besoin d&#39;une solution avec 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) pour une coloration des noyaux contenant 100 ng DAPI / ml dissous dans du PBS. Les échantillons ont été montés avec un mélange de Mowiol et DABCO. </li><li> Pour laver les matrices éliminer le milieu de 1000 avec une pipette ul et laver les échafaudages fois avec du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Pour fixer les échafaudages enlever le PBS et ajouter 400 l de paraformaldéhyde (4% en PBS 0,1 M) dans chaque puits et incuber les matrices pendant 30 minutes à température ambiante. Échafaudages fixes peuvent être stockées dans du PBS additionné de 0,02% NaN 3 à 4 ° C pendant plusieurs semaines à plusieurs mois. </li><li> En avance d&#39;une coloration laver les échafaudages avec du PBS pendant 5 minutes. </li><li> Incuber les échafaudages dans le blocage de la solution tampon. Solution de blocage a été changé trois fois toutes les 2-3 heures et subsequently échafaudages ont été incubés dans une solution de blocage pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution tampon de blocage et d&#39;ajouter l&#39;anticorps primaire dissous dans du PBS additionné de sérum de chèvre normal de 1% et incuber les matrices pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire et laver échafaudages 4 fois pendant 2 h et ensuite pendant la nuit à 4 ° C avec du PBS. </li><li> Retirez le PBS et ajouter la solution avec l&#39;anticorps secondaire, dissoute dans du PBS additionné de sérum de chèvre normal de 1%, pendant 4 h à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Lavez les échantillons avec du PBS 4-6 fois pendant 1 h et ensuite pendant la nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour une coloration des noyaux, on peut ajouter 400 ul de la solution de DAPI pendant 30 min. </li><li> Pour monter les échantillons on a besoin des lames de microscope. Ajouter 50 ul Mowiol / Dabco sur les lames de microscope. Retirer les lamelles de la plaque de 4 puits et mettez-les soigneusement sur le support de montage. </li><li> Ici nous avons utilisé un 8000 Biozeromicroscope (Keyence, Allemagne, Karlsruhe) pour obtenir micrographies unique et z-piles. Chaque pile contient 30 photos unique avec une distance de um 1-2. Utilisation du logiciel analyseur correspondant le flou inhérent à la fluorescence a été retiré avant les projections complet de la z-piles ont été produites. </li></ol> 3. Partie 3: Sortie de hNPCs des échafaudages pour l&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> À l&#39;avance pour la libération des cellules à partir d&#39;échafaudages laver les échafaudages avec 500 ul de HBSS. </li><li> Transfert des échafaudages à l&#39;aide d&#39;une pipette 1000 pi à un tube de 15 ml conique contenant un milieu de culture cellulaire. </li><li> Pour perturber la mécanique échafaudages resuspendre la solution de cellules à plusieurs reprises avec une pipette et ensuite 1000 ul de la solution par centrifugation à 3000 xg pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant avec une pipette, ajouter 500 ul de trypsine / Benzonase solution et remettre en suspension les moments culot cellulaire de plusieurs. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 minà 37 ° C dans la solution de trypsine / Benzonase. Pour arrêter la réaction ajouter 1 ml solution Trypsin-inhibitor/Benzonase pipette et de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire 5 min à 3000 xg, éliminer le surnageant et laver les cellules avec 2 ml de tampon HBSS. Répétez cette étape deux fois. Cette procédure va enlever les débris de la matrice. </li><li> Passez le creux solution de cellules en suspension de cellules d&#39;une passoire (taille des pores 70 um) pour enlever les agrégats et de recueillir les cellules dans un milieu de culture cellulaire. Les cellules obtenues peuvent être semées à nouveau, par exemple sur des lamelles pour des études fonctionnelles en patch-clamp ou des mesures fluometric. Pour traiter les cellules pour la cytométrie de flux, fixer les cellules immédiatement (voir 4.1). </li></ol> 4. Partie 4: Quantification des βIII-tubuline des cellules positives par cytométrie en flux <ol><li> Fixer les cellules libérées obtenu à l&#39;étape 3.7 avec 1% PFA pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 3000 xg et Remove le surnageant. Si nécessaire, les cellules peuvent être préparés pour être conservés à 4 ° C pour analyse ultérieure. Par conséquent remettre les cellules dans un tampon de lavage (PBS additionné de 0,5% de BSA et 0,02% Na-azide). </li><li> Pour procéder à la préparation de la cytométrie en flux, centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 350 xg, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 25 pl de la solution d&#39;anticorps. Par conséquent, le premier anticorps est mélangé avec le tampon de la saponine à une concentration de 1:100 par exemple βIII-tubuline. Le tampon de la saponine se compose de PBS avec une concentration de 0,5% saponine, une concentration de BSA de 0,5% et une concentration de Na-azide de 0,02%. </li><li> Incuber la suspension cellulaire avec le premier anticorps pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur. Comme un contrôle négatif de préparer un échantillon sans le premier anticorps. </li><li> Pour la première étape de lavage ajouter 300 ul de tampon saponine directement aux cellules. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Pour le second lavage, jeterle surnageant, ajouter 300 pi de tampon et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. </li><li> Enlever le surnageant et ajouter 25 ul solution contenant l&#39;anticorps secondaire (par exemple Alexa Fluor 647, 1:1000, dissous dans du tampon saponine). Incuber les cellules avec l&#39;anticorps secondaire 1h à température ambiante, dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour la première étape de lavage ajouter 300 ul de tampon saponine directement aux cellules. