1. Transfection de la cellule hôte <ol><li> Graine 2 x 10 6 cellules CHO-DXB11 en flacon T75 Corning culture cellulaire dans 15 ml milieu de croissance (MEMA avec des nucléotides et des nucléosides (Gibco, numéro de catalogue 12571) complété avec 10% γ-irradiés caractérisé sérum fœtal bovin (CFBS) (Hyclone, SH30071.03 numéro de catalogue) et 10 mL / L de solution de glucose à 45% (Sigma, numéro de catalogue G8769)) un jour avant la transfection. </li><li> Au moment de la transfection, préparer des complexes de transfection comme suit: <ol class="lalpha"><li> Diluer 8 ug d&#39;ADN dans 800 ul de milieu de croissance sans sérum dans un tube à centrifuger stérile. Mélanger délicatement. </li><li> Diluer 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) dans 800 pl de milieu de croissance sans sérum dans un tube en polystyrène. </li><li> Ajouter l&#39;ADN dilué à l&#39;™ Lipofectamine diluée. Mélanger doucement et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li></ol></li><li> Enlever le milieu de croissance des cellules dans T75 et le remplacer par 6,4 ml de milieu de croissance sans sérum. Ajouter le ml 1.6 de complexes de transfection dans le ballon. Mélanger délicatement en faisant basculer la plaque. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 6 heures. </li><li> Ajouter 8 ml de milieu de croissance dans le ballon et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 durant la nuit. </li><li> Retirer milieu par aspiration et ajouter du milieu de croissance frais à la fiole. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 durant la nuit. </li><li> Remplacez le milieu de croissance à moyen sélection (moyenne MEMA sans nucléotides ou nucléosides (Gibco, numéro de catalogue 12561) complété avec 10% γ-irradiés dialysé de sérum de veau fœtal (DFB) (Hyclone, SH30079.03 numéro de catalogue) et 10 mL / L 45 solution de glucose% (Sigma, G8769 numéro de catalogue)). </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 2-3 semaines. </li></ol> 2. Clonage par cytométrie en flux tri cellulaire activé <ol><li> Déloger les cellules de la fiole et centrifuger à 800 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans le milieu de sélection supplémenté avec 2% d&#39;albumine sérique bovine et marqué par fluorescence anti-IgG humaines à 1:20 de dilution. </li><li> Incuber dans la glace pendant 15-30 minutes, puis laver deux fois avec du PBS froid. Resuspendre les cellules dans du PBS 1X dans un tube en polypropylène. </li><li> Préparer pour le tri aseptiques sur une BD ™ FACSAria. Préparer plaque de 96 puits culture cellulaire qui contient 200 ul milieu de sélection dans chaque puits. </li><li> Aseptiquement charger le tube avec les cellules et d&#39;analyser sur BD FACSAria ™, enregistrer les résultats pour les cellules colorées et non colorées, respectivement. </li><li> Régler les portes et les paramètres de tri des cellules individuelles du profil désiré dans la coloration fluorescente plaque de 96 puits (s). <ol class="lalpha"><li> Les cellules transfectées sont d&#39;abord analysés sur la base de dispersion avant par rapport à diffusion latérale. Un portail pour les cellules vivantes sont prises en fonction de diffusion vers l&#39;avant, qui mesure la taille d&#39;une cellule, et la diffusion latérale, qui mesure la complexité d&#39;une cellule ou une granularité. </li><li> Les cellules qui entrent dans cette porte sont ensuite examinés pour la coloration de PE. PE porte négatif est fixé pour immaculée cellules transfectées ou des cellules hôtes colorées. Comme teinté cellules transfectées sont examinées par FACS, la «High PE&quot; grille est alors délimitée pour englober la partie supérieure de 5% de toutes les cellules qui sont positifs pour la coloration de PE. </li></ol></li><li> Incuber les plaques à 37 ° C incubateur pendant deux semaines. </li></ol> 3. Documentation de formation de colonies par CloneSelect ™ Imager Document de formation de colonies dans les plaques de 96 puits sur les CloneSelect Imager ™ au jour 0, jour 3, jour 7 et 13 jours après la FACS tri. La documentation image sera d&#39;assurer la sélection de clones provenant d&#39;une seule cellule. Une étape cruciale dans cette documentation est de mettre le plan focal correctement réglés pour le jour 0 de mesure, car il n&#39;ya qu&#39;une seule cellule dans chaque puits à ce moment-là. Il est très important que les images de ces cellules simples sont la mise au point et de tenter de régler la netteté sur eux peut être trompeur, au mieux. Le plan focal peuvent varier considérablement entre les marques de plaques et peut-être même d&#39;un lot à la même marque. Ainsi un avion pré-déterminé focal doit être utilisé. Ceci peut être accompli en se concentrant sur le test de micro-billes ou de cellules à haute densité déposés sur des plaques à partir du même lot utilisé. Alternativement, les plaques entièrement développé à partir du même lot peut être utilisé à cette fin. Après le tri par FACS, il est également important de laisser les cellules se contenter d&#39;un minimum de 2 heures avant l&#39;imagerie, afin qu&#39;ils soient «fixés» dans la position sur la plaque. 4. Dépistage et sélection de clones hautement productive <ol><li> Document de position de l&#39;échantillon dans les plaques recevant de 96 puits. </li><li> Aliquotes de transfert de 20 ul surnageant (diluer si nécessaire) dans des plaques 96 puits d&#39;essai par l&#39;EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. Ce robot flexible et capableIC plateforme a été adaptée pour cela et d&#39;autres travaux automatisé de culture cellulaire. Des programmes spéciaux ont été écrites pour utiliser au mieux et améliorer les capacités Freedom EVO robotique pour le développement de lignées cellulaires. Un exemple de cela est la mise au TECAN pour interpréter les données CloneSelect ™ Imager pour l&#39;échantillonnage des puits avec des colonies isolées. D&#39;autres programmes ont été nécessaires pour effectuer des tâches supplémentaires telles que la culture cellulaire pour faire des dilutions appropriées des échantillons prélevés, d&#39;interpréter, par catalogue et plaques échantillon manuellement marqués, si nécessaire, à l&#39;échelle en haut clones produisant, etc Beaucoup de ces programmes peuvent être facilement appliquée à Plaques 384 puits ainsi que l&#39;original Format 96 