Nous remercions Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond et à tous les membres passés et présents du laboratoire Berger de l&#39;aide et des conseils. La plate-forme MultiBac et son développement ont été et sont généreusement financés par des organismes de financement, notamment le Fonds national suisse (FNS), l&#39;Agence Nationale de Recherche (ANR) et le Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) et la Commission européenne (CE) dans les programmes-cadres (PC) 6 et 7. Soutien à l&#39;accès transnational est fourni par les projets du 7e PC CE P-CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) et BioSTRUCT-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). Le ministère français des sciences est particulièrement reconnu pour soutenir la plate-forme MultiBac à l&#39;EMBL à travers l&#39;Investissement d&#39;Avenir projet FRISBI.

1. Tandem recombineering (TR) pour créer des constructions d&#39;expression multigénique <ol><li> Planification de la stratégie de co-expression. approche de conception pour insérer vos gènes d&#39;intérêt en donneurs et accepteurs. Sous-modules physiologiques potentiels de votre complexe doivent être regroupés sur accepteurs et donneurs spécifiques. Utilisez module de multiplication composée de endonucléase Homing (HE) - paires BstXI de combiner des cassettes d&#39;expression sur différents donateurs et des plasmides d&#39;accepteurs 7,8 Créer toutes les constructions pertinentes in silico et valider la stratégie complètement avant de procéder à des travaux expérimentaux.. Par exemple, des gènes d&#39;intérêt doivent être vérifiés ne contiennent pas de SE ou d&#39;autres sites de restriction et la présence de cadres de lecture ouverts (ORF correctes) doit être validée. Pensez à commander des gènes synthétiques optimisés pour les insectes usage des codons de la cellule et la structure secondaire de l&#39;ARNm pour améliorer les niveaux de production de protéines ainsi que la suppression de toute exiHE sites à partir des gènes d&#39;intérêt piquer. Pensez à placer des étiquettes de purification basé sur les données de la littérature sur N-ou flexibles ou exposés extrémités C-terminales des protéines de vos choix. Envisager d&#39;appliquer des stratégies de polyprotéine qui visent à produire plusieurs sous-unités protéiques dans votre complexe si les quantités relatives de protéines individuelles doivent être contrôlés en raison de problèmes de stœchiométrie dans le complexe. 4 Préparez détaillées &quot;How-To&quot; documents (cahier de laboratoire électronique est recommandé) contenant toutes les mesures expérimentales prévus du projet menant à la construction multigénique complète (s). Créer des fichiers électroniques des plasmides fusionnés Cre-loxP par exemple en utilisant le logiciel Cre-ACEMBLER qui peut être téléchargé à partir de la page d&#39;accueil Berger groupe ( <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler</a> ). </li><li> Insérez vos gènes d&#39;intérêt dans certains bailleurs de fonds etAccepteurs en utilisant des enzymes de restriction et la ligase, ou encore en utilisant des méthodes indépendantes de ligature en suivant des protocoles publiés 5,6,14. Si vous avez accès à une manipulation de liquides poste de travail et si vous prévoyez un grand nombre de constructions doit être généré ( par exemple pour des approches combinatoires) considèrent l&#39;utilisation de scripts robotique développés et mis en œuvre par le groupe Berger (Figure 2). 14,15 Si une manipulation de liquides poste de travail n&#39;est pas disponible, le mode manuel en utilisant microplaques permet l&#39;insertion d&#39;un gène dans un HT comme la mode. </li><li> Les contraintes imposées par la nécessité de contrôler la stoechiométrie des sous-unités exprimées peuvent se matérialiser. Dans le cas des niveaux d&#39;expression déséquilibre stoechiométrique de sous-unités individuelles d&#39;un complexe protéique, envisager d&#39;appliquer des stratégies de la polyprotéine de conjoindre plusieurs sous-unités de votre complexe et une protéase spécifique (par exemple le tabac etch virus NIa protéase) au seul grand ORF espacés de sles sites protéolytiques particulières d&#39;intervention. 4,8 considérer co-exprimant un ou plusieurs polypeptides, avec des cassettes d&#39;expression simples si vous avez un très grand complexe avec de nombreuses sous-unités et largement allant des poids moléculaires de sous-unités individuelles. Considérez co-exprimant plusieurs gènes codant pour la même protéine dans une polyprotéine ou plusieurs cassettes d&#39;expression identiques si cette protéine est caractérisée par faible rendement de production. 