Yazarlar Norman Krüger onun mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. Bölüm 1: PuraMatrix içinde hNPCs Kültür <ol><li> Laminin biri olmadan% 0.25 PuraMatrix konsantrasyon ile bir iskele nesil öncesinde aşağıdaki çözümleri hazırlamak için gereken </li><li> % 20 sakaroz ve steril distile su içinde çözünmüş% 10 sakaroz içeren bir çözüm içeren bir solüsyon hazırlanır. </li><li> 120 ul, 1.5 ml konik tüp distile su ile% 20 sakaroz çözeltisini çözüm 1 mix 120 ul. </li><li> 1,5 ml konik tüp% 20 sakaroz çözeltisini 60 ul PuraMatrix çözüm çözümü 2 mix 60 ul. </li></ol> % 0.25, aşağıdaki çözümleri hazırlamak için laminin (100 ul Matrix başına 8 mikrogram) bir ihtiyacı ile desteklenmiş bir PuraMatrix konsantrasyon ile bir iskele Hazırlanması için. <ol class="lroman"><li> 120 ul% 20 sükroz çözeltisi ve 1.5 ml konik tüp içinde 48 ul laminin ile distile su solüsyonu 1 mix 72 ul. </li><li>Çözüm 2 karışımı 1.5 ml konik tüp içinde% 20 sakaroz çözeltisini 60 ul ile 60 ul PuraMatrix çözüm. </li></ol><ol start="5"><li> PuraMatrix hücrelerin gömme, 4-iyi bir hücre kültürü plakası hazırlamak ve steril bir cam kapak kayma (çap 13 mm) iki kuyu yeri için. Daha sonra kullanmak üzere temiz tezgah plaka saklayın. Cam kapak fişleri sadece immünositokimyasal çalışmaları için kullanılmaktadır. Immünositokimyasal renklendirmeler amaçlanan ise, adım atlanabilir. </li></ol> 3D iskeleleri bir kapsülleme hNPCs hazırlamak için aşağıdaki çözümleri hazırlamak zorundadır. Seyreltme faktörü 1:10.000 kullanarak, tripsin / EDTA çözeltisi Benzonase sulandırınız. Trypsin-Inhibitor/Benzonase bir çözüm karışımı için: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl +% 1 HSA + tripsin inhibitörü (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Bir kuluçka 5 dakika (37 ° C,% 5 CO 2) 500 ul tripsin / Benzonase çözüm ve inkübe ekleyerek hücreleri Ayır. Trypsin-Inhibitor/Benzonase çözeltisi ile reaksiyonu durdurun. Daha sonra 5 dakika boyunca 3000 x g. müstakil hücreler santrifüj 5 ml% 10 Sakkaroz çözüm hücreleri yıkayın ve tekrar santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> % 10 sakaroz çözeltisini hücrelerin yeniden süspanse edin, son hücre çözümü 1x10 6 hücre / ml içermelidir. </li></ol> Bir sonraki adım, 1.8 1.11, çünkü hücreler için zararlı olabilir PuraMatrix çözüm, düşük pH, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılabilir olmalıdır. <ol start="8"><li> Çözüm 1 ile hücre süspansiyonu 60 ul karıştırın. </li><li> Çözüm 1, 120 ul çözüm 2 ile konik tüp hücreleri içeren ve iyice karıştırın. </li><li> Hemen her kapağı karışımı Yeri 100 ul 4 plaka ikamet sığar. </li><li> Yavaş yavaş 200 ul hücre kültür ortamı için iyi ve 2-3 dakika sonra başka bir 200 ul ekleyin. Bu matrisin öz-montaj başlatacaktır. </li><li> Inkübe c37 ° arşın ° C, ısıtma plakası veya ısıtılmış temiz tezgah alanı temiz tezgah 1s. Bu matrisler montajı zarar verebileceği için mümkün olduğunca plakasını hareket etmiyor. </li><li> Çoğu orta çıkarın ama hepsini değil, matrisler 1000 ul pipet, kuru düşmesini önlemek için. 10 dakika matrisler yıkamak için orta 500 ul ekleyin. Sonunda orta kaldırmak ve 500 ul taze orta ekleyin ve bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2) kültür plakası yerleştirin. Matrisler plakalar ayrı bir inkübatör, mümkünse, daha az mümkün olduğu kadar hareket ve saklanan olmalıdır şok duyarlıdır. </li><li> Burada kullanılan hNPCs 