Nous reconnaissons le financement du programme chimique et biologique de métrologie National Measurement Office du Royaume-Uni. Nous remercions Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi et Eric Rees pour obtenir des conseils et des suggestions techniques. Nous remercions Miklos Erdelyi, Eric Rees et Max Ryadnov des commentaires et des discussions sur ce manuscrit utiles.

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous montrons avec quelques échantillons de test simples et l&#39;orage traitement librement accessible logiciel, il est possible d&#39;optimiser STORM super-resolution imaging. Ces outils et méthodes fourniront des points de départ utiles pour les nouveaux utilisateurs et les moyens pour les utilisateurs expérimentés à accroître la confiance dans leurs microscopes et de leur usage pour étudier les structures biologiques et cellulaires avec des détails sans précédent. En utilisant une combinaison d&#39;échantillons avec des structures connues ou bien comprises et un algorithme qui peut produire un certain nombre de paramètres de qualité d&#39;image utiles, telles que les estimations de précision moyenne, le nombre de localisation et des histogrammes montrant qu&#39;il est possible d&#39;améliorer la qualité de l&#39;image et d&#39;avoir une plus grande confiance dans le processus d&#39;imagerie STORM. Il n&#39;y a pas une approche unique à l&#39;acquisition des données, car il ya un certain nombre de configurations différentes de microscope commerciales et l&#39;auto-construction qui peut être utilisé. En outre, il ya beaucoup de préparation de l&#39;échantillon et de l&#39;image acquisition étapes qui peuvent influEnce l&#39;image finale ayant des outils logiciels et des échantillons de test est donc essentielle à la compréhension et l&#39;optimisation STORM qualité d&#39;image. En outre, ces protocoles peuvent fournir des moyens utiles et moins ambiguës de dépannage des problèmes qui peuvent survenir. Par exemple l&#39;échantillon de dextrane est un moyen très utile pour identifier s&#39;il existe un défaut d&#39;alignement de faisceau laser ou un éclairage irrégulier de l&#39;échantillon. Si l&#39;on craint que le tampon de commutation ne peut être travaille un test visuel très simple pour voir si il ya une «clignotant» aidera. Les filaments d&#39;actine sont un moyen utile de mesurer la résolution en utilisant des comparaisons FWHM tout en soulignant la dérive et une mauvaise localisation des objets. Toutefois, il convient de noter que les méthodes de super-résolution basée à la localisation peuvent être densité fluorophore sensible, nonobstant les autres facteurs, tels que le temps d&#39;exposition, de cadences, des puissances laser et la façon dont l&#39;image est traitée, il est impossible d&#39;assigner une résolution à unenotamment microscope et de supposer que toutes les images auront cette résolution. Ce qui est possible, cependant, est de mesurer les différents aspects de la résolution, tels que des précisions moyen de localisation, numéro de localisation et de la dérive 27. Même si marqueurs de référence ne peuvent pas être intégrés dans toutes les expériences qu&#39;ils peuvent, au moins, être utilisés pour caractériser un système de microscope, de son environnement et de mieux comprendre les considérations opérationnelles telles que combien de temps est nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre thermique après le démarrage. En plus de la correction de la dérive latérale, marqueurs fiduciaires peuvent être utilisés pour caractériser et corriger la dérive axiale, bien que cela nécessite l&#39;utilisation d&#39;une lentille astigmatique et un mécanisme de rétroaction pour corriger la position de l&#39;échantillon, tandis que les images sont en cours d&#39;acquisition 43. Systèmes de super-résolution commerciaux comprennent généralement une sorte de contrôle de la stabilité ou de se concentrer Mécanisme de verrouillage, qui peut être une solution plus pratique pour corriger la dérive de mise au point. Il are alternatives à revêtir de façon non spécifique de la vitre avec le dextrane, par exemple en utilisant des colorants ou d&#39;autres molécules directement conjugués, tels que des anticorps secondaires. Une limitation de ces approches est que le nombre de molécules liées à la vitre n&#39;est pas connue. Structures filamenteuses alternatifs qui ont été utilisés comprennent microtubules 28 et l&#39;ADN 21. Cependant, la combinaison de très petite taille et de réactifs disponibles dans le commerce avantageuses font l&#39;actine une alternative intéressante, en particulier lorsque la distance de séparation de filaments ramifiés ou divergents peut aussi être une mesure utile de la performance du système 27. Il ya de la place pour le développement ultérieur des échantillons, malgré les progrès récents dans ce domaine 28,29,46,47. En particulier, l&#39;imagerie multi-couleur présente un certain nombre de défis dans les 3 principaux aspects de l&#39;imagerie, de l&#39;étiquetage de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de l&#39;image (hardware) et des logiciels (traitement et l&#39;alignement d&#39;image). Il ya un étéun certain nombre de publications traitant de ces aspects 4-6 et il est donc clair que les échantillons et les méthodes d&#39;essai appropriées sont essentielles pour générer et interpréter de façon fiable ces types d&#39;images. En effet, récemment, il a été montré que dSTORM pourrait être utilisé pour prendre deux images couleur, de et à résoudre, la nature hautement symétrique du complexe du pore nucléaire et les auteurs ont suggéré que ce serait un moyen idéal pour évaluer la performance des corrections d&#39;aberration chromatique 45. Une autre approche intéressante est l&#39;utilisation de l&#39;ADN origami pour créer un nanoruler, ce qui crée la possibilité de fluorophores de positionnement à des distances sous-diffraction spécifiques intervalle 46. Cela fournit un moyen de déterminer la résolution et de faire des mesures de distance. Cependant, le but ultime est d&#39;appliquer ces techniques de super-résolution pour échantillons non idéalisées, comme les cellules, qui sont des structures tridimensionnelles complexes. Dans ce cas, une combinaison d&#39;une compréhension plus approfondie de til technique combinée avec des outils logiciels qui aident l&#39;utilisateur dans l&#39;acquisition de données, les traiter de manière appropriée, et fournir des paramètres d&#39;image est susceptible d&#39;être la réponse ultime 28,29,47,48.