4,13 </li><li> Validez toutes les constructions donneur et accepteur clonés par cartographie de restriction (éventuellement en haut débit) et le séquençage. Procéder à fusionner combinaisons donneur-accepteur par Cre-loxP recombinaison pour produire les constructions d&#39;expression multigénique de choix. Valider plasmides de fusion accepteur-donneur purifiée par cartographie de restriction, utiliser des séquences électroniques créés par Cre-ACEMBLER ou des programmes similaires comme référence. </li><li> Stocker donateurs purifiés et validé, des accepteurs et des fusions donneur-accepteur à -20 ° C ou -80 ° C. Archive plasmids et leurs séquences (Microsoft Excel, Filemaker, autres) avec soin pour un usage ultérieur. </li></ol> 2. Multigénique Composite baculovirus production, l&#39;amplification et le stockage <ol><li> Intégrer les vecteurs de transfert de multigéniques le génome baculoviral MultiBac en se transformant en cellules DH10 hébergeant le génome viral et les fonctionnalités requises pour Tn7 transposition. Notez que le génome baculoviral MultiBac peut être préchargé avec des gènes d&#39;intérêt particulier (YFP marqueur, accompagnateurs, etc) dans son propre site LoxP (conçu dans le génome distal du site de fixation Tn7) par une in vivo Cre réaction précédant Tn7 intégration. 13 Après Tn7 transposition, les cellules avec baculovirus composite contenant les gènes d&#39;intérêt sont sélectionnés par criblage bleu / blanc (succès Tn7 résultats de transposition en perte d&#39;α-complémentation de la β-galactosidase, par conséquent, les colonies ayant correct Tn7 transposition restent blanches sur sélectif uneplaques gar contenant X-gal) et le génome est préparé par lyse alcaline et de l&#39;éthanol / précipitation à l&#39;isopropanol. 5,6 </li><li> La transfection et la production de virus initial. Plaque de culture tissulaire à 6 puits lieu dans hotte stérile. De Sf21 culture de cellules d&#39;insecte log-de phase, semence aliquotes de cellules dans les puits et transfectées par l&#39;ajout du génome baculoviral purifiée et un réactif de transfection mélangés dans un milieu de culture tel que décrit. 6 récolte de virus initial après 48-60 heures en retirant les médias ( de haute qualité, faible titre virus V 0, typiquement de 3 ml par puits). Supplément milieux frais et essais pour la production de protéines (et, si un marqueur YFP est présent, par fluorescence) après encore 2-3 jours. 6,7 </li><li> Amplification du virus, faible MOI régime. Utilisez V 0 virus d&#39;infecter 25-50 ml de cellules en phase log (densité cellulaire &lt;1x10 6 cellules par ml) dans un petit (100-250 ml) Erlenmeyer shaker flacons agitéssecoueurs sur des plates-formes orbitales (Figure 3). Compter les cellules et diviser chaque h 24 jusqu&#39;à ce que les cellules cessent de doublement (prolifération arrestation). Suivre un régime faible MOI (multiplicité d&#39;infection à savoir le nombre de particules virales par cellule): Les cellules doivent doubler (au moins) une fois (MOI &lt;1), sinon répéter l&#39;expérience avec un petit volume de V 0 ajouté. Normalement, 3 ml de V 0 sont utilisés pour infecter 25 ml de cellules d&#39;insecte Sf21 à une densité de 0.5x10 6 cellules / ml. Cela est essentiel pour prévenir préjudiciable sur-amplification et l&#39;auto-suppression de virus qui peut entraîner la perte des gènes hétérologues d&#39;intérêt. Récolte V 1 virus (25-50 ml) après 48-60 heures par granulation cellules et enlever le support contenant le virus. Supplément par des milieux frais et essai pour YFP et la production de protéines en éliminant les cellules 1x10 6 toutes les 12 ou 24 heures, la granulation et la validation de la production de protéines et de signal de la protéine marqueur (YFP). 6 Amplifier virus (àV 2) plus loin si des volumes plus importants d&#39;expression visent à en infectant jusqu&#39;à 400 ml de cellules dans 2 L shaker flacons avec V 1 virus respect de ce qui précède bas régime MOI (cellules doivent doubler au moins une fois après l&#39;infection par V 1). Rigoureusement tester la production de protéines et de signal de protéine de marquage pendant l&#39;amplification afin d&#39;éviter l&#39;accumulation des virus défectifs ne contenant plus les gènes d&#39;intérêt. Culots cellulaires d&#39;utilisation 5-7 accumulant à chaque amplifications étape déjà pour l&#39;établissement de protocoles de purification pour le complexe de protéine d&#39;intérêt