저자는 자신의 우수한 기술 지원 노먼 크루거 감사하고 싶습니다.

1. 제 1 부 : PuraMatrix에 hNPCs의 문화 <ol><li> laminin 무허가 0.25 %의 PuraMatrix 농도와 발판의 세대 사전에 다음과 같은 솔루션을 준비 필요 </li><li> 20 %의 자당 및 멸균 증류수에 용해 10 % 자당을 포함하는 솔루션을 포함하는 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1.5 ML 원뿔 튜브에 증류수 120 μl와 20 %의 자당 솔루션의 해결 방법 1 혼합 120 μl하십시오. </li><li> 1.5 ML 원뿔 튜브에 20 % 자당 용액 60 μl로 PuraMatrix 솔루션의 솔루션이 혼합 60 μl하십시오. </li></ol> 다음과 같은 솔루션을 준비하는 laminin (100 μl 매트릭스 1 일 8 μg) 1을 필요로하는 보충 0.25 %의 PuraMatrix 농도와 발판의 준비. <ol class="lroman"><li> 20 % 자당 용액 120 μl와 1.5 ML 원뿔 튜브에 48 μl laminin과 증류수의 해결 방법 1 혼합 72 μl하십시오. </li><li>1.5 ML 원뿔 튜브의 20 % 자당 용액 60 μl와 혼합 용액이 60 μl PuraMatrix 솔루션. </li></ol><ol start="5"><li> PuraMatrix에서 세포의 embedment은 4 - 음 세포​​ 배양 판을 준비 두 우물의 소독 유리 커버 슬립 (직경 13mm)을 장소. 나중에 사용하기 위해 클린 벤치에 금속판을 저장합니다. 유리 커버 풀렸는데은 immunocytochemical 연구에 사용됩니다. 더 immunocytochemical stainings이 의도되지 않으면 단계는 생략 수 있습니다. </li></ol> 3D 공사장 공중 발판의 하나의 캡슐에 대한 hNPCs를 준비하려면 다음과 같은 솔루션을 준비하고 있습니다. 희석 요소 1:10.000의를 사용하여 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 용액에 Benzonase을 희석. Trypsin-Inhibitor/Benzonase 솔루션 믹스의 경우 : DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + 트립신 억제제 - (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> 인큐베이터에서 5 분 (37 ° C, 5 % CO 2) 500 μl 트립신 / Benzonase 솔루션과 부화를 추가하여 세포를 분리. Trypsin-Inhibitor/Benzonase 솔루션 반응을 중지합니다. 이후 3000 X G.에서 5 분 분리된 세포를 원심 분리기 5 ML 10 % 자당 솔루션 세포를 씻고 다시 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 10 % 자당 용액에 세포를 Resuspend, 최종 셀 솔루션은 1x10 6 셀 / ML을 포함해야합니다. </li></ol> 다음 단계는 1.8 1.11로이 때문에 세포에 대한 유해 수도 PuraMatrix 솔루션의 낮은 산도의 최대한 빨리 완료되어야합니다. <ol start="8"><li> 솔루션 1 세포 현탁액의 60 μl를 섞는다. </li><li> , 해결 방법 1 120 μl를 추가 솔루션 2 원뿔 튜브로 세포를 포함하고 조심스럽게 섞는다. </li><li> 각 커버에 즉시 혼합물의 장소 100 μl는 4 판에서 잘 살고 전표. </li><li> 당 잘 후에 2~3분 다른 200 μl를 천천히 200 μl 세포 배양 매체를 추가합니다. 이것은 모체의 자기 조립을 시작합니다. </li><li> 부화 C37 ells ° C, 열판 또는 클린 벤치의 가열 영역에 클린 벤치에서 1 시간을 위해. 이것은 매트릭스의 조립을 해칠 수도로 최대한 접시를 이동하지 않습니다. </li><li> 매체의 대부분을 제거 전부는 아니지만, 매트릭스는 1000 μl 피펫으로 건조 떨어지는 피하기 위해. 10 분에 대한 매트릭스를 씻어 중간 500 μl를 추가합니다. 마지막으로 매체를 제거하고 500 μl 신선한 매체를 추가하고 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)의 문화 판을 놓습니다. 매트릭스는 접시가 별도의 보육에 가능하면 같은 덜 가능한 이동 및 보관해야합니다 충격에 민감하다으로. </li><li> 여기에 사용된 hNPCs는 3D - 공사장 공중 발판을 7 일 동안 확산되었으며 차별화는 성장 요인 13 철수에 의해 시작되었다. 매체는 2-3일마다 변경되었습니다. </li></ol> 2. 2 부 : 전체 매트릭스의 Immunocytochemical 염색법 <ol><li> 얼룩 절차 사전에 하나는 준비가 필요 : AB5% 정상 염소 혈청 그리고 Triton X - 100 PBS, 0.1 M PBS에 따라 4 % paraformaldehyde 용액에 용해하여 4 솔루션 &#39;, 6 Diamidin - 2&#39;- phenylindoldihydrochlorid를 필요한 경우 (의 0.3 %로 구성된 잠금 버퍼 솔루션 PBS에 녹아있는 100 NG DAPI / ML을 포함하는 핵의 얼룩에 대한 DAPI). 샘플은 Mowiol와 DABCO의 혼합물과 함께 장착했다. </li><li> 매트릭스는 1000 μl 피펫으로 매체를 제거하고 5 분 번 PBS로 공사장 공중 발판을 씻어 씻어. </li><li> 공사장 공중 발판이 PBS를 제거하고 각 잘하는 paraformaldehyde 400 μl (0.1 M PBS 4 %)를 추가하고 실온에서 30 분 매트릭스를 품어 수정합니다. 