DIY cryogénique de récupération dispositif a été testé en cours des projets de &quot;prénylation des protéines Modélisation bactérienne dans les cellules eucaryotes à l&#39;aide de la bioinformatique et des approches moléculaires», parrainé par Mary Louise Andrews Prix pour le programme de recherche sur le cancer, en Virginie Académie des sciences, &quot;signification physiologique de l&#39;ARN dans le plasma d&#39;édition Les cellules dendritiques »parrainé par le Jeffress Thomas F. Miller et Kate Jeffress Memorial Trust et du contrat Etat 16.740.11.0364 (Ministère de la Science et de l&#39;éducation, de la Russie). Nous tenons à remercier Beth Eom de l&#39;aide pour l&#39;expérience intégrité de l&#39;ARN.

1. Assemblée des périphériques Cryotolerant pour la récupération de Cryoboîtes <ol><li> En utilisant des pinces, de redresser un côté de 3 côtés Strong-Tie (figure 1A) pour faire une forme de L Strong-Tie Remarque montré dans la figure 1B:. Les dimensions de Strong-Tie peuvent être sélectionnés en fonction du diamètre du col de Dewar . </li><li> Fixez deux de ces forts des liens avec une sangle Strong-Tie T (figure 2) à l&#39;aide de la Couronne écrou boulon, la rondelle et la vis pour former la base Cryoscoop comme le montre la figure 3 (AB). Remarque: Deux liens forts sont utilisés pour permettre la récupération de 5 ½ po x 5 ½ po cryoboîtes. </li><li> En utilisant une plaque fendue (figure 4), aligner les fentes sur la sangle Strong-Tie T avec les fentes sur une extrémité de la plaque fendue et sécuriser les deux ensemble, avec l&#39;aide de l&#39;écrou Hillman et des boulons (figure 5). Remarque: Si l&#39; plaque fendue et fort lien de ne coopère pasmoi avec des trous pré-percés, vous devrez avoir des trous percés à l&#39;aide foret carbure. </li><li> Plier l&#39;extrémité de l&#39;autre la plaque rainurée à l&#39;aide de pinces, comme indiqué sur la figure 6. (Cette étape est facultative). </li><li> Envelopper la poignée avec de la mousse afin de mieux saisir l&#39;appareil lorsque dans l&#39;azote liquide comme le montre la figure 6. (Facultatif) Remarque: Retirez la mousse avant l&#39;autoclavage. </li></ol> 2. Assemblée des périphériques Cryotolerant pour la récupération de Cryotubes Le dispositif de récupération Cryotolerant bricolage peut également être adapté pour la récupération des cryotubes. Ce substituant comprend la base plane avec une crépine d&#39;acier inoxydable comme indiqué modifié pour évider flacons de l&#39;azote liquide (figure 7). <ol><li> Dévissez les écrous et les boulons de la Couronne de fixation de la sangle de Strong-Tie T pour la plaque fendue. </li><li> Avant de fixer la crépine en acier inoxydable à la plaque fendue, pliez doucement le col dela crépine avec l&#39;aide de pinces pour orienter la base d&#39;un angle à ressembler à une louche (Figure 8) Remarque: Si le filtre est livré avec une lèvre, d&#39;utiliser des pinces pour plier la lèvre bas, ce qui rendra les manœuvres avec le plus facile appareil.. </li><li> Alignez le trou sur la poignée de la passoire avec les trous sur la plaque fendue et sécuriser la crépine avec l&#39;aide des écrous et des boulons Hillman comme le montre la Figure 8. Remarque: si le filtre ne vient pas avec des trous pré-percés, vous aurez besoin prendre des dispositions pour avoir des trous percés avec une mèche au carbure. </li></ol> 3. Récupération Cryoboîtes et cryotubes De Dewar <ol><li> Pour commencer, mettez des gants cryogéniques et enlever 1 ou 2 racks de congélation de l&#39;Dewar pour permettre une marge de manœuvre. </li><li> Grattez délicatement le long du bas de l&#39;Dewar avec l&#39;appareil en position verticale de récupération Cryotolerant bricolage équipé Strong-Tie de base sangle T (figure 5) et de percevoir la falle boîten pour le fond de la cuve Dewar Note:. bout d&#39;azote liquide immédiatement au contact avec un objet plus chaud, enveloppant l&#39;objet dans l&#39;isolation de l&#39;azote gazeux (effet Leidenfrost). Pour refroidir l&#39;appareil avant le prélèvement d&#39;échantillons, lentement plonger l&#39;appareil dans le Dewar et permettre l&#39;azote liquide pour refroidir l&#39;appareil suffisamment avant de procéder à l&#39;étape ci-dessus. </li><li> Tirez l&#39;appareil en position verticale le long des murs du Dewar pour ramasser la boîte de congélateur hors du réservoir. </li><li> Saisir le boîtier récupérées à partir du bas de la Dewar. </li><li> Pour récupérer des cryotubes, grattez délicatement le fond de la Dewar avec la cryoscoop équipés d&#39;un tamis (figure 9). </li><li> Semblable à cryobox récupération, tirez sur le dispositif de droite et de saisir les flacons recueillis dans la passoire. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Un défi majeur dans les études d&#39;expression génique, c&#39;est que la qualité de l&#39;ARN dépend des conditions de stockagepour les deux échantillons de tissus congelés et Figure ARN extrait 4. La figure 10 montre l&#39;effet de la manipulation de l&#39;échantillon sur l&#39;intégrité de l&#39;ARN total. L&#39;ARN total à partir de la source même tissu (tissu adipeux humain) a été soumis à la manipulation des échantillons différents. Avant d&#39;expérimenter, intact ARN total preparate montre clairement 28S et 18S bandes d&#39;ARNr avec la bande ARNr 28S d&#39;environ deux fois plus intense que la bande ARNr 18S (Figure 10, piste 1). Ce rapport 2:1 (28S: 18S) est une indication que l&#39;ARN est intact, tandis partiellement dégradée ARN apparaît comme un frottis, 28S ou son: rapport d&#39;intensité 18S s&#39;écarte de 2:1 5. Lanes 3-4 représente les échantillons d&#39;ARN avec une dégradation importante. Ces échantillons d&#39;ARN ont été soumis à dégel partiel répétée à court terme de données adressées au Dewar (Méthode A), modélisant ainsi le stockage à long terme avec décantation périodique en raison de la nécessité de la récupération de la flacons et des boîtes déchu (Figure 10, Lane 3-4 ). Cependant, les échantillons stockés dans Dewar desservien utilisant un dispositif de bricolage (méthode B) et, par conséquent, pas de dégel partiel, contiennent de l&#39;ARN intacts (Figure 10, Lane 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Figure 1. A) La base est constituée de deux à 3 côtés Strong-Tie de dimensions indiquées. Chaque lien fort-contient un grand pré-trou foré (flèche pleine) et de multiples petits trous (petite flèche) sur chaque face. Ceci fournit une option pour permettre la fixation avec écrou et boulons. Également des trous plus petits permettre le drainage rapide de l&#39;azote liquide pendant la récupération de l&#39;échantillon. B) un côté de chacun de la cravate forte-est redressé à l&#39;aide d&#39;une pince pour faire en forme de L forte de couplage. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> Figure 2. Sangle T Strong-Tie est utilisé pour sécuriser les liens forte-ensemble. Comme Strong-Tie, T-sangle présente un grand pré-trou foré (flèche pleine) et deux petits trous (small flèche) à chaque coin. Cela permet la sécurisation forte des liens le long de la longueur de la T - Strap l&#39;aide d&#39;écrous et de boulons. Il permet également la fixation T-bracelet à la plaque fendue. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Figure 3. A) Chaque lien fort-est fixé à un coin de T-strap, sur toute sa longueur à l&#39;aide écrous des boulons de la couronne, boulons et rondelles. B) Deux forte-ment sont fixés côte à côte pour aider à récupérer 5 ½ po x 5 ½ po cryoboîtes. Pour les petits cryoboîtes tels que le 2 po x 2, une seule forte de couplage peut être fixé directement sur la plaque à fentes sans bride en T. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Figure 4. Fendue plaque plate est utilisée en tant que poignée. La longueur de la plaque à fentes dépend de la profondeur de l&#39;Dewar. Dans ce cas, 4 pieds de plaque fendue a été utilisé. L&#39;épaisseur de la plaque fendue est s critiqueepuis minces plaques à fentes (&lt;14 jauges) rendre le dispositif fragile lors de la récupération des échantillons de l&#39;azote liquide remplie Dewar. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Figure 5. La base plane comprenant des solides et des liens de sangle T est ensuite fixé à une extrémité de la plaque à fentes. Le plus grand trou dans le coin restant de la sangle T est alignée avec la fente sur la plaque plane et fixée en utilisant un boulon hexagonal et l&#39;écrou. Ce dispositif peut maintenant être utilisé pour récupérer cryoboîtes de Dewar. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> Figure 6. Une extrémité de la plaque fendue plat est plié en utilisant des pinces et recouverte de mousse pour assurer une meilleure adhérence en particulier pour les Dewars profondes, comme le montre dans ce cas. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Figure 7. Crépine avec un treillis métallique et poignée en acier inoxydableest utilisé pour récupérer des cryotubes de Dewar. Si la poignée n&#39;est pas pourvu d&#39;une fente, percer avec un foret en carbure seront nécessaires pour percer un trou. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Figure 8. Pour faciliter la récupération des cryotubes, filtre est plié le long du cou en utilisant une pince pour obtenir la crépine poche en forme de. Si la crépine est fourni avec la lèvre comme dans ce cas, une pince peut être utilisée pour le plier. Cela garantit la crépine ne se coince pas dans le Dewar. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Figure 9. Crépine est fixé à la plaque fendue plat à une extrémité à l&#39;aide écrou et le boulon. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> Figure 10. L&#39;intégrité des échantillons d&#39;ARN total soumis à différentes conditions de manipulation des échantillons. Pour explorer la façon dont la qualité est affectée par l&#39;ARN manipulation de l&#39;échantillon conditions, un ensemble d&#39;échantillons d&#39;ARN à partir de la même source a été soumis à deux méthodes de manipulations. Méthode A se composait de stockage de l&#39;ARN dans Dewar soumis à extractions d&#39;échantillons en utilisant un dispositif de bricolage, donc pas de dégel partiel. Méthode B se composait de stockage de l&#39;ARN dans Dewar soumis à dégel partiel répétée à court terme de données adressées au Dewar, modélisant ainsi le stockage à long terme avec périodique décantation pour récupérer des échantillons tombés. Totale intégrité de l&#39;ARN ont ensuite été analysées par électrophorèse sur gel. Lane1: Exemple avant de le ranger dans Dewar; Lane 2: Exemple de Dewar soumis à la récupération par la méthode A; Lane 3, 4: Exemple de Dewar soumis à la récupération par la méthode B, M: 100 pb échelle.