3D-iskeleler 7 gün boyunca çoğaldı ve farklılaşma, büyüme faktörleri 13 geri çekilmesi tarafından başlatılmıştır . Orta 2-3 günde bir değiştirildi. </li></ol> 2. Bölüm 2: tüm matrisler İmmünositokimyasal boyama <ol><li> Boyama işlemi öncesinde gerekli hazırlıkları yapması gerekmektedir: ab% 5 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100, 0.1 M PBS göre% 4 paraformaldehid çözüm PBS içinde çözünmüş ve 4 ile bir çözüm &#39;,6-Diamidin-2&#39; phenylindoldihydrochlorid gerekirse (oluşan tampon çözelti kilitleme DAPI) PBS içinde çözünmüş 100 ng DAPI / ml içeren bir çekirdeklerinin boyanma. Örnekleri Mowiol ve DABCO bir karışımı ile monte edilmiştir. </li><li> Matrisler 1000 ul pipet ile orta kaldırmak ve 5 dakika boyunca bir kez PBS ile iskeleler yıkama yıkamak için. </li><li> PBS iskeleleri kaldırmak ve her kuyuya 400 ul paraformaldehid (0,1 M PBS içinde% 4) ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında matrisler inkübe düzeltmek için. Sabit Yapı iskeleleri, birkaç hafta ile birkaç ay için% 0,02 NaN 3, 4 ° C ile desteklenmiş PBS içinde saklanabilir . </li><li> Iskeleleri bir boyama öncesinde 5 dakika PBS ile yıkayın. </li><li> Tampon çözelti engelleme iskeleleri inkübe edin. Engelleme çözüm her üç kez 2-3 saat ve subsequ değiştirildikardiak defekt, iskeleler, 4 gece boyunca bloke çözüm inkübe edildi ° C </li><li> Engelleme tampon çözelti çıkarın ve% 1 normal keçi serumu ile takviye PBS içinde çözünmüş primer antikor ekleyin ve 4 gece boyunca matrisler inkübe ° C </li><li> Birincil antikor çözümü çıkarın ve yıkama 4 4 2 saat boyunca bir kez ve daha sonra gece boyunca iskele ° C PBS ile. </li><li> PBS çıkarın ve PBS içinde çözünmüş ikincil antikor ile çözüm ekleyebilir, karanlıkta, oda sıcaklığında 4 saat boyunca,% 1 normal keçi serumu ile desteklenmiş. </li><li> Örnekleri 1 saat, 4 gece boyunca ve daha sonra ° C karanlıkta PBS 4-6 kez yıkayın. </li><li> Çekirdeklerin boyama için bir, 30 dakika için DAPI çözüm 400 ul ekleyebilirsiniz. </li><li> Bir mikroskop lamı ihtiyacı örnekleri monte etmek için. Mikroskop lamı 50 ul Mowiol / Dabco ekleyin. 4-plaka kapağını fişleri montaj orta dikkatlice çıkarın ve onları koymak. </li><li> Burada Biozero 8000mikroskobu (Keyence, Almanya, Karlsruhe) tek mikrograflar ve z-yığınları elde etmek. Her bir yığın 1-2 mm mesafe ile 30 tek resimleri içerir. Ilgili analizörü yazılımı kullanarak floresan doğasında bulanıklık z yığınları üretildi tam projeksiyonları önce kaldırıldı. </li></ol> 3. Bölüm 3: flow sitometri analizi için iskeleler hNPCs Release <ol><li> Iskeleler hücreleri serbest bırakılması öncesinde 500 ul HBSS iskeleleri yıkayın. </li><li> Hücre kültür ortamı içeren 15 ml konik boru 1000 ul pipet yardımıyla iskeleleri aktarın. </li><li> 1000 ul pipet ile iskeleler bozmak için mekanik hücre çözümü birkaç kez tekrar süspansiyon ve daha sonra 5 dakika boyunca 3000 xg çözüm santrifüj. </li><li> Bir pipet yardımıyla süpernatantı 500 ul, tripsin / Benzonase çözüm ekleyin ve hücre pelletini birkaç kez tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 dakika boyunca hücreler inkübe37 ° C tripsin / Benzonase çözüm. Reaksiyon, 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase çözeltisi ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipet ve durdurmak için. </li><li> Hücre süspansiyonu 3000 xg&#39;de 5 dakika santrifüj, süpernatantı kaldırmak ve hücreleri 2 ml HBSS