puits. </li><li> La production d&#39;anticorps dans les échantillons sont analysés par un sandwich ELISA détectant les IgG humaines (Pierce, Rockford, IL) sur l&#39;EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. <ol><li> Les échantillons et standards (Human myélome IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) ont été chargés sur pré-enduits Bio Coat Anti-Human plaques de dosage des IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant deux heures, suivi par des lavages PBS trois. </li><li> Chèvre ImmunoPure anti-IgG humaine (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) a été ajouté à la plaque à une dilution 1:2000 et incubé pendant une heure à température ambiante. </li><li> Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS avant d&#39;ajouter substrat ABTS (Pierce, Rockford, IL) et ont été lus sur un lecteur de plaque à l&#39;aide d&#39;absorbance à 405 nm pour la détection. </li></ol></li><li> Sélectionner des clones très productifs et d&#39;évaluer la productivité en culture en suspension. Pour fed-batch culture, les cellules ont été inoculées à 0.3X106 cellules / ml en protéines moyenne HJR AVANTAGE immédiatement et gratuitement 65 578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) supplémenté avec 5 hydrolysat g / L de soja (DMV International, numéro de catalogue SE50MAF-UF, beaucoup nombre) et incubées à 37 ° C avec 7,5% de CO 2. La culture continue et ont été complétées avec 2 g / L de glucose (Sigma, G8769 numéro au catalogue, 098K2329 numéro de lot) lorsque le glucose, plus la concentration de lactate dans la culture a atteint en dessous de 2 g / L, et nourris de 2 mM de glutamine (Gibco, numéro de catalogue 25030, numéro de lot 568177) lorsque les niveaux de glutamine atteint en dessous de 200 mg / L (métabolites mesurés par YSI Bioanalyzer). Fed-batch cultures ont pris fin le jour 14 et la production d&#39;anticorps a été mesurée par HPLC en phase inverse. </li><li> La caractérisation génétique des clones candidats par hybridation fluorescente in situ (FISH) 5. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un exemple de développement d&#39;anticorps produisant des clones avec la méthode à haut débit est montré dans la Figure 1 et Figure 2. Pool de cellules transfectées a été coloré avec marquage fluorescent anti-IgG humaine (figure 1A), analysés et triés sur BD FACSAria ™ (figure 1B). La formation de colonies dans la plaque de 96 puits a été imagé sur CloneSelect Imager ™ (figure 1C). Surnageant de culture cellulaire a été échantillonnée à partir de puits qui contiennent seule colonie et dosés par ELISA sur le système TECAN Freedom EVO ® de manipulation de liquides (figure 1D). Clones très productifs ont été trouvés à partir de cellules exposées plus haut niveau d&#39;anticorps de surface reflétée par coloration avec fluorescence des anticorps anti-IgG humaine. Lorsque l&#39;on compare les clones générés à partir de deux populations de la piscine de cellules transfectées initiale, une grande différence dans la productivité dans la culture fed-batch a été observée (figure 2). Pour les deux premiers clones générés par la population cellulaire avec une expression de surface élevés d&#39;anticorps (PE haute), la productivité spécifique variait de 50 à 70 pg / cellule / jour. Alors que la productivité d&#39;anticorps a été ~ 20 pg / cellule / jour pour les deux premiers clones générés par la population de cellules avec des anticorps de l&#39;expression en surface faible (PE basse). De plus, les lignées cellulaires développé par tri FACS sont plus stables par rapport à la production d&#39;anticorps que ceux qui ont été clonés par dilution chaulage manuel (figure 3A). La productivité spécifique du clone haut, &quot;Clone 1&quot;, généré par une dilution manuelle chaulage est passé de ~ 30 à ~ 10 PCD PCD après culture pendant 80 doublements de cellules. D&#39;autre part, le sous-clone supérieure générée par FACS de tri, &quot;Clone 2&quot;, a été capable de maintenir la productivité spécifique autour de 20 PCD pour au moins 100 doublements de cellules. Par hybridation in situ fluorescente (FISH), nous avons démontré Clone 1 a montré une population mixte de phénotype A (85%) et le phénotype B (15%). En revanche, FACS triés clone (clone 2) a montré à une population plus homogène, avec 99,5% des cellules s&#39;est avéré être un phénotype. (Figure 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Développement de lignées de cellules de fabrication pour la production d&#39;anticorps monoclonaux à partir de cellules CHO. Coloration de surface A) du pool de cellules transfectées avec initiales marquées par fluorescence anti-IgG humaines. B) Le tri de la population cellulaire avec une intensité de fluorescence élevée (PE haute) et une faible intensité de fluorescence (PE basse) dans la plaque de 96 puits. C) Documenter la coloniela formation du jour 0 au jour 13 post sur l&#39;ensemencement CloneSelect Imager ™. Dépistage des clones D) par ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Niveau d&#39;anticorps de surface associées est en corrélation avec la productivité d&#39;anticorps de la cellule. Clones avec coloration fluorescente haute et basse ont été développés dans des lignées cellulaires et évaluées dans la culture fed-batch. Volumétrique titre et la productivité spécifiques ont été comparés entre les 2 clones dessus de chaque population. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Clones générés par FACS de tri d&#39;exposition plus élevés homogénéité génétique et de la stabilité clone. A) La production d&#39;anticorps de la stabilité dans la culture batch pour ~ 80 doublements de cellules de temps s&#39;écoulera culture. Δ, clone a été générée par dilution limite, où les cellules ont été ensemencées à 2000 cellules / puits, 1000 cellules / puits et 500 cellules / puits. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triangle Noir" /> , Clone a été générée par FACS à 1 cellule / puits. B) site d&#39;intégration de Transgene dans le chromosome de cellules CHO est identifié par hybridation fluorescente in situ.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Les auteurs de cet article sont des employés de Merck &amp; Co., Inc, qui utilisent cette méthode pour la production à grande échelle de protéines thérapeutiques à partir des lignées cellulaires de mammifères.

