The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS permet de concentré, la quantification précise de méthylation d&#39;ADN avec des capacités de débit élevées à la fois dans le nombre d&#39;échantillons, le nombre de cibles. En outre, cette génération bibliothèque à l&#39;aide de tagmentation transposome médiation nécessite l&#39;ADN d&#39;entrée moins, est plus rapide et contient moins d&#39;étapes que cisaillement traditionnelle et les techniques de ligature adaptateur ultérieures. Ces améliorations par rapport aux méthodes existantes permettent précise le niveau base de l&#39;analyse de méthylation d&#39;ADN de toute cible d&#39;intérêt. En outre, BSAS fournit une nouvelle méthode de confirmation de régions d&#39;intérêt (régions de méthylation de manière différentielle (DMR), îlots CpG, régions réglementaires) qui ont été identifiés à l&#39;aide de génomes entiers bisulfite 22 ou capturer 23 approches. En utilisant des approches de confirmation orthogonales et plus quantitativement méthodes précises améliore la rigueur analytique des études épigénomiques. La profondeur de lecture élevé atteint avec BSAS permet une quantification précise dans un intervalle de confiance étroit, rectsconsulting dans la quantification précise 16. En outre, la capacité d&#39;exécuter de nombreux échantillons en une seule expérience peut augmenter la taille de l&#39;échantillon pour les confirmations de méthodes du génome entier, ce qui augmentera la puissance statistique; une faiblesse de nombreuses études épigénétiques actuelles. Surtout, BSAS fournit une quantification spécifique de méthylation CpG-base, ce qui permet la génération d&#39;hypothèses vérifiables pour la recherche en épigénétique. Les hypothèses comme l&#39;augmentation de la méthylation à un élément de réponse spécifique provoque une diminution de la liaison d&#39;un facteur de transcription spécifique. BSAS, combinées avec les données d&#39;expression d&#39;ARNm couplés, fournit un procédé d&#39;obtention à la fois la régulation épigénétique et l&#39;expression de l&#39;ARNm au sein d&#39;une seule pièce de tissu ou population de cellules. Mesures paires de régulation et l&#39;expression augmentent également la rigueur scientifique et l&#39;impact des résultats. Les étapes critiques au sein du protocole BSAS comprennent la conception primaire, l&#39;optimisation de l&#39;amplicon, et la génération de bibliothèque /QC. Biais PCR est introduit si amorces sont pas bien conçus et amplifient l&#39;efficacité à différents 8. L&#39;utilisation de normes de méthylation, comme 100% et 0% cytosine méthylés normes générés par voie enzymatique, peut être utilisé pour déterminer le degré, le cas échéant, de partialité méthylation de quantification, et est un contrôle méthodologique appropriée lors de la quantification méthylation 16. De même, il faut prendre soin lors de l&#39;optimisation des réactions de PCR pour générer un seul amplicon de haute qualité. Si aucun amplicon est présent en utilisant les lignes directrices proposées décrites dans le protocole, des mesures d&#39;optimisation comprennent l&#39;augmentation du nombre de cycles PCR ou le montant d&#39;entrée bsDNA. Se il ya des produits de PCR multiples, y compris des dimères d&#39;amorces, des mesures d&#39;optimisation comprennent quantité décroissante d&#39;entrée bsDNA, diminuant les concentrations d&#39;entrée molaires d&#39;amorces PCR, la hausse des températures de recuit, ou en diminuant le nombre de cycles PCR. L&#39;un ou une combinaison de ces procédures d&#39;optimisation donne des résultats suffisants pour générer une seule higamplicon h-qualité. Alternativement, la refonte amorces est une bonne approche pour jeux d&#39;amorces qui ne produisent pas un seul amplicon. Dans les régions où la refonte ne est pas approprié ou possible, dégénérer jeux d&#39;amorces dont les deux peuvent travailler de la cytosine et la thymine de sites CpG dans amorces sens et de l&#39;adénine et la guanine de sur les sites CpG dans amorces inverses. Cependant, ces jeux d&#39;amorces doivent poursuite de l&#39;optimisation pour se assurer qu&#39;aucun biais PCR est en cours, un processus en dehors du champ d&#39;application de ce protocole. bibliothèques de qualité sont extrêmement important pour le succès. Assurez-vous que QC mesures sont effectuées pour déterminer la taille, la qualité et la quantité des bibliothèques avant séquençage. Les réactions de séquençage sont sujettes à l&#39;échec avec la participation des bibliothèques de faible qualité. Biais dans la méthylation quantification peut être atténué en veillant à ce que les fréquences de méthylation sont présents à la fois avant et arrière lit séquençage. De plus, les scores de qualité de l&#39;alignement des bases de sites CpG devraient être ≥Q30 pour la haute confidence dans la quantification. Alors que d&#39;autres ont montré précédemment peu ou pas de biais dans les réactions de tagmentation de bisulfite ADN converti 19, assurant que les mesures décrites ci-dessus permet de confirmation de faible quantification biais de méthylation. BSAS mesure actuellement méthylation des sites CpG, cependant, de futures extensions de cette méthode permettra mesures paires de CpG 5-HMC avec l&#39;ajout d&#39;étapes expérimentales distinction entre 5-mC et 5-HMC telles que l&#39;introduction perruthénate de potassium avant la conversion au bisulfite 24. Cela permettra d&#39;accroître l&#39;impact de l&#39;utilité BSAS en permettant pour la méthylation jumelé, deux 5-mC et 5-HMC, et des données d&#39;expression afin de déterminer les rôles régulation de l&#39;expression des gènes de méthylation de l&#39;ADN. Préparation de bibliothèque Transposome médiée par des amplicons PCR ne entraîne une diminution de la profondeur de séquençage aux extrémités des régions amplifiées. Par conséquent, les régions d&#39;un grand intérêt devraient être conçus pour résider dans le milieu de amplicons. Commentjamais, parce que BSAS génère séquençage lire profondeurs de&gt; 1000 X, la précision quantitative de 5-mC mesures près des extrémités des régions amplifiées reste élevé.