Récemment, un éventail de techniques de microscopie optique ont été développés, généralement dénommée super-résolution microscopie ou nanoscopie, permettant ainsi de contourner la limite de diffraction et de générer des images avec des résolutions de 100 nm ou plus 1,2. Depuis l&#39;annonce de la microscopie de super-résolution comme étant la méthode Nature Methods de l&#39;année en 2008, il ya eu beaucoup de développement de microscopes à base de localisation. Par exemple, il existe des applications multi-couleurs 3-6, 7-12 implémentations 3D et les applications de cellules vivantes, même 5,13-17. En outre, comme ces systèmes sont commercialisés et sont en train de faire leur chemin hors des laboratoires d&#39;optique dans les mains des biologistes cellulaires, il est susceptible d&#39;être une nouvelle augmentation de leur utilisation et application aux questions biomédicales. Une branche de cette famille sont les méthodes basées sur la localisation, qui travaillent en mettant en place une molécule par molécule d&#39;image. Jen Pour ce faire, la majorité des molécules fluorescentes dans l&#39;échantillon doit être coupée de telle sorte que seulement quelques molécules séparées spatialement, sont actives à un moment donné. Ces molécules sont ensuite passés rapidement sur et en dehors et de nombreuses images sont prises de sorte qu&#39;une partie importante de la population est imagé à refléter la structure sous-jacente avec une précision de sous-diffraction. Un certain nombre d&#39;approches ont été publiées notamment GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 et RESOLFT 22. Algorithmes qui mesurent la position d&#39;une détection de molécule unique peuvent ensuite être utilisés pour localiser la position réelle de la molécule avec une précision meilleure que 20 nm en utilisant raccord gaussien 23, par exemple rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 et palm3d orage 27. Quand l&#39;imagerie cellulaire ou d&#39;autres échantillons biologiques, qui ont une forte densité de molécule, il est donc nécessaire de prendre des milliers de cadres dece clignotement, séparés spatialement, le signal pour l&#39;image, une proportion importante des molécules marquées. Microscopie stochastique de reconstruction optique (STORM) et la dSTORM très liés et méthodes GSDIM sont des méthodes de super-résolution basée à la localisation, qui se sont révélées à travailler avec des colorants organiques disponibles dans le commerce 21. Il a été démontré depuis d&#39;être applicable à un certain nombre de différents colorants de 28 à 30, ce qui rend la méthode particulièrement intéressante en raison de la spécificité et de la commodité d&#39;autres approches d&#39;immunomarquage bien établis pour effectuer la microscopie de fluorescence. Par conséquent, il ya un accès facile à une gamme de conjugués anticorps-colorant et colorant biomolécules, qui ont le potentiel d&#39;être utilisé dans de super-résolution imagerie basée sur la localisation. Alors que les principes généraux du STORM et des approches similaires sont relativement simples, et à première vue, la préparation du matériel et de l&#39;échantillon semblent relativement straightforward, il ya un certain nombre d&#39;étapes dans le processus qui sont essentiels à la réalisation de haute qualité, des images libres de artefact super-résolution. Comme avec toutes les techniques de microscopie le processus peut être considéré en trois étapes principales: d&#39;abord, la préparation d&#39;échantillons, d&#39;autre part, l&#39;acquisition des images et, troisièmement, le traitement d&#39;image et / ou l&#39;analyse et l&#39;interprétation d&#39;image. Le pouvoir de résolution supplémentaire et méthode de générer des images de super-résolution en utilisant une approche basée sur la localisation-introduit de nouveaux problèmes et considérations 31-33. En commençant par la préparation des échantillons, lors de l&#39;exécution immunomarquage, en particulier immunofluorescence indirecte, où une combinaison d&#39;anticorps primaire et secondaire est utilisée, il convient de noter que le colorant fluorescent peut être jusqu&#39;à 20 nm à une distance à partir de la molécule d&#39;intérêt. Dans le cas des microtubules, ceci conduit à des diamètres de 35 à 50 nm par rapport à un diamètre de microtubules prévue de 25 nm 28,30. En outre, la densité de l&#39;étiquetage devrait meet les critères de Nyquist afin de générer une image de haute qualité 14. Par exemple, pour une résolution d&#39;image prévue de 20 nm le long d&#39;une structure filamenteuse il devrait y avoir une molécule de colorant, au moins tous les 27 à 10 nm. Alors que de nombreux colorants ont été publiées à travailler pour les approches à base de localisation-la performance globale du colorant est un mélange d&#39;au moins quatre critères importants, à savoir les photons détectés par événement de commutation (la luminosité de chaque clignement - lumineux est mieux), l&#39;équilibre sur cycle hors service (le taux de contraste de colorants dans le hors contre sur l&#39;état - plus large est généralement mieux), la fraction de survie (un taux de blanchiment bas est mieux) et le nombre de cycles de commutation (le nombre de clignotements par fluorophore - plus est mieux pour une grande résolution, bien que 1 clignotement par fluorophore peut être un avantage pour des fins de comptage molécules). La situation est encore compliquée par le fait que ces propriétés pour n&#39;importe quel colorant donné peuvent varier dans différentes conditions de tampon etavec le laser de puissance 28,29. En outre, ainsi que ces considérations STORM uniques, la qualité de l&#39;image peut être améliorée en optimisant la préparation des échantillons de la