tamponu ile yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Bu işlem matris pislikleri temizleyin. </li><li> Pass hücre süspansiyonu çözümü çukur, agrega kaldırmak ve hücre kültürü ortamında hücreleri toplamak için bir hücre süzgeç (gözenek büyüklüğü 70 mikron). Elde edilen hücrelerin tekrar yama kelepçe veya fluometric ölçümleri gibi fonksiyonel çalışmalar için kapak bordroları gibi seribaşı olabilir. Flow sitometri hücreleri işlemek için, (4.1) hücrelerin hemen düzeltmek. </li></ol> 4. Bölüm 4: flow sitometri βIII-tubulin pozitif hücrelerin Niceleme <ol><li> Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 1 PFA adım 3.7 &#39;de elde edilen serbest hücreleri sabitleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 3000 xg ve remov hücre süspansiyonu Santrifüje süpernatant. Gerekirse, hücreler, daha sonra analiz için 4 ° C de saklanır etmeye hazır olabilir. Bu nedenle tekrar süspansiyon hücreleri yıkama tamponu (PBS,% 0.5 BSA ve% 0.02 Na-azid ile desteklenmiş). </li><li> Flow sitometri hazırlık ile devam etmek için, 350 xg&#39;de hücre süspansiyonu 10 dakika santrifüj süpernatantı atmak ve antikor çözüm 25 ul hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Bu nedenle ilk antikor konsantrasyonu 1:100 örneğin βIII-tubulin saponin tamponu ile karıştırılır. Saponin tampon,% 0,5 saponin konsantrasyon, BSA konsantrasyonu% 0.5 ve% 0.02 Na-azid konsantrasyon ile PBS oluşur. </li><li> Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat süreyle ilk antikor hücre süspansiyonu ile inkübe edin. Negatif kontrol olarak ilk antikor olmayan bir örnek hazırlayın. </li><li> Ilk çamaşır adım için hücrelere doğrudan 300 ul saponin tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu Santrifüj Ikinci yıkama adım atın.süpernatantı, 300 ul tampon ekleyin ve 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu santrifüj </li><li> Süpernatantı ve ikincil antikor içeren (örneğin, Alexa Fluor 647, 1:1000, saponin tampon içinde çözünmüş) 25 ul çözüm ekleyin. Hücreler karanlıkta oda sıcaklığında, ikincil antikor 1s ile inkübe edin. </li><li> Ilk çamaşır adım için hücrelere doğrudan 300 ul saponin tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu Santrifüj Ikinci yıkama adım için, süpernatantı atmak, 300 ul tampon ekleyin ve 5 dakika boyunca 350 x g. hücre süspansiyonu santrifüj </li><li> Süpernatantı atın ve hücreler flow sitometri analizi için 500 ul yıkama tamponu tekrar süspansiyon. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Kendinden montaj hidrojel iskele PuraMatrix kültür hNPCs bir örnek Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. HNPCs değiştirilmemiş PM sferik gibi yapılar büyür. Bu kültür durumdalar, hücreler küreler arasındaki süreçleri demetleri (Şekil 1A) görünür olmasına rağmen pek bir iletim ışık kabul edilebilir. Kullanılan hücre tipi kültür koşullarına bağlı olarak, matris laminin ekleyerek örneğin değiştirilmiş olabilir. HNPC hücre hattı için ReNcell VM (Millipore) laminin, daha az yoğun agrega ile bir büyüme modeli ancak hücrelerin daha homojen bir dağılım (Şekil 1B) ikna etmek için gereklidir. Bağımsız değişiklikler, matris, örneğin nöronal farklılaşma çalışma kullanılabilir. Şekil 1C, nöronal belirteç βIII-tubulin hNPCs boyama sunar. Bu örnekte matris 7 gün süreyle yetiştirilen hücreler ve daha sonra 4 gün, farklılaşma, büyüme faktörleri EGF ve bFGF. 13 Hücre organları çekilmesi ve hücreler tarafından inşa süreçleri yoğun bir ağ ile indüklenen ayırt edilebilir kolayca tanınır. Ancak, hücre sayısının belirlenmesi büyük bir sayı olarak, zaman alıcı olduğu açıktırmatris farklı bölgelerinde resimleri istatistiksel analiz için güvenilir bir veri tabanı elde etmek için, analiz edilecek. Incir 1D bir matris serbest ve daha sonra kapak bordroları platted hücrelerinin bir örnek görebilirsiniz. Bu hücreler fonksiyonel çalışmalar için kullanılmış olabilir. 