Il a été plus d&#39;un demi-siècle, depuis le premier rapport de modifications de l&#39;ADN d&#39;origine naturelle sous forme de méthylation de cytosine 1. La méthylation des cytosines est une base cytosine nucleotide modifié où la 5 ème carbone sur l&#39;anneau de base a un groupe méthyle (5-mC), se produisant le plus fréquemment dans le dinucléotide CpG motif dans les génomes de mammifères. La présence fonctionnelle de 5-mC dans les promoteurs de gènes est généralement associée à la répression transcriptionnelle, tandis que l&#39;absence est associée à une activité de transcription 2. D&#39;énormes progrès ont été réalisés dans notre compréhension du rôle de la méthylation de l&#39;ADN dans le développement 3, transgénérationnelle propagation de profils épigénétiques 4, la pathogenèse du cancer 5,6, et un certain nombre d&#39;autres domaines de recherche. Beaucoup de ces progrès sont venus au cours des dernières années que de nouvelles méthodes ont été développées pour le profil de méthylation de l&#39;ADN 7. Avec l&#39;avènement etpopularisation de séquençage de prochaine génération (NGS) techniques il ya maintenant un certain nombre de méthodes pour le profil méthylation de l&#39;ADN dans un génome entier ou de grandes régions d&#39;un génome huit. Ces approches ouvrent la possibilité d&#39;études de découverte qui permettent de quantifier les modèles et les différences de méthylation de l&#39;ADN méthylation ADN. En plus de ces approches hypothèse génératrices, il existe un besoin important pour cible / ADN hypothèse de test méthodes méthylation de quantification. Pyroséquençage, PCR spécifique de la méthylation et séquençage Sanger directe de l&#39;ADN converti au bisulfite ont été les méthodes les plus utilisées pour l&#39;analyse des régions ciblées (ce est à dire, une région promotrice d&#39;un seul gène ou d&#39;un îlot CpG) 9-12. Toutes ces méthodes reposent sur ​​la conversion au bisulfite, une réaction de désamination chimique où la cytosine non méthylées sont converties en de de l&#39;uracile, la cytosine méthylés tandis que de 13,14 restent intacts. L&#39;amplification par PCR de bisulfite-Résultats d&#39;ADN converties en uracile de remplacement de la thymine avec 15 permettant la méthylation différentielle à lire comme une différence de base. Bien que très utile, les limites de ces méthodes comprennent faible précision quantitatives, faible longueur de lecture, faible capacité, et d&#39;échantillon. Pour répondre à ces limitations nous avons développé une méthode que nous avons appelé bisulfite Amplicon séquençage (BSAS) 16. L&#39;objectif de cette méthode est d&#39;être capable d&#39;analyser des régions génomiques cibles d&#39;intérêt dans un grand nombre d&#39;échantillons avec une précision quantitative élevé. BSAS utilise des éléments de méthodes existantes (conversion au bisulfite et l&#39;amplification de la PCR spécifique à la région) et les combine avec une simple construction de la prochaine génération bibliothèque (transposome médiation) 17 et paillasse NGS 18 (Figure 1). Cette approche fournit un procédé de débit quantitatif plus élevé et à examiner la méthylation de la cytosine dans ne importe quelle région d&#39;intérêt. Nous présentons ici laméthode en détail et décrire des approches pour le dépannage et vérification de la qualité du processus BSAS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS lectures correctement aligné à la séquence de référence convertie ressemblera Figure 5. Dinucléotides CpG peuvent être clairement identifiés et les états de méthylation peuvent être estimées en observant les appels de base sur les sites CpG dans le lit mappé. Par exemple, avec des commandes de méthylation, 0% méthylation se traduira par toutes les lectures mises en correspondance avec les sites CpG contenant (figure 5A) de T. 100% des contrôles de méthylation se traduiront par toutes les lectures mappé à lit contenant des sites CpG (figure 5B) de C. La quantification de la fréquence de la cytosine (C / C + T) à des sites CpG donne la fréquence de méthylation dans l&#39;échantillon d&#39;origine. Une courbe étalon générée à partir de commandes représentant de méthylation du génome entier (n = 3 / taux de méthylation) montre la linéarité de la méthylation de quantification ainsi que la précision de quantification à chaque taux de méthylation (figure 6). A titre d&#39;exemple de ce procédé, au total, de l&#39;ARN et de l&#39;ADN ont été co-iso<html> culé des cervelet de souris et de la rétine (n = 4 / groupe). Expression rhodopsine, sélectivement exprimée dans les tissus de la rétine, a été mesurée en utilisant qPCR. L&#39;expression a été détectée seulement dans la rétine (figure 7A). Utilisation BSAS, les niveaux