exprimée. </li><li> Stockage BIIc du virus de la production. Nous vous recommandons fortement de stocker virus V 2 comme le virus de la production en utilisant le BIIc (B aculovirus-i nfected i nsect c aunes) méthode, pour empêcher toute modification (par exemple la perte du gène d&#39;intérêt) du virus recombinant et de préserver une forte expression niveaus 16 cellules infectées Pellet 24 heures après l&#39;arrestation de prolifération est observée -. A ce stade les cellules contiennent des particules virales complètes, juste avant qu&#39;ils seraient libérés (par bourgeonnement) dans les médias. Retirez les médias et des aliquotes de gel de le culot cellulaire dans de l&#39;azote liquide et conserver indéfiniment. 7,16 </li></ol> 3. la production de protéines et de traitement en aval <ol><li> Infectant les grandes cultures (R) et le suivi YFP. Utilisez V 1, V 2 ou portions BIIc congelés pour infecter les grandes cultures cellulaires pour les cycles de production (typiquement 400 ml dans des flacons 2 L). Adhérer à bas régime MOI (régler le volume du virus utilisé pour l&#39;infection tels que la culture infectée double au moins une fois). Agrandir volumes de culture infectés si nécessaire selon le nombre de flacons de se multiplier. Si protéine marqueur YFP est présent, retirer à intervalles cellules 1x10 6 définies, granulés et lyse des cellules et de suivre l&#39;évolution du signal YFP jusqu&#39;à atteindre un plateau indintoxicantes production maximale de protéines recombinantes. YFP niveaux peuvent être mesurés dans un lecteur de plaques à puits norme 96 capable d&#39;enregistrer des signaux de fluorescence (par exemple Tecan Spectrafluor). Récolte des cellules à ce stade. culots cellulaires de conserver à -20 ° C (à court terme) ou -80 ° C (à long terme). </li><li> La lyse des cellules et le fractionnement. Lyse des cellules par votre méthode préférée de choix, adaptés aux exigences de votre protéine (gel-dégel, ultrasons, presse française, et autres). 5-7 cytosol Fractionner et noyaux et à vérifier la présence de vos protéines d&#39;intérêt. Développer des protocoles de purification basé sur les résultats afin de simplifier la purification des protéines. Envisager d&#39;appliquer les procédures de trempage pour extraire vos protéines de la fraction nucléaire dans des conditions de KCl élevés si vos protéines se trouvent dans le noyau. 7,18 </li><li> La purification des protéines (micro-échelle, à grande échelle). Notez que souvent de petits volumes (10 ou 25 ml) de culture cellulaire sont suFFICIENT pour obtenir des culots de cellules pour la purification de quantités substantielles de vos protéines d&#39;intérêt en raison des niveaux généralement élevés ou très élevés production de protéines hétérologues dans les systèmes cellulaires baculovirus / insecte (souvent 10-100 mg de protéine par litre culture et plus). En conjonction avec micro-purification (plaques à puits multiples, les méthodes micro-pointes, système GE Healthcare ÄKTAmicro, d&#39;autres), il est possible d&#39;obtenir des données biochimiques et de l&#39;activité et souvent aussi quantité suffisante de protéines et de complexes souhaités pour nanolitre échelle cristallisation à haut débit (HTX ). Envisager d&#39;utiliser la purification par affinité de métal (Clonetech Takara TALON, résines Qiagen NiNTA métalliques chélateurs) et un oligo-histidine (6-10 résidus) tag sur les sous-unités exposées de votre protéines complexes pour faciliter la purification, en liaison avec l&#39;échange d&#39;ions et chromatographie d&#39;exclusion de taille en petits volumes en utilisant par exemple le ÄKTAmicro ou une petite machine de purification de volume similaire (Figure 4 </strong&gt;). D&#39;autres étapes de purification d&#39;affinité et d&#39;échange (IEX) étapes ion en plus de la purification d&#39;affinité avec des étiquettes oligo-histidine ou d&#39;autres balises (choisir de la TPS, MBP, le CBP, autres) peut et doit être considéré, selon les propriétés biochimiques des protéines des intérêts et des préférences individuelles. Considérez marquage plus d&#39;une sous-unité avec des marqueurs d&#39;affinité pour améliorer l&#39;efficacité de purification. Concentrez vos complexes protéiques purifiés et établir des protocoles de stockage telles que le gel avec ou sans glycérine. Élaborer des critères de contrôle de qualité qui peuvent être appliquées en standard (tests d&#39;activité, des tests biochimiques et biophysiques) pour évaluer les variations de lot à lot de vos protéines purifiées. </li></ol>

