Ce travail a été soutenu par Marie Curie international prime de réintégration.

1. Fabrication de périphériques <ol><li> Acheté DTPA-D SU-8 moisissure et la moisissure contrôle SPR220-7 découlent de la Fonderie Stanford Microfluidique ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / group / fonderie</a> ). </li><li> Exposer les moules en silicone à chlorotriméthylsilane (TMCS) la vapeur pendant 10 min pour favoriser la libération élastomère après les étapes de cuisson 9. </li><li> Préparer un mélange à base d&#39;élastomère de silicone et l&#39;agent de durcissement (bien mélanger) dans deux rapports différents 5:1 et 20:1 pour le contrôle de flux et de moules, respectivement. Les différents rapports sont nécessaires pour une bonne adhérence des couches multiples. </li><li> Verser le PDMS 5:1 sur la couche de contrôle (environ 5 mm de hauteur). Degas la couche de contrôle et faire cuire pendant 30 min à 80 ° C. Dépôt à la tournette (Laurell, France) le mélange 20:1 PDMS sur le débit de la couche à 2.600 tours par minute pendant 60 secondes, puis le faire cuire à 80 ° C pendant 30 min. La vitesse tournette est optimisé pour la commande de la soupape à une pressionde 15 psi. Filage rapide se traduira par une mince couche de plus faible pression d&#39;activation, et inversement. Les appareils que nous utilisons ont une limite de 25 psi dans le contrôle et 10 psi dans le flux, au-dessus duquel le détachement du substrat peut se produire. </li><li> Séparer la couche de contrôle du moule. Faites-le lentement et veillez à ne pas peler le modèle SU8. Ensuite, couper l&#39;appareil autour de son périmètre et de percer des trous pour accéder aux canaux de contrôle. </li><li> Aligner le flux et niveaux de contrôle manuellement sous un stéréoscope. Commencez par aligner le coin supérieur gauche, la valve bouton (couche de contrôle) doit être au milieu de la chambre de réaction (couche d&#39;écoulement). Ensuite, aligner la première rangée et relâchez doucement la rangée couche de contrôle par ligne. Assurez-vous que toutes les vannes des boutons sont dans le milieu des chambres de réaction et que les valves d&#39;entrée d&#39;adresse et de traverser les canaux d&#39;écoulement à la position correcte. Le processus peut être répété jusqu&#39;à ce que toutes les lignes locales sont alignés. A la fin, relâcher toute tension dans le b PDMSy soulevant avec soin sur les côtés et dans les coins. Ne soulevez pas trop ou mauvais alignement peut se produire. </li><li> Faire cuire pendant 2 heures à 80 ° C. </li><li> Couper autour du périmètre de l&#39;appareil et le zeste de l&#39;appareil à deux couches (puce) du moule débit. Percer des trous pour accéder aux canaux d&#39;écoulement (Figure 1). </li></ol> 2. Rangement de l&#39;ADN et l&#39;alignement de périphériques <ol><li> Produire des gènes synthétiques par PCR d&#39;assemblage. Les gènes synthétiques sont composer du promoteur T7, site de liaison ribosomique (RBS), ORF avec deux marqueurs épitopiques (un à chaque extrémité), et terminateur T7 4. Les gènes peuvent varier en longueur de 100 pb jusqu&#39;à, au moins, 5.000 pb. </li><li> Préparer les gènes synthétiques pour ranger: préparer un mélange d&#39;éthylène glycol de poly (1,25%) et D-tréhalose dihydrate (125 mg / ml) et de distribuer 2 pi par réaction en plaque 384 puits. Cette solution réduit la liaison irréversible de l&#39;ADN de la vitre, ainsi que pour la visualisation lors de l&#39;alignement 10. </li&gt; <li> Transférer les gènes de synthèse de la plaque 384 puits. Habituellement concentrations d&#39;ADN peut varier de 10 ng / ul à 100 ng / ul concentration