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Pour le second lavage, éliminer le surnageant, ajouter 300 pi de tampon et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 ul de tampon de lavage pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple de hNPCs cultivés dans l&#39;auto-assemblage d&#39;hydrogel échafaudage PuraMatrix est montré dans la figure 1. Le hNPCs croître dans des structures sphériques comme dans PM non modifié. Dans cette condition, la cultures, les cellules ne peuvent guère être reconnue dans une transmission de la lumière, bien que des faisceaux de processus entre les sphères sont visibles (figure 1A). Selon les conditions de culture du type cellulaire utilisé, la matrice peut être modifié par exemple en ajoutant la laminine. Pour la lignée cellulaire hNPC ReNcell VM (Millipore) laminine est nécessaire pour induire un modèle de croissance avec des granulats moins dense, mais une répartition plus homogène des cellules (fig 1b). Indépendante de modifications, la matrice peut être utilisée pour étudier par exemple la différenciation neuronale. Figure 1C présente une coloration de la hNPCs pour le marqueur neuronal βIII-tubuline. Dans cet exemple les cellules ont été cultivées pendant 7 jours dans la matrice et ensuite différenciés pour les 4 jours, où la différenciation a été induite par le retrait des facteurs de croissance EGF et l&#39;bFGF. 13 corps cellulaire et un réseau dense de processus construits par les cellules peuvent être reconnus facilement. Cependant, il est évident que la quantification du nombre de cellules prend du temps, comme un grand nombre dedes photos de différentes régions de la matrice doit être analysé, afin d&#39;obtenir une base de données fiables pour une analyse statistique. Dans la figure 1D, on peut voir un exemple de cellules libéré de la matrice et par la suite platted sur lamelles. Ces cellules pourraient être utilisées pour des études fonctionnelles. La libération des cellules provenant de la échafaudages 3D offre la possibilité d&#39;analyser les différents paramètres comme l&#39;expression de protéines marqueurs ou des taux de survie des cellules par AnnexinV / PI coloration ou un essai TUNEL. La figure 2 montre un exemple d&#39;une analyse de cytométrie en flux du pourcentage de cellules + βIII-tubuline. Le contrôle négatif (cellules non marquées pour βIII-tubuline) est montré dans la figure 2A. Ces commandes sont utilisées pour déterminer la grille pour la détection ultérieure de βIII-tubuline + cellules (figure 2B). Une comparaison d&#39;un comptage manuel des cellules et une analyse par cytométrie en flux est montré dans la figure 2C. Le pourcentage de cellules + βIII-tubuline a été détermINED en comptant le nombre total de cellules (par le biais d&#39;une coloration nucléaire au DAPI) et le nombre de cellules βIII-tubuline + dans les images de fluorescence. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figure 1. hNPCs cultivées en PuraMatrix auto-assemblage de peptides hydrogel. Un hNPCs) encapsulé dans PuraMatrix (PM) poussent dans sphérique, dense structures emballés, où le diamètre de la sphère peut être jusqu&#39;à plusieurs centaines de um. Entre les sphères, on peut reconnaître des paquets de processus construits par les cellules (flèches). B) les cellules encapsulées dans PuraMatrix complétée par la laminine (LEMP) poussent dans des structures moins denses, plus distribuée de façon homogène. Dans la laminine complété la matrice, on peut reconnaître des cellules individuelles dans les zones moins denses (flèches), cependant il n&#39;est guère possible de quantifier le nombre de cellules. C) hNPCs différenciés pour les 4 jours de LEMP expresse marqueur neuronal, comme βIII-tubuline (vert). Pour évaluationte le pourcentage de cellules positives on doit déterminer le nombre total de cellules par une coloration des noyaux tels que le DAPI (bleu). La microphotographie présente la projection complète de a à z-stack des photos prises avec Biozero-8000 microscope. D) Les cellules libéré de la matrice peut être ensemencées sur des lamelles par exemple pour des études fonctionnelles. La microphotographie montre des cellules en culture pour la 3D, suite à la procédure de libération. La coloration pour βIII-tubuline (rouge) révèle une morphologie comparable aux cellules hébergés dans l&#39;échafaud 3D. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figure 2. Cellules d&#39;analyse de cytométrie en flux libérés de PuraMatrix. Afin de surmonter la quantification du temps de microphotographies, nous avons utilisé un protocole visant à libérer des cellules cultivées dans PuraMatrix donnant accès à une analyse plus rapide par cytométrie en flux. Un cellules) non colorées ont été utilisées comme contrôle négatif, de mettre la porte (cadre noir) pour l&#39;analyse par la suitedes ex-tubuline βIII cellules. B) Afin de quantifier le pourcentage de βIII-tubuline + cellules de la même porte, situé dans le contrôle négatif, a été utilisé. Cellules positives apparaissent dans la partie droite de l&#39;axe des x, où a également une population intermédiaire a été observée (cadre pointillé), très probablement des débris de cellules représentant. C) La comparaison des manuels cellules comptées et les cellules comptées par cytométrie en flux a révélé une proportion beaucoup plus élevée de cellules positives, où la dépendance temporelle du nombre de βIII-tubuline + était comparable, indiquant la fiabilité du protocole de cytométrie en flux.