même façon que les techniques de microscopie par fluorescence plus classiques, par exemple en réduisant au minimum l&#39;autofluorescence par modification des conditions de fixation et l&#39;utilisation de réactifs d&#39;extinction. De plus, en minimisant fluorophores non liés spécifiquement est important, ce qui peut être fait en ajustant les concentrations d&#39;étiquettes, des temps d&#39;incubation et blocage et de lavage étapes. La deuxième étape de l&#39;acquisition d&#39;image est également critique. Les paramètres optimaux sur le microscope dépendront de la teinture, des conditions de tampon, la densité de marquage, et le type d&#39;échantillon, par exemple, le verre, les monocouches sur des cellules ou des échantillons de tissus. Les principales considérations sont caméra le temps d&#39;exposition, numéro de trame, angle d&#39;éclairage (FRBR, Hilo, Epi) et la puissance du laser. L&#39;objectif est de collecter autant de clignotements séparés spatialement lumineux le plus rapidement possible. Si le fond is très élevées ou clignote ne sont pas très lumineux, en d&#39;autres termes le rapport signal-sur-bruit est faible, l&#39;algorithme de reconstruction ne sera pas en mesure de localiser les positions avec précision. Ainsi que la maximisation de la précision de localisation, c&#39;est à dire la précision de la position de chaque molécule peut être mesurée, de la qualité de l&#39;image dépend également d&#39;un grand nombre de localisations. Si un nombre insuffisant de molécules d&#39;intérêt sont imagé, soit en raison de la faible efficacité de l&#39;étiquetage, photoblanchiment excessive ou un numéro d&#39;image insuffisante, alors l&#39;image résultante de super-résolution sera ponctuée et discontinu comme critères de Nyquist n&#39;auront pas été remplies 14,27 . Et enfin, la troisième étape, le traitement d&#39;image, est particulièrement important par rapport aux techniques de microscopie à fluorescence standard. Il existe une gamme de librement et disponibles dans le commerce des algorithmes, ce qui est à la fois un avantage, en termes de choix, et un inconvénient, en ce qu&#39;il peut être difficile de savoir which est le plus approprié à utiliser. Si par exemple les données brutes a bien espacées clignote spatialement distincts alors un algorithme d&#39;ajustement seule molécule peut être très précise et efficace, par exemple par les algorithmes d&#39;ajustement rares disponibles sous une pluie torrentielle 27, rapidSTORM 24,25, 12 et palm3d logiciel QuickPALM 26 . Si les données brutes contient beaucoup de chevauchement des signaux alors algorithmes qui peuvent être plus appropriés inclure DAOSTORM 34, 35 et 3B deconSTORM 36. En outre, ces algorithmes contiennent des seuils pour différents critères tels que nombre de signaux, ou de photons par clignotement, ainsi que diverses autres options d&#39;affichage d&#39;image, comme la visualisation des fonctions gaussiennes lissées ou histogrammes avec des grilles de pixels, où la taille de pixel de super-résolution peut être sélectionné par l&#39;utilisateur. Toutes ces options modifier l&#39;apparence de l&#39;image finale et ont des implications pour l&#39;interprétation des images et l&#39;analyse. <p class="jove_content"&gt; Par conséquent, nous présentons trois échantillons d&#39;essai qui fournira le nouvel utilisateur avec un point de départ pour des expériences à base de colorants à base de localisation-super-résolution, qui, pour des raisons de clarté, nous appellerons comme tempête, et les utilisateurs plus expérimentés de la possibilité de optimiser leurs expériences. Premièrement, il est possible de revêtir la surface de verre avec une couche fluorescente de dextrane-conjugué colorant. Cela fournit un moyen rapide et simple à mettre en place que le microscope, colorant et tampon travaillent pour générer clignotant signal fluorescent. La méthode peut être étendue en comparant mesures moyennes de précision de la localisation et le numéro générés par la tempête de pluie pour optimiser les conditions de tampon, les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image et de tester différents colorants. Deuxièmement, nous présentons un protocole simple pour la préparation de filaments d&#39;actine sur le verre qui peut être facilement marqué à l&#39;aide conjugués phalloidin-dye. Ceux-ci fournissent des structures idéales pour effectuer des mesures de la résolution 27 et généralement la moitié du maximum pleine largeur (FWHM)d&#39;un filament est donnée comme une estimation empirique de la résolution 37. Il convient de noter que la résolution varie entre les échantillons et entre les images dans le même échantillon parce que la résolution en super-résolution microscopie basée localisation-est une fonction de la luminosité de fluorophore, le bruit de fond et la densité de localisation 27 et ceux-ci ne sont pas nécessairement constante tout au long de l&#39;échantillon. Les filaments d&#39;actine sont utilisés pour démontrer artefacts potentiels tels que mislocalizations et de la dérive et la façon dont ils peuvent être identifiés avec des fonctionnalités du logiciel au sein orage. En outre, nous décrivons l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents repères à la fois la mesure et la dérive correcte. Et troisièmement, la coloration des cellules avec le facteur de croissance épidermique (EGF), des conjugués de colorant-est décrite. FEM fournit un indicateur utile de la super-résolution performance de l&#39;image, car une proportion du récepteur à la surface de la cellule subit une endocytose via des vésicules, qui sont des structures de taille sous-diffraction d&#39;environ 50-150 nm de diamètre 27,38,39.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