finale. Ajouter dH 2 O pour un volume final de 20 pi (dépend de puces à ADN et le type de broche). </li><li> Détecter une série de gènes synthétiques sur des substrats en verre revêtus époxy en utilisant un puces à ADN. Nous utilisons MicroGrid 610 (Bio Robotics) avec des épingles silicone SMT-S75 (Synthèse parallèle, Etats-Unis). Communiquer avec l&#39;impression de l&#39;ADN, avec ces repères spécifiques, des résultats de taches d&#39;un diamètre d&#39;environ 100 um sur la surface du verre. Chaque chargement broches est suffisant pour environ 100 places. Assurez-vous que les emplacements colonnes et de lignes correspondent à l&#39;appareil utilisé. Le dispositif que nous utilisons contient 16 colonnes et 40 lignes avec un terrain de 680 um de 320 um, respectivement. </li><li> Aligner manuellement le dispositif microfluidique pour l&#39;ensemble de gènes sous un stéréoscope. Le spot ADN doit être dans le milieu des chambres d&#39;ADN. Début de l&#39;alignement en plaçant la première rangée de taches below la première rangée de chambres d&#39;ADN. Ensuite, mettre en ligne le reste des lignes de finition avec un réglage fin de l&#39;ensemble du dispositif. Une fois que le tableau est aligné des précautions doivent être prises pour atténuer le stress tout en PDMS, en le soulevant au niveau local. Si la tension est laissé dans le PDMS il ne peut pas bien adhérer à la puce. </li><li> Enfin, le dispositif de liaison de la lame de verre par incubation d&#39;une nuit sur une plaque chauffante à 80 ° C. </li></ol> 3. D&#39;amorçage et activer le dispositif <ol><li> Les vannes de la couche de contrôle sont actionnés à partir de l&#39;ordinateur en utilisant LabVIEW. Le script LabVIEW contrôle une série de microélectrovannes via un boîtier de commande électronique (acheté chez Stanford Microfluidique Foundry). Le collecteur d&#39;électrovanne est reliée à l&#39;air comprimé, qui commandent le flux d&#39;air et la pression dans les soupapes de commande de l&#39;appareil. </li><li> Connecter le dispositif à la tubulure d&#39;électrovannes à l&#39;aide d&#39;un tube flexible en matière plastique d&#39;un diamètre intérieur de 0,02 &quot;(Tygon) Et goupille en acier inoxydable (New England Petit Tubes Corporation). </li><li> Remplir les tubes avec DDW et insérer la broche dans les trous d&#39;accès de la couche de commande. Assurez-vous que chaque tube est relié à son canal de commande correspondant. </li><li> Exécutez l&#39;application LabVIEW sur l&#39;ordinateur pour activer les canaux de contrôle. En activant la vanne à partir du script LabVIEW, nous appliquons une pression d&#39;air, qui à son tour va pousser l&#39;eau dans les canaux de contrôle PDMS. Régler la pression d&#39;air à 5 psi. Il est recommandé de remplir le «sandwich» et les vannes première adresse, afin d&#39;identifier croisées pourparlers entre les canaux de commande des appareils défectueux. En cas de contre-discussions, l&#39;actionnement de la ligne «sandwich» de contrôle conduira à l&#39;actionnement de l&#39;une des lignes du cou ou du contrôle Button. Ceci est similaire à un court-circuit dans un circuit électrique. Dispositif de diaphonie est défectueux et ne peut pas être utilisé. </li><li> Une fois que tous les canaux de contrôle et les vannes sont pleins de DDW, les vannes sont amorcées et raisonsdy pour bloquer les canaux d&#39;écoulement en dessous. Augmenter la pression de l&#39;air à 15 psi. Activation de la vanne est commandée à partir d&#39;un programme LabVIEW grâce à un ensemble de commutateurs ON / OFF connectés à des électrovannes individuelles. Chaque interrupteur commande une ligne de