<ol>
	<li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cryogenic Engineering. , 41 (1996).</li><li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , (1996).</li><li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , (2011).</li><li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies.">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li><li>Lynch, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CELL,+TISSUE+AND+ORGAN+CULTURE+|+Storage+and+Cryopreservation.">CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation.</a> Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).</li><li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics Engineering. , (1998).</li><li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Steel designers' handbook. , (1996).</li><li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics+materials+and+processes:+a+concise+encyclopedia.">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Une des méthodes les plus courantes de récupération cryoboîtes et cryotubes du fond de la cuve Dewar, est de clarifier l&#39;azote liquide dans un récipient de secours et de sortir les échantillons restants dans le ballon ou flottant dans l&#39;azote liquide décanté. C&#39;est, cependant, une pratique dangereuse qui peut causer des brûlures cryogéniques ou asphyxie due à une exposition prolongée à des vapeurs d&#39;azote liquide 2. Autre manière commune de la récupération des cryotubes déchus...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Hillman Group plaqué rainuré plat 1-3/8 x 4 pieds; 14 Gauge </td><td> Quincailleries locale </td><td> N / A </td><td> 1 unité requise </td></tr><tr><td> Couronne Bolt en acier inoxydable n ° 6 - 32 x 3/8 po Vis à tête ovale Phillips machine d&#39;entraînement </td><td> Quincailleries locale </td><td> Modèle # 42281 </td><td> 4 unités requises </td></tr><tr><td> Couronne Bolt 3/8 po x 1-1/2 po Zingués Rondelles Fender Steel </td><td> Quincailleries locale </td><td> Modèle # 20122 </td><td> 4 unités requises </td></tr><tr><td> Couronne Bolt Zinc plaqué n ° 8-32 Ecrou Vis machine </td><td> Quincailleries locale </td><td> Modèle # 18512 </td><td> 4 unités requises </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie BC40Z 4 po In.x4 moitié de base </td><td> Matériel localemagasiner </td><td> Modèle # BC40Z </td><td> 2 unités requises </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie 6 po x 6 po Strap T </td><td> Quincailleries locale </td><td> Modèle # 66T </td><td> 1 unité requise </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;passoire </td><td> Epicerie locale </td><td> Modèle # 7859W </td><td> 1 unité requise </td></tr><tr><td> The Hillman Group Galvanisé écrous hexagonaux 3/8-16 </td><td> Quincailleries locale </td><td> Modèle #: 810509 </td><td> 6 unités requises </td></tr><tr><td> The Hillman Group galvanisé boulons hexagonaux 3/8- 16 </td><td> Quincailleries locale </td><td></td><td> 4 unités requises </td></tr><tr><td> Mousse pour l&#39;isolation </td><td> Quincailleries locale </td><td></td><td> 1 unité requise </td></tr><tr><td> Tournevis </td><td> Quincailleries locale </td><td></td><td> 1 unité requise </td></tr><tr><td> Pinces </td><td> Quincailleries locale </td><td></td><td> 1 unité requise </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