STORM est une technique de microscopie de super-résolution récemment développé avec jusqu&#39;à 10 fois meilleure résolution que les techniques de microscopie de fluorescence standard. Cependant, comme l&#39;image est acquise d&#39;une manière très différente de la normale, en mettant en place une molécule par molécule de l&#39;image, il ya des défis importants pour les utilisateurs en essayant d&#39;optimiser leur acquisition de l&#39;image. Afin de faciliter ce processus et de gagner plus de perspicacité dans la façon dont fonctionne TEMPÊTE nous présentons la préparation de trois échantillons d&#39;essai et la méthode de l&#39;acquisition et de traitement STORM images de super-résolution avec des résolutions typiques de 30-50 nm. En combinant les échantillons d&#39;essai avec l&#39;utilisation du logiciel libre disponible de traitement de tempête de pluie, il est possible d&#39;obtenir une grande quantité d&#39;informations sur la qualité et la résolution d&#39;image. En utilisant ces paramètres, il est alors possible d&#39;optimiser le procédé d&#39;imagerie à partir de l&#39;optique, de préparation, choix de colorant, des conditions de tampon et les paramètres d&#39;acquisition de l&#39;image de l&#39;échantillon. Nous unmontrent des exemples LSO de certains problèmes courants qui entraînent une mauvaise qualité d&#39;image, tels que la dérive latérale, où l&#39;échantillon se déplace au cours de l&#39;acquisition et de la densité d&#39;image des problèmes résultant du phénomène de «mauvaise localisation» liés.

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Nous décrivons la préparation de trois échantillons d&#39;essai et comment elles peuvent être utilisées pour optimiser et évaluer la performance des microscopes de tempête. L&#39;utilisation de ces exemples, nous montrons comment acquérir les données brutes et les traiter ensuite pour acquérir des images de super-résolution dans les cellules d&#39;environ 30-50 nm de résolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

31.0K vues.  National Physical Laboratory.  Nous décrivons la préparation de trois échantillons d'essai et comment elles peuvent être utilisées pour optimiser et évaluer la performance des microscopes de tempête. L'utilisation de ces exemples, nous montrons comment acquérir les données brutes et les traiter ensuite pour acquérir des images de super-résolution dans les cellules d'environ 30-50 nm de résolution. 

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

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Recherche

Biologie

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.

Correction à haute précision des changements chromatiques 3D à l’ère de l’imagerie biologique à haute résolution à l’aide de Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...