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB est l&#39;inventeur sur les brevets et demandes de brevet décrivant les pièces de la technologie décrite ici.

Vidéo instantanés sur les figures 2 et 3 illustrent l&#39;ensemble du processus de production assistée par robot à partir d&#39;ADNc d&#39;expression multigénique construit tout le chemin à l&#39;infection des cultures de cellules d&#39;insectes pour la production de protéines. Nouveaux réactifs (plasmides et virus) et les protocoles robustes ont été développés pour permettre une conduite en s&#39;appuyant sur SOP. L&#39;ensemble du pipeline a été mis en œuvre comme une t...

L&#39;activité biologique est contrôlé par des assemblages de protéines et d&#39;autres biomolécules qui agissent de concert pour stimuler les fonctions cellulaires. Parmi les exemples notables comprennent les machines qui transcrit l&#39;information héréditaire contenue dans l&#39;ADN en ARN messager. Chez l&#39;homme, plus de 100 protéines sont réunis dans un processus défini et réglementé pour transcrire les gènes, formant de grands complexes multi avec 10 et plusieurs sous-unités dont l&#39;ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription tels que TFIID, TFIIH et autres. 9 D&#39;autres exemples sont l&#39; ribosome, constitué de plusieurs protéines et des molécules d&#39;ARN, qui catalyse la synthèse des protéines, ou le complexe de pore nucléaire qui est responsable de la navette biomolécules à travers l&#39;enveloppe nucléaire chez les eucaryotes. Une dissection architectural et biochimique détaillée de la quasi-totalité des machines multi dans la cellule est essentiel de comprendre leur fonction. L&#39;élucidation de la structure de procaryotes et eukarribosomes yotic, par exemple, constituent des événements de cachet donnant un aperçu sans précédent dans la façon dont ces machines macromoléculaires exercent leurs fonctions désignées dans la cellule. 10,11 Les ribosomes peut être obtenue en qualité et en quantité suffisante pour une étude détaillée de la purification de la matière endogène à partir de cellules en culture, en raison du fait que jusqu&#39;à 30% de la masse cellulaire se compose de ribosomes. ARN polymérase II est déjà moins abondante par des ordres de grandeur, et plusieurs milliers de litres de culture de levure ont dû être traitées pour obtenir une vue atomique détaillée de ce complexe essentiel au cœur de la transcription. 12 L&#39;écrasante majorité des autres complexes essentiels sont toutefois présents dans des quantités beaucoup plus faibles dans les cellules natives, et ne peuvent donc pas être purifiés de manière adéquate à partir de sources d&#39;origine. Pour rendre ces complexes accessibles à l&#39;analyse structurale et fonctionnelle détaillée nécessite la production hétérologue en utilisant te recombinantchniques. Production de protéines recombinantes a eu un impact majeur sur la recherche en sciences de la vie. De nombreuses protéines ont été produites par recombinaison, et leur structure et leur fonction disséqués à haute résolution. Programmes de génomique structurale ont profité de l&#39;élucidation de ces génomes de nombreux organismes pour s&#39;attaquer au répertoire de produits de gènes d&#39;organismes entiers en mode haut débit (HT). Des milliers de structures de protéines ont ainsi été déterminés. À ce jour, le système le plus prolifique utilisée pour la production de protéines recombinantes a été E. coli, et de nombreux systèmes d&#39;expression ont été développées et affinées au fil des ans pour la production hétérologue dans cet hôte. Les plasmides hébergeant une multitude de fonctionnalités pour permettre la production de protéines dans E. coli remplir catalogues entiers de fournisseurs commerciaux. Toutefois, E. coli a certaines limites qui la rendent impropre à produire de nombreuses protéines eucaryotes et en pcomplexes protéiques articulaires avec plusieurs sous-unités. Par conséquent, la production de protéines dans des hôtes eucaryotes est devenu de plus en plus la méthode de choix au cours des dernières années. Un système particulièrement bien adapté pour produire des protéines eucaryotes est le système de vecteur d&#39;expression de baculovirus (BEVS) qui s&#39;appuie sur un baculovirus recombinant portant les gènes hétérologues pour infecter des cultures de cellules d&#39;insectes cultivées en laboratoire. Le système MultiBac est un BEVS plus récemment mis au point qui est particulièrement adaptées pour la production de complexes protéiques eucaryotes avec de nombreux sous-unités (Figure 1). MultiBac a été introduite en 2004. 13 Depuis son introduction, MultiBac a été constamment affiné et rationalisé pour simplifier la gestion, améliorer la qualité de la protéine cible et généralement rendre le système accessible à des utilisateurs non spécialistes de la conception des procédures d&#39;exploitation normalisées efficaces (SOP). 4 MultiBac a été mis en place dans de nombreux laboratoires du monde entier, en acAdemia et de l&#39;industrie. A l&#39;EMBL à Grenoble, les programmes d&#39;accès transnationaux ont été mis en place par la Commission européenne pour fournir une formation spécialisée sur la plateforme MultiBac pour les scientifiques qui souhaitent utiliser ce système de production pour faire avancer leurs recherches. La structure et la fonction de nombreux complexes protéiques qui n&#39;étaient jusque-là pas accessible a été élucidée à l&#39;aide d&#39;échantillons produits avec MultiBac. 4 Dans la suite, les étapes essentielles de la production MultiBac sont résumées dans les protocoles qu&#39;ils sont en opération à l&#39;installation MultiBac à l&#39;EMBL de Grenoble.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