고정 공사장 공중 발판은 몇 개월에 몇 주간을위한 최대 0.02 % 4 난이 3 ° C와 보충 PBS에 저장할 수 있습니다. </li><li> 얼룩에 앞서 5 분 PBS로 공사장 공중 발판을 씻으십시오. </li><li> 버퍼 솔루션을 차단에 공사장 공중 발판을 품어. 차단 솔루션은 세 번 매 2-3시간 및 subsequ 변경되었습니다ently 공사장 공중 발판은 4 박 이상 차단 솔루션 incubated되었습니다 ° C.는 </li><li> 차단 버퍼 용액을 제거, 1 % 정상 염소 혈청과 보충 PBS에 녹아있는 주요 항체를 추가하고 4 박 이상의 매트릭스를 품어 ° C. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거하고 세차 4 박 이상의 4 2 H에 대한 시간과 이후를 공사장 공중 발판 ° C를 PBS로. </li><li> PBS를 제거하고 PBS에 녹아있는 보조 항체와 솔루션을 추가 어두운 실내 온도 4 H를 위해, 1 % 정상 염소 혈청과 보충. </li><li> 4 박 이상의 1 H 및 이후 ° C 어둠에 대한 PBS 4-6 배로 샘플을 씻으십시오. </li><li> 핵의 얼룩 한 30 분 DAPI 용액 400 μl를 추가할 수 있습니다. </li><li> 하나는 현미경 슬라이드를 필요로하는 샘플을 마운트합니다. 현미경 슬라이드 50 μl Mowiol / Dabco을 추가합니다. 4 - 음 판의 커버 전표를 제거하고 장착 매체에 조심스럽게 올려. </li><li> 여기 Biozero 8000를 사용하여현미경은 (Keyence, 독일, 카를 스루에) 하나의 micrographs 및 Z - 스택을 얻을 수 있습니다. 각각의 스택은 1-2 μm의의 거리 30 사진을 하나 들어 있습니다. 해당 분석기 소프트웨어를 사용하여 형광에 내재된 부분은 Z - 스택이 생성되었습니다의 전체 계획하기 전에 제거되었습니다. </li></ol> 3. 제 3 부 : 유동세포계측법 분석을위한 공사장 공중 발판에서 hNPCs 공개 <ol><li> 공사장 공중 발판에서 세포의 출시로 사전에 500 μl HBSS와 공사장 공중 발판이 씻으십시오. </li><li> 세포 배양 매체를 포함 15 ML 원뿔 튜브에 1000 μl 피펫에 의해 공사장 공중 발판을 전송합니다. </li><li> 공사장 공중 발판을 방해하는 것은 기계적으로 1000 μl 피펫으로 세포 솔루션 여러 번 resuspend하고 이후 5 분 3,000 XG에서 솔루션을 원심. </li><li> 피펫으로 뜨는 제거 트립신 / Benzonase 솔루션 500 μl를 추가하고 세포 펠렛 여러 번 resuspend. </li><li> 5 분 전지를 품어37 ° 트립신 / Benzonase 솔루션 C. 반응 1 ML의 Trypsin-inhibitor/Benzonase 솔루션을 추가하고 여러 번 아래 피펫 및 중지합니다. </li><li> 세포 현탁액에게 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 두 ML의 HBSS 버퍼로 세포를 씻어. 이 단계를 두 번 반복합니다. 이 절차는 매트릭스 파편을 제거합니다. </li><li> 세포 현탁액 솔루션 트로프 집계를 제거하고 세포 배양 매체에있는 세포를 수집하기 위해 셀 스트레이너를 (구멍 크기가 70 μm의) 전달합니다. 얻은 세포는 다시 패치 클램프 또는 fluometric 측정과 같은 기능 연구를위한 표지 전표에 예 씨앗을하실 수 있습니다. 유동세포계측법에 대한 세포를 처리하기 위해 (4.1 참조) 즉시 세포를 수정. </li></ol> 4. 4 부 : 유동세포계측법에 의해 βIII - tubulin 양성 세포의 부량 <ol><li> 상온에서 15 분 1% PFA와 단계 3.7에서 얻어진 출시 세포를 수정. </li><li> 3000 XG와 remov에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기E 뜨는합니다. 필요한 경우, 전지가 ° C 나중에 분석을 위해 4 저장할 준비를하실 수 있습니다. 세척 버퍼 (PBS가 0.5 % BSA와 0.02 % 나 - azide와 보충)에 따라서 resuspend 세포. </li><li> 유동세포계측법 준비를 진행, 350 XG 10 분 세포 현탁액을 원심 분리기 뜨는을 버리고 항체 용액 25 μl의 세포를 resuspend. 따라서 첫 번째 항체는 농도 1:100 예 βIII - tubulin에 사포닌 버퍼와 혼합됩니다. 사포닌 버퍼는 0.5 %의 사포닌 농도, 0.5 %의 BSA 농도와 0.02 %의 나 - azide 농도로 PBS로 구성되어 있습니다. </li><li> 뿌리에서 상온에서 2 H에 대한 첫 번째 항체와 세포 현탁액을 품어. 대조군으로서 최초의 항체없이 샘플을 준비합니다. </li><li> 첫 번째 세척 단계에 대한 세포로 직접 300 μl 사포닌 버퍼를 추가합니다. 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 두 번째 세척 단계, 폐기뜨는은 300 μl 버퍼를 추가하고 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 제거하고 이차 항체 (예 : 알렉사 형석 647, 1:1000, 사포닌 버퍼에 용해)이있는 25 μl 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 보조 항체 1H와 세포를 품어. </li><li> 첫 번째 세척 단계에 대한 세포로 직접 300 μl 사포닌 버퍼를 추가합니다. 