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;utilisation de la 3D-échafaudages offre l&#39;opportunité d&#39;étudier le développement de différents types de cellules dans une situation de culture cellulaire plus proche de la situation in vivo. Toutefois, concernant l&#39;analyse de la différenciation neuronale par exemple ou des études fonctionnelles on doit surmonter certains obstacles pour obtenir des données fiables pour la quantification, par exemple des types de cellules. Ici, nous décrit la cultur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptide hydrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Souris laminine, je </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Hanks Balanced Salt Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubuline anticorps </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Souris, monoclonaux, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Chèvre α souris, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 réactif </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane de 98% </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 taille des pores um </td></tr><tr><td> La saponine </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / ul </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Homme-albumine Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

L&#39;influence des trois dimensions (3D) des échafaudages sur la différenciation de croissance, la prolifération neuronale et finalement un grand intérêt dans le but de trouver de nouvelles méthodes pour les thérapies cellulaires et standardisée dans les troubles neurologiques ou de maladies neurodégénératives. Structures 3D sont censés fournir un environnement beaucoup plus proche de la situation in vivo que les cultures en 2D. Dans le contexte de la médecine régénérative, la combinaison des échafaudages biomatériau souches neurales et de cellules progénitrices est très prometteur comme outil thérapeutique. 1-5 Systèmes de culture émuler un environnement en trois dimensions a été démontré que l&#39;influence la prolifération et la différenciation dans les différents types de souches et cellules progénitrices. Ici, la formation et la fonctionnalisation de la 3D-microenviroment est important de déterminer la survie et le devenir des cellules intégrées 6-8. Ici nous avons utilisé PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide hydrogel à base d&#39;échafaudage,ce qui est bien décrite et utilisée pour étudier l&#39;influence d&#39;un environnement en 3D sur différents types cellulaires. 7,11-14 PuraMatrix peut être personnalisé facilement et la fabrication synthétique de la nano-fibres fournit un système de culture 3D de haute fiabilité, qui est en outre xéno-libres. Récemment, nous avons étudié l&#39;influence de la concentration en PM-sur la formation de l&#39;échafaud. 13 Dans cette étude, les concentrations de PM utilisés ont eu un impact direct sur ​​la formation de la structure 3D, qui a été démontré par microscopie à force atomique. Une analyse ultérieure de la survie et la différenciation des hNPCs révélé une influence des concentrations de PM utilisés sur le sort des cellules embarquées. Cependant, l&#39;analyse de la survie ou la différenciation neuronale par des techniques d&#39;immunofluorescence posséder quelques obstacles. Pour obtenir des données fiables, on doit déterminer le nombre total de cellules dans une matrice afin d&#39;obtenir le nombre relatif de par exemple. cellules neuronales marquée par βIII-tubuline. Ce prérequis d&#39;une technique pour analyser les échafaudages dans toutes les dimensions de 3 par un microscope confocal ou une technique comparable, comme des microscopes à fluorescence en mesure de prendre z-piles de l&#39;échantillon. En outre, ce type d&#39;analyse est beaucoup de temps. Ici nous démontrons une méthode pour libérer les cellules de la échafaudages 3D pour l&#39;analyse ultérieure, par exemple par cytométrie en flux. Dans ce protocole humains cellules progénitrices neurales (hNPCs) de la ligne de cellules ReNcell VM (Millipore Etats-Unis) ont été cultivées et différenciées en 3D composé d&#39;échafaudages PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix complétée par la laminine (LEMP). Dans nos mains un PM-concentration de 0,25% a été optimale pour la culture des 13 cellules, cependant l&#39;opération pourrait être adapté à d&#39;autres types cellulaires. 12 Les cellules libérées peuvent être utilisées par exemple pour des études immunocytochimiques et ensuite analysés par cytométrie en flux. Cela accélère l&#39;analyse et la more plus, le reste des données obtenues sur une base plus large, l&#39;amélioration de la fiabilité des données.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un auto-assemblage en 3 dimensions d&#39;échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d&#39;autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K vues.  University of Rostock. Nous décrivons ici l'utilisation d'un auto-assemblage en 3 dimensions d'échafaudage à la culture humaine cellules progénitrices neurales. Nous présentons un protocole visant à libérer les cellules de la échafaudages pour être analysés ultérieurement, par exemple par cytométrie en flux. Ce protocole pourrait être adapté à d'autres types cellulaires pour effectuer des études détaillées de façon mécaniste.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Une méthode pour l&#39;encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Recherche

Bio-ingénierie

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Adaptation d&#39;un robot haptique dans une IRMf 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Synthèse d’hydrogel adhésif fort, de gélatine O-nitrosobenzaldéhyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...