Nous avons présenté une cellule automatisée de fabrication de développement plateforme en ligne qui permet l&#39;isolement de clones très productifs, et en attendant, assure clonalité et la stabilité clone. L&#39;engagement de la coloration des anticorps de surface suivie d&#39;un tri cellulaire FACSAria ™ est la clé pour obtenir des clones individuels de productivité élevés d&#39;anticorps. Nos résultats et d&#39;autres rapports 2-4 suggèrent que le niveau d&#39;anticorps transitoirement affichés sur la surface des cellules est bien corrélée avec la productivité de la cellule. Ainsi, un anticorps conjugué à la fluorescéine peut être utilisée pour reconnaître les produits associée à la membrane et l&#39;aide de l&#39;isolement des producteurs de haut. Alternativement, la coexpression de gènes rapporteurs et de la technologie micro-goutte de gel ont été utilisés pour faciliter la sélection de forte production de clones par FACS 6-8. En plus d&#39;isoler haute clones produisant par FACS, d&#39;autres technologies ont évolué pour atteindre le même objectif. Il s&#39;agit notamment de la technologie Trellis CellSpot Bioscience qui utilise des systèmes de détection d&#39;anticorps microspere et la technologie de dépistage au laser pour identifier des clones très productifs et éliminer les cellules indésirables, Genetix ClonePix FL et StemCell Technologies ClonaCell EasyPick plateforme qui effectuent criblage à haut débit de lignées cellulaires de production utilisant un système de détection d&#39;anticorps fluorescents . Nous avons choisi de mettre en œuvre la méthode de clonage FACS basée sur le niveau d&#39;anticorps de surface associées, car il combine la facilité d&#39;utilisation, la sélectivité sur la productivité et la clonalité. L&#39;emploi de Tecan Freedom EVO ® système de manipulation des liquides considérablement augmenté le débit de dépistage, qui offrent la possibilité de sélectionner des clones à haut rendement à partir d&#39;un pool de cellules beaucoup plus grandes. Autres instruments pour le dosage tels que HTRF, BioForte Octuor, HPLC, etc, sont tous les moyens possibles de sélection des producteurs de haut et de dépistage des producteurs bas. En suivant la formation de clone avec CloneSelect Imager ™, nous avons généré des documents nécessaires pour prouver la clonalité de l&#39;histoire de lignée cellulaire numérisé. Clonalité est encore confirmé par génétiquement caractérisent seul site d&#39;intégration du transgène sur le chromosome. Une étape sous-clonage, qui est habituellement prises pour assurer la clonalité, peuvent ainsi être éliminés. Cela permettra d&#39;économiser 4-8 semaines de temps pour le développement de lignées cellulaires. En résumé, les lignées cellulaires de qualité générés par la plate-forme à haut débit automatisé a montré une productivité élevée, la stabilité de production et de l&#39;histoire documentée lignée cellulaire qui devrait répondre à la demande à grande échelle de production et les exigences réglementaires actuelles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ trieur de cellules </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® de manipulation des liquides </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