de méthylation de CpG ont été quantifiés dans la région de promoteur de la rhodopsine. Les niveaux de méthylation cumulatifs à travers la région de promoteur était&gt; 80% dans le cervelet par rapport à &lt;15% dans la rétine (p &lt;0,001, test t paramétrique) (Figure 7B). BSAS quantification avantages de méthylation spécifique du site de méthylation ainsi la quantification des niveaux de méthylation peuvent être comparés sur une base spécifique de CpG à travers une région génomique donnée. CpG niveaux de méthylation de tout le promoteur de la rhodopsine étaient significativement plus élevés dans les échantillons cérébelleux échantillons par rapport à la rétine (p &lt;0,001, test t paramétrique sur chaque site CpG) (Figure 7c). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1:. Schéma de la méthode BSAS Dans ce procédé, l&#39;ADN génomique est converti au bisulfite de modifier les cytosines de unmethylation à uraciles. Par la suite, au cours de ces PCR uraciles sont modifiés pour thymines. Amplification par PCR est dirigé contre les régions d&#39;intérêt et très enrichit pour seulement ces séquences. Les amplicons PCR résultants sont transformés en bibliothèques double indexées par un processus de tagmentation simple. Ensuite, les bibliothèques sont séquencés sur un séquenceur paillasse de la prochaine génération et le séquençage lectures sont mappés sur la converti in silico séquence de référence et pour cent de méthylation de la cytosine est déterminée d&#39;une manière spécifique à la base. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Dans silico conversion au bisulfite de région d&#39;intérêt Toute région d&#39;intérêt de toute référence génomique peut être sélecTed in silico pour conversion au bisulfite. Cytosines non-CpG sont remplacés par de la thymine dans la séquence de référence. Cytosines CpG restent cytosines converties au bisulfite dans la référence. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figure 3:. Amorces placement Primer bisulfite PCR sont conçus contre une in silico bisulfite converti séquence de référence. Amorces doivent être conçus de sorte qu&#39;ils ne se chevauchent pas dinucléotides CG ou conçus à côté de dinucléotides CG. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figure 4: Exemples de amplicons de PCR de haute qualité et pauvres et les bibliothèques de séquençage traces de électrophérogramme représentatifs et son émission de gel (A) de amplicon idéal pour la génération de la bibliothèque de transposome médiation avec un seul haut.produit de concentration. (B) Bibliothèque généré à partir de ce amplicon montre une forte concentration et même la distribution de taille. (C) amplicons de PCR de mauvaise qualité peuvent être faible en taille, la concentration, et contient de multiples produits et / ou de dimères d&#39;amorces. Ces amplicons de mauvaise qualité conduiront à (D) a échoué génération bibliothèque faible concentration et la distribution de faible taille. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figure 5: Exemples de résultats de séquençage de contrôles de méthylation. (A) Dans silico converti séquençage de référence avec des sites CpG sur fond rouge. 0% de contrôle de méthylation mappé lit de la région indiquant thymines sélectionnés (la cupidité de surbrillance) de cartographie des sites CpG. Commande (B) 100% de méthylation mappé lit montrer (surbrillance bleue) la cartographie de cytosine sur les sites CpG. Figure 6:. Méthylation quantification travers une série de contrôles de méthylation contrôles de méthylation du génome tout mélangé à des taux de méthylation (n = 3 / Ratio) de 0% à 100% ont été quantifiés en utilisant BSAS. Tracé de la quantification de prévu contre quantifiée démontre linéarité du contrôle de méthylation quantification. Dans tous les contrôles, il y avait une grande précision dans la méthylation de quantification. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figure 7: Exemple de paires méthylation de l&#39;ADN et l&#39;expression du gène à partir de l&#39;analyse des échantillons de tissus. (A) Rhodopsin relatif d&#39;expression d&#39;ARNm à partir du cervelet de la souris et du tissu rétinien. (B) la méthylation du promoteur Rhodopsin moyenne quantifiée par BSAS entre cérébelleux et de l&#39;ADN de la rétine (*** p &lt;0,001, test t paramétrique). &lt;forts niveaux de méthylation&gt; C) spécifique de CpG à travers le site promoteur de la rhodopsine (-244 à 6, par rapport au site d&#39;initiation de transcription [TSS]) dans le cervelet de souris et de l&#39;ADN rétine.

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Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K vues.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.