Ce travail a été financé par l&#39;Institut Max Planck de psychiatrie et de l&#39;Union européenne Marie Curie Réseau de formation initiale (contrat NINA 238 665).

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Programmation épigénétique est de plus en plus reconnue comme un mécanisme important qui sous-tend la santé et la maladie. Nous présentons ici une méthode plus perfectionnée pour l&#39;isolement simultané de l&#39;ADN et d&#39;ARN à partir micropunches et les étapes ultérieures d&#39;obtenir des profils de méthylation d&#39;ADN par séquençage au bisulfite. Le flux de travail optimisé permet une analyse pratique de la programmation épigénétique dans le cerveau en réponse à des stimuli environnementaux. En outre, cette approche facilite l&#39;enquête de la relation fonctionnelle entre la méthylation de l&#39;ADN et l&#39;expression des gènes à la fois comme sont analysés à partir du même échantillon. Enfin, le nombre d&#39;animaux nécessaires pour l&#39;expérience peut être considérablement réduit. Certaines précautions et les directives doivent être suivies lors de l&#39;exécution du flux de travail présenté. Considérant l&#39;extraordinaire complexité et l&#39;hétérogénéité du cerveau et, depuis motif de méthylation et d&#39;expression peut varier d&#39;une manière cellules et des tissus spécifiques, il est de la plus hauteimportance que micropunching est effectuée de manière standardisée. Comme un cas au point, la programmation épigénétique de AVP est détecté dans le paravaventriuclar, mais pas dans le noyau supraoptique (figure 4b-d), deux Avp exprimer régions de l&#39;hypothalamus 4. À cet égard, la disponibilité de l&#39;ADN et l&#39;ARN du poinçon même tissu est avantageux que l&#39;expression d&#39;ARN de gènes marqueurs tissulaires certaines spécifiques peuvent être utilisés dans certains cas, pour certifier que la zone voulue a été frappé. Bien que micropunching peut réduire l&#39;hétérogénéité cellulaire, il ne faut pas oublier que cette approche ne conduise pas à l&#39;isolement de types de cellules simples ou des populations. Étapes de purification supplémentaires pourraient être envisagées pour traiter ce sujet. Pour le bisulfite de séquençage de conception d&#39;amorce optimale pour l&#39;amplification par PCR de bisulfite de traitement suivant est essentiel. Les produits de PCR de plus de 400 pb de longueur peut être problématique en raison de la dégradation de l&#39;ADN par le btraitement isulfite. Il convient également de noter que la PCR nichée peut donner des résultats biaisés si seulement quelques modèles intacts contribuer au processus d&#39;amplification. Paires d&#39;amorces qui sont spécifiques pour l&#39;amplicon modification doit être conçue; leurs séquences ne doivent pas contenir des dinucléotides CpG, afin d&#39;éviter la méthylation polarisée d&#39;amplification. En outre, des amorces doit contenir non-CpG cytosines pour éviter l&#39;amplification de l&#39;ADN non modifié ou incomplètement convertie. L&#39;amplification de certains modèles peuvent bénéficier de la conduite de démarrage à chaud PCR. Dans tous les cas, la pertinence de paires d&#39;amorces doivent être vérifiées dans des expériences pilotes de manière à empêcher la détérioration de la valeur des spécimens expérimentaux. Séquençage bisulfite représente une méthode standard pour l&#39;analyse de méthylation spécifique de site tel qu&#39;il est capable de détecter de manière fiable et précise de la méthylation de CpG uniques résidus de manière spécifique de l&#39;allèle 8. Le séquençage direct du produit de PCR n&#39;est pas conseillé que la méthylation mixte oFA CpG résidus apparaît comme un pic C / double T dans le électrophérogramme, ce qui peut empêcher la quantification de la méthylation du site concerné. Pour cette raison, une étape de clonage intermédiaire est effectuée et plusieurs clones sont séquencés (~ 20-30) pour déterminer l&#39;étendue de la méthylation. Pyroséquençage représente une méthode alternative pour quantifier méthylation de l&#39;ADN. Il utilise également la conversion au bisulfite et le bisulfite de PCR mais au lieu de clonage et le séquençage de l&#39;amplicon est soumis à une réaction directe pyroséquençage où le statut de méthylation d&#39;un résidu CpG est lu comme un C / T polymorphisme de nucléotide unique qui peut être facilement quantifiés. Les deux méthodes de détecter des niveaux similaires de méthylation 9, mais depuis le clonage étape peut être omise pyroséquençage prend plus de temps efficace. Toutefois, selon le modèle de seulement 40 à 100 nucléotides peuvent être séquencés à la fois de sorte que plusieurs séries de pyroséquençage avec amorce de séquençage différentes sont nécessaires. Il s&#39;agit d&#39;une limitation critique, étant donné thamontants plus élevés de l&#39;ADN t (environ 1 pg par réaction) sont nécessaires, ce qui prévisible dépasse les montants disponibles à partir de minuscules coups de tissus cérébraux. Ainsi la première analyse des régions dans la gamme de plusieurs kilobases par pyroséquençage semble moins adapté que la lecture seul clone. Néanmoins, à la suite de l&#39;identification d&#39;une petite région de pyroséquençage intérêt doit être pris en considération. Collectivement, le protocole décrit ci-dessus fournit une approche précise, efficace et rationalisé pour l&#39;analyse rapide et rentable de micropunches cerveau de modifications épigénétiques. Spécimens multiples peuvent être traitées en un seul passage et les méthodes sont adaptées lors de l&#39;exécution des échantillons provenant de taille intermédiaire expériences.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sang DNeasy &amp; Kit de tissus </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin II de l&#39;ARN </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955,50 </td></tr><tr><td> EpiTect Kit bisulfite </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extrait </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector kit de clonage </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 séquençage Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar polymérase Taq </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq Polymérase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