commande spécifique par son électrovanne correspondante. Allumer l&#39;interrupteur (dans le script) appliquer une pression d&#39;air dans le tube correspondant. La pression d&#39;air va pousser le DDW dans la ligne de commande et se traduira par l&#39;expansion des vannes microfluidiques, en bloquant le canal en dessous. La désactivation d&#39;une vanne de régulation, libérera la pression de l&#39;air et ensuite libérer le blocage du canal d&#39;écoulement respectif. </li><li> Afin de s&#39;assurer que toutes les vannes sont ouvertes, raccorder un tuyau à l&#39;une des entrées de débit et de débit d&#39;air dans le dispositif à psi 4-5. Cela libérera des soupapes grippées de la lame de verre. </li><li> Enfin, le dispositif est amorcée et prête. Fermez toutes les entrées et &quot;cou&quot; vannes, pour commencer la chimie de surface. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Chimie de surface <ol><li> Afin de faciliter l&#39;auto-assemblage d&#39;un réseau de protéines à la surface et empêcher l&#39;adsorption non spécifique dans le dispositif microfluidique, la surface est modifiée chimiquement: </li><li> Un composant de s&#39;écouler à travers le dispositif, connecter un nouveau tube avec la solution requise à l&#39;un des canaux d&#39;écoulement dans le dispositif. Relier le côté libre du tube collecteur à l&#39;emploi et ouvrir le flux d&#39;air sous pression (5 psi). </li><li> Chargez 40 pl de la biotine-BSA (1 pg / pl) dans un nouveau tube et le débit environ la moitié de celui-ci pendant 20 min à travers le dispositif, la BSA va se lier à la surface époxy. </li><li> Utiliser Hepes (50 mM) pour le lavage de substrat n&#39;ayant pas réagi entre chacune des différentes étapes de chimie de surface. </li><li> Débit 25 streptavidine ul (0,5 pg / pl) pendant 20 minutes au-dessus de la biotine-BSA. </li><li> Laver avec de l&#39;HEPES pendant 5 min. </li><li> Fermer le bouton «soupape et s&#39;écouler le reste de la biotine-BSA (comme décrit ciLit ci-dessus), la passivation de la surface entourant le bouton. </li><li> Laver avec de l&#39;HEPES pendant 5 min. </li><li> Relâchez le bouton «soupape et le débit 30 ul de penta-His-biotine (0,16 pg / pl) pendant 20 min. L&#39;anticorps se lie à la streptavidine exposés, plus précisément à l&#39;aire sous la «touche» la création d&#39;un anti His-tag tableau. </li></ol> 5. Expression de la protéine <ol><li> Exprimer les protéines de l&#39;appareil à l&#39;aide de réticulocytes de lapin couplé transcription rapide et réaction de traduction. L&#39;expression des protéines à partir des gènes synthétiques tachetés sur l&#39;appareil crée un tableau de protéines prêtes à l&#39;emploi. Par exemple, une telle utilisation est pour un écran protéine de liaison. </li><li> Ouvrez les &quot;cou&quot; vannes et de réticulocytes de lapin flux de transcription rapide et couplé réaction de traduction à travers le dispositif dans la chambre de l&#39;ADN. Ensuite, fermez les vannes &#39;sandwich&#39; et séparer chaque gène de son environnement. Incuber l&#39;appareil sur une plaque chauffante pendant 2,5 heures à 30 ° C. Exprimé proteins se diffuse à partir de la chambre de l&#39;ADN à la chambre de réaction spontanée (vanne col est ouvert) et se lient à l&#39;anticorps anti-His sous le bouton «soupape de blocage de la protéine par l&#39;intermédiaire de son extrémité C-terminale variable. </li><li> Étiqueter les protéines avec C-myc Cy3. L&#39;anticorps se lie à son épitope correspondant situé à l&#39;extrémité N-terminale des protéines. </li><li> Déterminer les niveaux d&#39;expression de protéines avec un scanner de microréseau (LS Reloaded, Tecan) en utilisant un laser à 532 nm et 575 nm d&#39;émission filtre. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs 1. Fabrication de périphériques Une conception graphique pour le périphérique a été créé par AutoCAD en fonction de nos besoins expérimentaux. La conception a été imprimé sur un film transparent par une flasheuse haute résolution. Cette transparence constitue un photomasque en photolithographie contact. Une technique de micro-usinage de surface a été utilisée pour créer des modèles 3-D sur une tranche de silicium déterminée par les motifs inscrits sur til masque utilisé. Le dispositif microfluidique a été fabriqué sur moule en silicone de moulage en élastomère de silicone (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) (Figure 1). Chaque dispositif est constitué de deux couches de PDMS alignés, le débit et la couche de contrôle. Le moule a été exposé à chlorotriméthylsilane (TMCS, Aldrich) la vapeur pendant 10 min pour favoriser la libération élastomère après les étapes de cuisson. Un mélange à base d&#39;élastomère de silicone et l&#39;agent de durcissement est préparé en deux taux différents 5:1 et 20:1 pour le contrôle de flux et de moules, respectivement. La couche de contrôle a été dégazé et cuit pendant 30 min à 80 ° C. La couche d&#39;écoulement a d&#39;abord été appliquée par centrifugation (Laurell, USA) à 2.600 tours par minute pendant 60 sec et cuit à 80 ° C pendant 30 min. La couche de contrôle a été séparé de son moule et de contrôle des trous ont été percés de canaux d&#39;accès. Ensuite, les couches de flux et de contrôle ont été alignées manuellement sous un stéréoscope et cuire pendant 2 heures à 80 ° C. Le dispositif à deux couches a été pelées from le moule débit et trous d&#39;écoulement d&#39;accès canaux ont été percés. 2. Description de l&#39;appareil La capacité de l&#39;appareil peut varier de 500 à 10.000 cellules unitaires (figure 2). Le dispositif est constitué de deux couches, une couche d&#39;écoulement (gris) et de la couche de commande (couleur). La couche de contrôle contiennent une variété de vannes avec fonction différente. Chaque cellule élémentaire, dans la couche d&#39;écoulement, est composé d&#39;une ADN et une chambre de réaction et est commandé par trois types de vannes micromécaniques; «col», «bouton», et «sandwich» (figure 2A). «Gène synthétique» Un tacheté déposé dans la chambre de l&#39;ADN est bloqué à partir de la chambre de réaction par le «cou» de vanne (vert). Lavage de piégeage mécanique et de protéines de surface reliés à la chambre de réaction est réalisée par le «bouton» de soupape (bleu). Le «sandwich» permet à chaque vanne réaction se produise dans sa cellule propre unité (rouge). Les vannes d&#39;adresses peut diviser l&#39;appareil jusqu&#39;à 8 sections indépendantes, des différeanalyse la condition nt. En outre, la couche de commande de soupapes d&#39;entrée contient permettant l&#39;écoulement de fluide sélectionné dans la couche d&#39;écoulement. Les canaux de contrôle PDMS sont pleines de GFI. Quand une valve est actionnée de l&#39;augmentation de pression (15 psi) entraîne l&#39;expansion du PDMS. Dans les endroits où la membrane est assez mince (c.