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 두 번째 세척 단계 들어, 뜨는을 버리고 300 μl 버퍼를 추가하고 350 X G.에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 취소하고 유동세포계측법 분석 500 μl 씻어 버퍼에있는 세포를 resuspend. </li></ol> 5. 대표 결과 자기 조립 히드로겔 발판 PuraMatrix에서 교양 hNPCs의 예제는 그림 1에 표시됩니다. hNPCs는 수정되지 않은 오후 구면과 같은 구조로 성장합니다. 이 문화 조건에서분야 간의 프로세스의 묶음은 (그림 1A) 볼 수 있지만 초, 세포는 거의, 전송 빛을 인식 수 없습니다. 사용 전지 종류의 문화 상황에 따라 매트릭스는 laminin를 추가하여 예 수정할 수 있습니다. hNPC 세포주에 대한 ReNcell VM (Millipore) laminin 적은 밀도 집계와 성장 패턴하지만 세포보다 균일한 분포 (그림의 1B)를 유도하기 위해 필요합니다. 수정의 독립, 매트릭스는 예 차별의 연결을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1C는 마커의 연결 βIII - tubulin에 대한 hNPCs의 얼룩을 선물한다. 이 예제에서는 세포가 모체에서 7 일 동안 재배되었으며 이후 분화가 성장 요인의 EGF와 bFGF 13. 셀 기관의 철회 및 세포 구축 프로세스의 고밀도 네트워크에 의해 유발되었다 4 일에 대한 차별화된 수 쉽게 인식. 그러나, 그것은 전화 번호의 부량가 많은 등, 시간이 소요됩니다 것을 분명모체의 다른 지역 사진은 통계 분석을 위해 신뢰할 수있는 데이터베이스를 얻을, 분석한다. 무화과 1D 하나의 매트릭스에서 출시하고 이후 표지 전표에 platted 세포의 예제를 볼 수 있습니다. 이러한 세포 기능 연구에 사용할 수 있습니다. 3D - 공사장 공중 발판에서 세포의 릴리스는 마커 단백질이나 AnnexinV / PI 염색법 또는 TUNEL 분석하여 세포의 생존율의 표현처럼 다른 매개 변수를 분석할 수있는 가능성을 제공합니다. 그림 2는 βIII - tubulin의 + 세포의 비율의 유동세포계측법 분석의 예를 보여줍니다. 부정적인 제어 (세포 βIII - tubulin에 대한 표시되지 않음) 그림 2A에 표시됩니다. 이러한 컨트롤은 βIII - tubulin + 세포의 이상 검출 (그림 2B)의 게이트를 결정하는 데 사용됩니다. 세포의 수동 계산 및 유동세포계측법하여 분석의 비교 그림 2C에 표시됩니다. βIII - tubulin의 + 세포의 비율은 determ되었습니다전체 휴대폰 번호 (핵 DAPI의 얼룩에 의해)과 형광 그림 βIII - tubulin +는 세포의 수를 세어 ined. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> 그림 1. hNPCs은 자기 조립 펩티드 히드로겔 PuraMatrix에 교양. 분야의 직경이 수백 μm의 최대가 될 수있는 PuraMatrix에 캡슐) hNPCs은 (PM), 구면, 고밀도 포장 구조에서 성장. 분야 사이에 하나는 세포 (화살표)에 의해 구축 프로세스의 번들을 확인할 수 있습니다. B) PuraMatrix에서 캡슐 세포는 laminin이 (PML) 자세한 homogenously 분산, 적은 고밀도 구조의 성장과 함께 보충. 행렬 하나가 덜 밀도 지역 (화살표)에서 단일 세포를 인식할 수 보충 laminin에서, 그러나 그것은 세포의 숫자를 정할 거의 가능합니다. C) hNPCs는 βIII - tubulin (녹색)과 같은 PML의 연결을 표현 마커 4 일 동안 차별. evalua하기하나는 DAPI (파란색)과 같은 핵의 얼룩으로 전체 휴대폰 번호를 확인할 수있다 긍정적인 세포 테 비율입니다. microphotograph는 Biozero - 8000 현미경으로 찍은 사진의 Z - 스택의 전체 투영을 선물한다. D) 매트릭스에서 발표된 전지는 추가 기능 연구에 대한 예를 들어 표지 전표에 씨앗을하실 수 있습니다. microphotograph는 이후 릴리스 절차 3D에 대한 교양 세포를 보여줍니다. βIII - tubulin에 대한 얼룩 (적색)는 3D 발판에서 호스팅하는 셀에 비교 형태를 보여준다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> 그림 2. 유동세포계측법 분석 전지는 PuraMatrix에서 발표했다. 우리가 PuraMatrix가 유동세포계측법하여 빠르게 분석에 대한 액세스를 제공에서 교양 세포를 릴리스하는 프로토콜을 사용 microphotographs의 시간이 소요 부량을 극복하려면 다음과 같이하십시오. A) 흠없는 세포는 이후 분석을 위해 게이트 (블랙 프레임)을 설정하기 위해 대조군으로 사용되었다예 βIII - tubulin의 세포. B) 부정적인 컨트롤에 설정된 동일한 문가, 사용했습니다 βIII - tubulin + 세포의 비율을 계량합니다. 긍정적인 세포는 중간 인구가 관찰되었다 X - 축 (점선 프레임), 가능성이 높습 대표 세포 파편의 오른쪽 부분에 나타납니다. C) 유동세포계측법로 가늠 수동 계산 세포와 세포의 비교 βIII - tubulin의 숫자의 시간 의존성 + 유동세포계측법 프로토콜의 안정성을 나타내는 비교할되었다 긍정적인 세포의 훨씬 높은 비율을 공개했다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