L&#39;exposition à l&#39;alimentation, les médicaments et l&#39;adversité au cours de la vie au début fenêtres sensibles de la vie 1,2 peut conduire à des changements durables dans l&#39;expression des gènes qui contribuent à l&#39;affichage des phénotypes physiologiques et comportementaux. Cette programmation de l&#39;environnement est susceptible d&#39;augmenter la susceptibilité à métaboliques, les maladies cardio-vasculaires et mentales 3,4. Méthylation de l&#39;ADN et des modifications des histones sont considérés comme des processus clés dans la médiation du dialogue gènes-environnement et semblent aussi sous-tendaient la programmation de l&#39;environnement 5. Chez les mammifères, méthylation de l&#39;ADN comprend typiquement l&#39;addition covalente par un groupe méthyle à la position 5 de la cytosine dans le contexte de dinucléotides CpG. Méthylation de CpG se produit de façon hautement tissu-spécifique de cellule et qui en fait un défi à étudier, des petites régions discrètes du cerveau, où l&#39;hétérogénéité cellulaire est haute et la quantité de tissu limitée. En outre, barce que l&#39;expression des gènes et de méthylation sont étroitement liés les événements, une valeur accrue peut être obtenue en comparant les deux paramètres dans le même échantillon. Ici, un protocole étape par étape (Figure 1) pour l&#39;enquête de la programmation épigénétique dans le cerveau est présenté en utilisant le paradigme du «séparation maternelle» de l&#39;adversité début de la vie à des fins d&#39;illustration. Le protocole décrit la préparation de micropunches de cerveaux de souris différentiellement d&#39;âge à partir duquel l&#39;ADN et l&#39;ARN peuvent être simultanément isolés, permettant ainsi méthylation de l&#39;ADN et les analyses d&#39;expression génique dans le même échantillon.

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Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l&#39;ADN et des modifications d&#39;expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l&#39;isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN Optimisé et d&#39;expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

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18.6K vues.  Max Planck Institute of Psychiatry. Un flux de travail simplifié pour étudier méthylation de l'ADN et des modifications d'expression des gènes lors de début de la vie de stress est montré. A partir de la séparation maternelle des souriceaux nouveau-nés et l'isolement des tissus cérébraux distincts, nous représentons un protocole à la fois isoler l'ADN et l'ARN à partir de poinçons de tissus cérébraux pour le séquençage du bisulfite de suite et analyse RT-PCR.