-à-croisement des lignes de commande et de débit), cela suffit pour bloquer complètement la ligne d&#39;écoulement. Hauteur moyenne de cellule unitaire est de 10 um, et le volume moyen de cellule unitaire est inférieure à 1 nl. 3. Expression des protéines et la détection Les protéines ont été exprimées sur le périphérique à l&#39;aide de réticulocytes de lapin couplé transcription rapide et réaction de traduction (Promega). L&#39;expression des protéines créé un réseau de protéines prêts à l&#39;emploi dans un écran de liaison (figure 3). Un mélange d&#39;expression (12,5 pi) a été chargé dans l&#39;appareil, puis inondées dans les chambres de l&#39;ADN en ouvrant les «cou» vannes. Ensuite, les &#39;sandwich&#39; vannes étaientfermé en laissant chaque cellule unitaire séparé de ses cellules voisines et le dispositif a été incubé sur une plaque chauffante pendant 2,5 heures à 30 ° C. Protéines exprimées diffusé à travers la chambre de gène dans la chambre de réaction, où l&#39;extrémité C-terminale His pouvant lier le anticorps anti-His (Qiagen) localisé sous le bouton «soupape de blocage de la protéine à la surface. Les protéines ont été marquées avec un Cy3 C-myc (Sigma), qui limite à son épitope correspondant situé à l&#39;extrémité N-terminale des protéines et étiquetés. Les niveaux d&#39;expression des protéines ont été déterminées avec un scanner de microréseau (LS Reloaded, Tecan) à l&#39;aide d&#39;un laser 532 nm et 575 nm filtre. Le réseau de protéines résultant consiste à faire varier les niveaux d&#39;expression des protéines. Généralement, environ 20% d&#39;une banque de gènes ne pas exprimer à des niveaux détectables. Aucune corrélation avec la taille de la protéine a été observée 3. Niveaux de référence ont été déterminés en utilisant des chambres qui n&#39;ont pas été repérés avec l&#39;ADN. Ainsi, les signaux issus des chambres de protéines correspondantes sont dues soit à noise ou adsorption non spécifique des anticorps d&#39;étiquetage. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Fabrication puce. (A) Les moules ont été traités avec des vapeurs TMCS pendant 10 min. (B) PDMS est coulé sur le contrôle et moules en silicone de débit. (C) deux moules de commande d&#39;écoulement et sont cuits en 80 ° C pendant 30 min. (D) la couche de contrôle du moule pelées, découpées et les entrées de commande sont perforées. (E) la couche de commande est alignée sur la couche d&#39;écoulement sous un stéréoscope et ensuite cuite dans 80 ° C pendant 2 heures. En parallèle à la fabrication de dispositifs en PDMS, une série de gènes synthétiques sont microarrayed époxy sur des substrats de verre (Associés CEL). (F) Le dispositif est alors aligné sur la puce à ADN piéger les «gènes synthétiques» dans les chambres d&#39;ADN. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Une photo de l&#39;appareil PING. (A) Le dispositif consist de deux couches de PDMS alignés (contrôle et les flux). Le débit de la couche contenant l&#39;ADN et parallèles chambres de réaction (gris) commandés par des soupapes micromécaniques (&quot;bouton&quot;, &quot;sandwich&quot; et &quot;col&quot;) dans la couche de commande. (B) Les couches sont alignées sur un microréseau imprimé, dont les programmes de chaque chambre de l&#39;ADN avec un seul point. Cela élimine tout risque de contamination. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Images fluorescentes d&#39;un réseau de protéines Créé avec une puce microfluidique. Les gènes imprimés sur place ont été exprimés à des protéines au sein de l&#39;appareil (dans la chambre de l&#39;ADN) et ont tiré vers le bas à la surface (en dessous du &quot;bouton&quot; valve dans la chambre de réaction) à travers leur Son extrémité C-terminale tag. L&#39;expression des protéines a été détectée à l&#39;aide de leur C-myc tag extrémité N-terminale et un anticorps fluorescent spécifique. Différentes intensités de signal indiquent différents niveaux d&#39;expression des protéines. Un-spotted chambres ont servi de témoins pour le fond levels.