3D - 공사장 공중 발판의 사용은 세포 배양 상황에 가까이 생체내 상황에서 다른 세포 유형의 개발을 연구하는 기회를 제공합니다. 그러나, 예를 들어의 연결을 차별하거나 한 세포 유형의 예 부량에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 몇 가지 장애물을 극복하기 위해이 기능 연구의 분석에 관한. 여기 발판 PuraMatrix 및 FACS 또는 기능 assays 같은 도구에 쉽게 액세스를 제?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> PuraMatrix 펩타이드의 히드로겔 </td><td> Bioscience BD </td><td> 354,250 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 laminin I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 </td><td> S9378 - 1KG </td><td></td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X 100 </td><td> 로스 </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 1X </td></tr><tr><td&gt; βIII - tubulin 항체 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC - 51670 </td><td> 단클론 마우스, 1:500 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,029 </td><td> 염소 α 마우스, 1:1000 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 568 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,031 </td><td> 염소 α 마우스, 1:1000 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 647 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,235 </td><td> 염소 α 마우스, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 시약 </td><td> Calbiochem </td><td> 475,904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> 올드 리치 </td><td> D2 ,780 - 2 </td><td> 1,4 - Diazabicyclo [2.2.2] 옥탄 98% </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,350 </td><td> 70 μm의 기공 크기 </td></tr><tr><td> 사포닌 </td><td> 머크 </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신/ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / μl </td><td> 머크 </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 억제제 </td><td> 시그마 </td><td> T6522 (500 MG) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> 인간 알부민 Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