La recherche en protéomique a révélé la complexité impressionnante de protéomes eucaryotes de détail sans précédent. Il est maintenant une notion communément admise que les protéines dans les cellules existent surtout pas comme des entités isolées, mais exercent leur activité biologique en association avec de nombreuses autres protéines, chez l&#39;homme dix ou plus, formant des lignes d&#39;assemblage dans la cellule pour la plupart, sinon toutes les fonctions vitales. 1 , 2 Connaissance de la fonction et de l&#39;architecture de ces assemblages multiprotéiques nécessite leur disposition dans une qualité supérieure et en quantité suffisante pour une analyse détaillée. La rareté des nombreux complexes de protéines dans les cellules, en particulier chez les eucaryotes, interdit leur extraction à partir de sources indigènes, et nécessite la production recombinante. Le système de vecteur d&#39;expression de baculovirus (BEVS) s&#39;est avérée particulièrement utile pour produire des protéines eucaryotes, dont l&#39;activité repose souvent sur le traitement post-traductionnelle que d&#39;autres systèmes d&#39;expression couramment utilisés peuvent souventpas en charge. 3 BEVS utiliser un baculovirus recombinant dans lequel le gène d&#39;intérêt a été inséré à infecter des cultures de cellules d&#39;insectes qui à leur tour produisent la protéine de choix. MultiBac est un BEVS qui a été particulièrement adaptée pour la production de complexes protéiques eucaryotes qui contiennent de nombreux sous-unités. 4 A condition sine qua non pour une production efficace de protéines et de leurs complexes sont des protocoles robustes pour toutes les étapes d&#39;une expérience d&#39;expression qui peut idéalement être mis en œuvre procédures d&#39;utilisation normalisées (SOP) et suivie également par des utilisateurs non spécialistes avec une relative facilité. La plate-forme MultiBac au Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) utilise SOP pour toutes les étapes d&#39;une expérience d&#39;expression de complexes multi, à partir de l&#39;insertion des gènes dans un génome baculoviral ingénierie optimisé pour les propriétés de production de protéines hétérologues à l&#39;analyse à petite échelle de la protéine spécimens produits. 5-8 La plate-formeest installé dans un mode libre accès à l&#39;EMBL de Grenoble et a soutenu de nombreux scientifiques du monde universitaire et de l&#39;industrie pour accélérer les projets de recherche complexes protéiques.

Co-expression forte de protéines hétérologues obtenus par le système MultiBac est illustré à la figure 1d (sondes prises 48 heures après l&#39;infection d&#39;une culture de cellules en suspension). Les bandes de protéine surexprimée est clairement perceptible dans l&#39;ensemble extrait cellulaire (SNP) et le lysat clarifié (SN). La qualité et la quantité de la matière protéique produite est souvent suffisante pour permettre la détermination de la structure des complexes de protéines, t...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l&#39;expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d&#39;exploitation normalisées développés afin de maximiser son utilité.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.8K vues.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation norma...

Vidéo: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection brut de l&#39;estomac du homard, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

La production de puces de tissus, de coloration immunohistochimique et Numérisation Dans l&#39;Atlas des protéines humaines

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Une plate-forme d&#39;expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...