3D-iskeleler hücrelerin serbest protein işaretleyicileri ifade veya AnnexinV / PI boyama veya TUNEL assay hücrelerin hayatta kalma oranı gibi farklı parametreleri analiz etmek imkanı sunar. Şekil 2 βIII-tubulin + hücrelerin yüzdesi bir akış sitometri analizi bir örnek gösterir. Şekil 2A negatif kontrol (hücreler βIII-tubulin için işaretlenmemiş) gösterilir. Bu kontroller βIII-tubulin + hücreler daha sonra algılama (şekil 2B) kapısı belirlemek için kullanılır. Bir hücre manuel sayım ve flow sitometri analizi bir karşılaştırma Şekil 2C gösterilmiştir. ΒIII-tubulin + hücrelerinin yüzde determtoplam hücre sayısı (nükleer DAPI boyama yoluyla) ve floresan resimler βIII-tubulin + hücrelerinin sayısı sayarak incelendiği. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Şekil 1. hNPCs kendinden montaj peptid hidrojel PuraMatrix kültüre küre çapı birkaç yüz mikron kadar olabilir PuraMatrix kapsüllenmiş) hNPCs (PM), sferik, yoğun paketlenmiş yapıları büyür. Küreler arasındaki tek hücreleri (oklar) tarafından inşa süreçlerinin demetleri tanıyabilirsiniz. B) PuraMatrix kapsüllenmiş Hücreler laminin (PML), daha homojen dağıtılmış, daha az yoğun yapılarda büyüme ile desteklenmiştir. Matris tek tek hücreleri (oklar) daha az yoğun alanlarda tanıyabilirsiniz desteklenmiş laminin, ancak bu hücrelerin sayısını ölçmek için pek mümkündür. C) hNPCs βIII-tubulin (yeşil) gibi PML ifade nöronal belirteç 4 gün farklılaşmış. Değerlendirilmesinde içinte bir DAPI (mavi) gibi bir çekirdekleri boyama ile total hücre sayısını belirlemek için pozitif hücrelerin yüzdesi. Microphotograph Biozero-8000 mikroskop ile çekilen resimleri z-yığınının tam bir izdüşümü sunmaktadır. D) matrisi salınan hücreler daha fazla fonksiyonel çalışmalar örneğin kapak bordroları numaralı seribaşı olabilir. Microphotograph 3d için kültür hücreleri daha sonra serbest bırakma işlemleri gösterir. ΒIII-tubulin için boyama (kırmızı) 3D iskele barındırılan hücrelere karşılaştırılabilir bir morfoloji ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Şekil 2. Flow sitometri analizi hücreleri PuraMatrix yayımladı. PuraMatrix flow sitometri ile daha hızlı analiz erişim sağlayan kültür hücreleri serbest bırakmak için bir protokol microphotographs zaman alıcı kantifikasyon üstesinden gelmek için . A) lekesiz hücreler daha sonra analiz için kapı (siyah çerçeve) ayarlamak için, negatif kontrol olarak kullanılmıştır.örneğin βIII tubulin hücreleri. B) negatif kontrol, aynı kapı, kullanılan βIII-tubulin + hücrelerinin yüzdesini ölçmek için. Pozitif hücreler aynı zamanda bir ara nüfus gözlendi x-ekseni, (noktalı çerçeve), büyük olasılıkla temsil eden hücre artıkları sağ parçası olarak görünür. C), flow sitometri ile sayılan elle sayılır hücre ve hücreler karşılaştırılması βIII-tubulin sayısının zaman bağımlılığı + flow sitometri protokol güvenilirliğini gösteren, karşılaştırılabilir pozitif hücreler çok daha yüksek oranda saptandı .