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	<li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+Microfluidic+high-throughput+screening.">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li><li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanoliter+systems.">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li><li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks.">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li><li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis.">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li><li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis.">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li><li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li><li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li><li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li><li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supports+for+microarray+immunoassays.">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li><li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B.">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous présentons une méthode de génération de puces à protéines à haut débit en utilisant une plate-forme microfluidique. La génération tableau sont basées sur le microréseau d&#39;impression de matrices d&#39;ADN et l&#39;expression de protéines in vitro de l&#39;ADN dans le dispositif microfluidique. Notre nouvelle plate-forme microfluidique présente plusieurs avantages importants par rapport aux méthodes actuellement utilisées, qui en fon...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Chlorotriméthylsilane (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Substrats de verre enduits époxy </td><td> Associés CEL USA </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poly éthylène glycol (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-tréhalose dihydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinylé-BSA </td><td> Percer </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidine </td><td> Percer </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-biotine </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Industries biologiques</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Boîtier de commande </td><td> Stanford Microfluidique Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Moule </td><td> Stanford Microfluidique Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England Petit Tubes Corporation </td><td></td></tr><tr><td> Tygon tube microbore </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Puces à ADN </td><td> Bio Robotique </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Broches en silicone </td><td> Parallèlement Synthèse </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Domaines en croissance rapide, tels que la biologie des systèmes, exigent l&#39;élaboration et la mise en œuvre de nouvelles technologies, permettant des mesures à haut débit et haute-fidélité de grands systèmes. Microfluidique promet d&#39;accomplir beaucoup de ces exigences, comme la réalisation d&#39;expériences de criblage à haut débit sur ​​puce, englobant des dosages biochimiques, biophysiques et basée sur des cellules 1. Depuis les premiers jours de dispositifs microfluidiques, ce domaine a considérablement évolué, conduisant à l&#39;élaboration de microfluidique intégration à grande échelle 2,3. Cette technologie permet l&#39;intégration de milliers de vannes micromécaniques sur un seul appareil avec une empreinte d&#39;affranchissement entreprises (figure 1). Nous avons développé une plate-forme microfluidique à haut débit pour générer l&#39;expression in vitro de puces à protéines (figure 2) nommés PING (Générateur de réseau d&#39;interactions protéiques). Ces tableaux peuvent servir de modèle pour de nombreuses expériencescomme protéine-protéine 4, protéine-ARN 5 ou protéine-ADN 6 interactions. Le dispositif se composent de milliers de chambres de réaction, qui sont programmés individuellement à l&#39;aide de puces à ADN a. Alignement de ces puces microfluidiques imprimés à dispositifs programmes chaque chambre avec un seul point d&#39;éliminer la contamination potentielle ou réactivité croisée ailleurs, générant des puces utilisant des techniques de puces à ADN standards de repérage est également très modulaire, permettant le rangement de protéines de l&#39;ADN 7, 8, petites molécules, et même des suspensions colloïdales. L&#39;impact potentiel de la microfluidique sur les sciences biologiques est significative. Un certain nombre d&#39;essais basés sur la microfluidique ont déjà fourni des informations nouvelles sur la structure et la fonction des systèmes biologiques, et le domaine de la microfluidique continueront d&#39;influer sur la biologie.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Nous présentons une approche microfluidique pour l&#39;expression de puces à protéines. Le dispositif se compose de milliers de chambres de réaction contrôlées par des micro-mécaniques vannes. Le dispositif microfluidique est couplé à une bibliothèque de gènes microréseau imprimé. Ces gènes sont ensuite transcrits et traduits sur puce, résultant en un réseau de protéines prêt à l&#39;emploi expérimental.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

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Bioengineering

11.6K vues.  Bar-Ilan University. Nous présentons une approche microfluidique pour l'expression de puces à protéines. Le dispositif se compose de milliers de chambres de réaction contrôlées par des micro-mécaniques vannes. Le dispositif microfluidique est couplé à une bibliothèque de gènes microréseau imprimé. Ces gènes sont ensuite transcrits et traduits sur puce, résultant en un réseau de protéines prêt à l'emploi expérimental.

Vidéo: High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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Bio-ingénierie

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...