성장, 증식 그리고 마지막의 연결을 차별화에 대한 3 차원 (3D) 공사장 공중 발판의 영향은 신경 장애 또는 neurodegenerative 질병에서 세포 기반 및 표준 치료에 대한 새로운 방법을 찾기 위해 큰 관심입니다. 3D 구조는 2D 문화보다 생체내 상황에 더 가까워지는 환경을 제공 것으로 예상된다. 재생 의료의 맥락에서 신경 줄기 및 전구 세포로 biomaterial의 공사장 공중 발판의 조합 치료 도구로 큰 약속을 보유하고 있습니다. 3 차원 환경을 에뮬레이션 1-5 문화 시스템과 줄기의 다양한 유형의 증식과 분화에 영향을 표시되었습니다 전구 세포. 여기에, 3D - microenviroment의 형성과 functionalisation가 포함된 세포의 생존과 운명을 결정하는 것이 중요합니다. 6-8 여기 PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), 펩타이드 기반 히드로겔 발판을 사용잘 설명하고 다른 세포 유형에 3D - 환경의 영향을 연구하는 데 사용되는. 7,11-14 PuraMatrix 쉽게 사용자 정의와 나노 섬유의 합성 제조 어느 높은 신뢰성의 3D 문화 시스템을 제공 수 또한 외부의 자유입니다. 최근 우리는 발판의 형성에 대한 PM - 농도의 영향을 연구했습니다. 본 연구에서는 13 PM의 사용 농도는 원자 힘 현미경에 의해 입증되었다 3D 구조의 형성에 직접적인 영향을 미쳤다. hNPCs의 생존과 분화의 후속 분석은 내장 세포의 운명에 대한 PM의 사용 농도의 영향을 밝혔다. 그러나, immunofluorescence 기법의 posses 어떤 장애물에 의해 생존의 연결이나 분화의 분석. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면 하나는 예의 상대 번호를 얻기 위해 매트릭스 내에서 세포의 총 수를 결정한다. βIII - tubulin에 의한 표시의 연결을 세포. 이 전제 조건이 표본의 Z - 스택을 취할 수 형광 현미경과 같은 공촛점 현미경 또는 유사한 기술의 모든 3 차원에있는 공사장 공중 발판을 분석하는 기술. 또한 이러한 종류의 분석은 매우 시간이 소요됩니다. 여기 유동세포계측법하여 나중에 분석 예에 대한 3D - 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 ReNcell VM 셀 라인의 인간 신경 전구 세포 (hNPCs) (Millipore 미국)가 교양되었으며 laminin (PML)과 보충 PuraMatrix (PM) 또는 PuraMatrix 구성 3D - 공사장 공중 발판으로 차별. 우리 손에 0.25 %의 PM - 농도 그러나 농도가 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다. 12이 출시 세포 유동세포계측법 예를 들면 immunocytochemical 연구에 사용되며 이후 분석할 수, 세포 13 재배를위한 최적했습니다. 분석 및 MO,이 속도데이터의 신뢰성을 향상보다 기본에, 얻은 데이터 휴식을 통해 다시.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K 조회수.  University of Rostock. 여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

연구

생체공학

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

3T의 fMRI에 Haptic 로봇의 적응

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

강력한 접착력 하이드로겔, 젤라틴 O-니트로소벤즈알데히드의 합성

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...