<ol>
	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment.">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li><li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation,+differentiation+and+3-D+migration.">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li><li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro.">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li><li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li><li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells.">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li><li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine.">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li><li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells.">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li><li>Schm&#246;le, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells.">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li><li>PuraMatrix, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Hydrogel.">Peptide Hydrogel.</a> Guidelines for Use. Catalog No 354250, (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

3D iskele kullanımı, daha yakın bir hücre kültürü durum in vivo durumun farklı hücre tiplerinin geliştirilmesi çalışma fırsatı sunuyor . Ancak, örneğin nöronal farklılaşma ya da bir hücre tipleri örneğin ölçümü için güvenilir bir veri elde etmek için bazı engelleri aşmak için fonksiyonel çalışmalar analizi ile ilgili. Burada peptid hidrojel tabanlı iskele PuraMatrix ve FACS veya fonksiyonel testleri gibi araçlara kolay erişim sağlayan bir 2D d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptid hidrojel </td><td> Bioscience BD </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Fare laminin I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Normal keçi serumu </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco&#39;nun </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Tom Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII tubulin antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-51.670 </td><td> Monoklonal fare, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.029 </td><td> Keçi α fare, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Keçi α fare, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Keçi α fare, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reaktif </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazobisiklo [2.2.2] oktan% 98 </td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 mikron gözenek boyutu </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin/ EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / ml </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> % 20 HSA </td><td> Octapharma </td><td> İnsan Albumin Kabi% 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

Büyümesi, çoğalması ve son olarak nöronal farklılaşma 3 boyutlu (3D) iskeleleri etkisi nörolojik bozukluklar ya da nörodejeneratif hastalıklar hücre tabanlı ve standart tedaviler için yeni yöntemler bulmak için büyük ilgi. 3 boyutlu yapıları, 2D kültürleri daha vivo durum çok daha yakın bir ortam sağlamak için bekleniyor . Rejeneratif tıp bağlamında, sinir kök ve progenitör hücreler ile biyomalzeme iskelelerde kombinasyon tedavi edici bir araç olarak büyük umut vaat ediyor. Üç boyutlu bir ortamda taklit 1-5 Kültür sistemleri ve farklı tipte kök çoğalma ve farklılaşmasını etkiler görülmüştür progenitör hücreler. Burada, 3D-microenviroment oluşumu ve fonksiyonelleştirilmesi gömülü hücrelerin hayatta kalma ve kaderi belirlemek için önemlidir. 6-8 Burada PuraMatrix 9,10 (RADA16 PM), peptid bazlı hidrojel iskele, ikinciiyi tanımlanmış ve farklı hücre tipleri üzerinde bir 3D-çevre etkisini incelemek için kullanılır. 7,11-14 PuraMatrix kolayca özelleştirilebilir ve nano liflerin sentetik imalat, yüksek güvenilirlik 3D-kültür sistemi, sağlar . Ayrıca xeno ücretsiz. Yakın zamanda iskele oluşumu PM konsantrasyonunun etkisini inceledik. 13 Bu çalışmada kullanılan PM konsantrasyonları atomik kuvvet mikroskobu ile gösterilmiştir 3D yapısı, oluşumu üzerinde doğrudan bir etkisi vardı. HNPCs hayatta ve farklılaşma bir sonraki analiz gömülü hücreler kaderi PM konsantrasyonlarının etkisi saptandı. Ancak, immünofloresan teknikleri sahip bazı engeller sayesinde hayatta kalma ya da nöronal farklılaşma analizi. Güvenilir veri elde etmek için, bir örneğin göreli sayısını elde etmek için bir matris içinde hücrelerin toplam sayısını belirlemek için. βIII-tubulin tarafından işaretlenmiş nöronal hücrelerin. Bu önkoşulları, 3-boyutlu olarak iskeleler numune z-yığınları alabilmesi için floresan mikroskoplar gibi bir konfokal mikroskop ya da karşılaştırılabilir bir teknik analiz etmek için bir tekniktir. Ayrıca bu tür bir analiz son derece zaman alıcı. Burada flow sitometri ile daha sonra analiz için, örneğin 3D-iskeleler hücreleri serbest bırakmak için bir yöntem göstermektedir. Bu protokol ReNcell VM hücre hattı insan nöral progenitör hücrelerin (hNPCs) (Millipore ABD) kültür ve laminin (PML) ile desteklenmiş PuraMatrix (PM) veya PuraMatrix oluşan 3D-iskeleler ayırt. Bizim ellerde% 0.25 ve PM konsantrasyon ancak konsantrasyonu diğer hücre türlerine adapte olabilir. 12 hücreleri 13 ekimi için en uygun, serbest hücreler flow sitometri örneğin immünositokimyasal çalışmaları için kullanılan ve daha sonra analiz edilebilir . Analiz ve mo hızlandırırverilerin güvenilirliğini geliştirmek, daha geniş bir taban üzerine, elde edilen veri geri kalanı bitti.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel at JoVE.com

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K Görüntüleme.  University of Rostock. Burada kendi kendine montaj 3-boyutlu iskele kültür insan nöral progenitör hücrelerin kullanımını tanımlamak. Biz flow sitometri ile analiz edilecek daha sonra örneğin iskeleleri hücreleri serbest bırakmak için bir protokol mevcut. Bu protokol detaylı mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için diğer hücre türlerine adapte olabilir.

Video: Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Biyomühendislik

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

3T fMRI Haptik Robot Adaptasyon

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...