L&#39;azote liquide est incolore, inodore, très froid (-196 ° C) liquide maintenu sous pression. Il est couramment utilisé comme fluide cryogénique pour le stockage à long terme de matériaux biologiques tels que le sang, des cellules et tissus 1,2. La nature de l&#39;azote liquide cryogénique, tandis idéal pour la conservation des échantillons, peut provoquer une congélation rapide des tissus vivants au contact - connu sous le nom «cryogénique brûler» 2, ce qui peut conduire à des gelures sévères chez les personnes étroitement impliquées dans le stockage et la récupération des échantillons provenant de Dewars. En outre, comme l&#39;azote liquide s&#39;évapore il réduit la concentration d&#39;oxygène dans l&#39;air et peuvent provoquer l&#39;asphyxie, en particulier dans des espaces confinés 2. Dans les laboratoires, les échantillons biologiques sont souvent stockées dans des cryotubes ou cryoboîtes empilés dans des racks en acier inoxydable dans les réservoirs de Dewar 1. Ces supports de stockage sont pourvus d&#39;un arbre long pour empêcher de glisser hors des boîtes à partir des supports et dans le fond deDewars lors de la manipulation de routine. Trop souvent, cependant, des boîtes ou flacons de précieux échantillons de s&#39;échapper et de couler au fond de la cuve d&#39;azote liquide remplie. Dans de tels cas, les échantillons pourraient être récupérés péniblement après le transfert de l&#39;azote liquide dans un récipient de secours ou de le jeter. Les boîtes et flacons peut alors être récupéré à partir de façon relativement sûre vidé Dewar. Cependant, la nature de l&#39;azote liquide cryogénique et son taux d&#39;expansion fait coulé dangereux de récupération de l&#39;échantillon. Il est souvent recommandé par les bureaux de sécurité que l&#39;extraction d&#39;échantillon sera jamais réalisée par une seule personne. Une autre alternative est d&#39;utiliser commercialement disponibles accapareurs fraîches ou des pinces pour arracher les 3 flacons. Cependant, la visibilité limitée dans les sombres liquides Dewars remplis pose un obstacle majeur à leur utilisation. Dans cet article, nous décrivons la construction d&#39;un dispositif de récupération de bricolage Cryotolerant, ce qui rend la récupération de l&#39;échantillon de Dewar contenant des fluides frigorigènes, à la fois la sécurité d&#39;une faciles.

Watch this Scientific Journal Video about Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks at JoVE.com

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Ici, nous présentons un faible coût, durable dispositif cryotolerant pour la récupération d&#39;échantillon à partir de réservoirs de Dewar remplis avec de l&#39;azote liquide. La facilité de la construction et la conception modulaire de l&#39;appareil rend le processus de récupération de l&#39;échantillon à partir de réservoirs cryogéniques sûr et facile.

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K vues.  George Mason University. Ici, nous présentons un faible coût, durable dispositif cryotolerant pour la récupération d'échantillon à partir de réservoirs de Dewar remplis avec de l'azote liquide. La facilité de la construction et la conception modulaire de l'appareil rend le processus de récupération de l'échantillon à partir de réservoirs cryogéniques sûr et facile.

Vidéo: Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabrication d&#39;un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Recherche

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

L&#39;instillation trachéale directe des solutés dans les poumons de souris

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Techniques de reproduction pour la surveillance et le contrôle de l'ovaire chez les amphibiens

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Chargement d’échantillons cryogéniques dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire à angle magique qui préserve la viabilité cellulaire

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...