L&#39;industrie biopharmaceutique en pleine croissance exige le développement rapide de systèmes de production hautement efficace et fiable pour répondre à l&#39;exigence croissante de l&#39;approvisionnement en médicaments. La génération de lignées cellulaires de production a traditionnellement impliqué des opérations manuelles qui sont main-d&#39;œuvre, à faible débit et les plus vulnérables à des erreurs humaines. Nous rapportons ici une plateforme intégrée à haut débit et automatisé pour le développement de lignées de cellules de fabrication pour la production de protéines thérapeutiques. La combinaison de la BD FACS Aria ™ trieur de cellules, CloneSelect ™ Imager et TECAN Freedom EVO ® système de manipulation de liquides a permis un processus cellulaire à haut débit et plus efficace ligne de développement. Dans cette opération, les cellules hôtes de production sont d&#39;abord transfectées avec un vecteur d&#39;expression portant le gène d&#39;intérêt 1, suivi par le traitement avec un agent de sélection. Les cellules transfectées de façon stable sont ensuite colorés avec la fluorescence des anticorps anti-IgG humaines, et sont ensuite soumis à une analyse de cytométrie en flux 2-4. Cellules très productives sont choisis en fonction de l&#39;intensité de fluorescence et sont isolés par une seule cellule de tri sur une BD ™ FACSAria. La formation de colonies de cellules mono-étape a été détecté au microscope et une série d&#39;images numériques du temps tours sont prises par l&#39;imageur CloneSelect ™ pour la documentation de l&#39;histoire de la lignée cellulaire. Après des clones individuels ont formé, ces clones ont été testés pour la productivité par ELISA effectuée sur un EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. Environ 2,000 - 10,000 clones peuvent être criblés par cycle de fonctionnement avec la configuration actuelle du système. Cette approche intégrée a été utilisée pour générer de haute production de hamster chinois lignes cellules ovariennes (CHO) pour la production d&#39;anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) ainsi que de leurs protéines de fusion. Avec l&#39;aide de différents types de sondes de détection, la méthode peut être utilisée pour développer des protéines thérapeutiques ou être appliqué à d&#39;autres systèmes hôte de production. La comparaison avec la procédure manuelle traditionnelle, cette plate-forme automatisée démontré les avantages d&#39;une capacité nettement accrue, clonalité assurée, de la traçabilité dans l&#39;histoire de la lignée cellulaire avec documentation électronique et la possibilité très réduite dans l&#39;erreur de l&#39;opérateur.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.

Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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JoVE Journal

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22.1K vues.  Merck & Co., Inc. Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité éle...

Vidéo: A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Recherche

Médecine

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

L&#39;utilisation de la cystomanométrie chez les petits rongeurs: une étude de la vessie Chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

L&#39;administration intranasale d&#39;Therapeutics SNC à des souris éveillées

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

La réponse au traitement ex vivo de tumeurs primaires et / ou métastases associées préclinique et développement clinique de la thérapeutique

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d&#39;ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Analyse à haut débit des données de cartographie optique à l'aide d'ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...