Este trabalho foi financiado pelo Instituto Max Planck de Psiquiatria e da União Europeia Marie Curie Rede de Formação Inicial (NINA Contrato 238.665).

1. Programação por Adversidade Infância Separação materna (SM) é realizada para induzir no início da vida estresse (ELS) em filhotes entregues por ratos timed-grávidas C57BL/6N (dia pós-natal 0 (P0) no dia de nascimento). <ol><li> Ninhadas individuais são colocados em gaiolas limpas (com almofada de aquecimento) durante 3 h diária de P1-10. </li><li> Controle (não-ELS) filhotes permanecem no ninho imperturbado materna em todo. </li><li> Os filhotes são mantidos com suas mães até o desmame (P21), após o que eles estão alojados em grupos sexo-combinados (3-5 ratos por gaiola) sob condições de habitação padrão de laboratório com animais. </li></ol> 2. Isolamento e Dissecção do Tecido Cerebral <ol><li> Ratos são mortos em idades desejadas por Nota cervical deslocamento:. Porque este protocolo envolve um paradigma stress, sem anestesia é dada antes de deslocamento cervical, para evitar interferências com regulação fisiológica normal de hormônios do estresse. Crânios são abertos ecérebros são removidos cuidadosamente e imediatamente snap-congelados por imersão em gelo iso-pentano-seca, antes de ser armazenado a -80 ° C. </li><li> Os cérebros são cryosectioned (10 espessura mm); secções são montadas em lâminas de vidro SuperFrost e mantida a -20 ° C. Referência a um padrão rato estereotáxico atlas (por exemplo, Paxinos 6) é utilizado para verificar a precisão anatómica e garantir a inclusão da região de interesse (por exemplo, para os neurónios no núcleo paraventricular - PVN - recolher a partir de secções do nível do PVN rostral, bregma -0,75 a -0,85). </li><li> As secções são coradas com violeta de cresilo para facilitar a identificação de estruturas diferentes do cérebro. Perfuradores (0,8 mm) das regiões de interesse (por exemplo, NPV) são obtidos por em microdissecação loco. </li></ol> 3. Extração de Ácido Nucleico de socos do cérebro Um protocolo otimizado para extração simultânea de DNA e RNA de pequena neuroanatomicamente definido cérebro regiões para as análises de expressão bissulfito e gene está descrita 7. Nota: Considerando que o RNA é menos estável do que o DNA no tampão-GTC, é recomendável o processamento de RNA em primeiro lugar. O homogenato utilizada para a purificação de ADN pode ser mantida à temperatura ambiente (RT) durante esse tempo. <ol><li> Homogeneizar socos usando uma pipeta e vortexer em 400 uL de tampão de tiocianato de guanidina (GTC) (4,5 M de tiocianato de guanidínio, 2% de N-lauroylsarcosine, 50 mM de EDTA pH 8,25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-mercaptoetanol, 0,2% antiespumante A) à RT, passando várias vezes através de uma seringa hipodérmica (29G) (Figura 2). </li><li> Dividir lisado em partes iguais; RNA e DNA pode ser extraído, ao mesmo tempo ou separadamente, dependendo das necessidades particulares experimentais. </li><li> Para a purificação de ARN adicionar volume 1/10 de NaOAc, 1 AquaPhenol volume (Appligene) (pH 4) e 1/2 volume de clorofórmio: isoamílico (24:1) para lisado. Vortex vigorosamente depois de cada passo eincubar em gelo durante 10 min, de centrifugação (20 min a 10.000 g, a 4 ° C); adicionar um volume igual de EtOH 70% a fase aequous. </li><li> Transfira a mistura para uma coluna de spin de RNA (por exemplo, Nucleospin II a partir de RNA Macherey-Nagel) e executar os passos em coluna de DNase-digestão e lavagem (seguir o protocolo do fabricante); eluir RNA em 25 uL de H2O </li><li> Para a purificação do DNA de um protocolo otimizado do Sangue DNeasy Qiagen e Kit tecido é usado. Equilibre lisado com volumes iguais de tampão de AL e EtOH a 100%, carga sobre uma centrífuga colunas de giro (1 min a 10.000 g, à RT) e descarte flow-through. </li><li> Adicionar 500 ul tampão AW1 incluindo 5 ul de RNAse (1 mg / ml) à coluna e incubar 10 min à TA. De rotação (1 min a 10.000 g, RT) e descartar flow-through. </li><li> Lavar a coluna com 500 AW2 Tampão ul, descartar flow-through e centrifuga coluna vazia (1 min a 15.000 g). </li><li> Adicionar pré-aquecido (70 ° C) Tampão de AE ​​e colunas incubar durante 10 min a 70 ° C. Eluir por centrifugação (1 min, 10.000 g), re-aplicar flow-through e repetir o passo de centrifugação. </li></ol> Utilizar um espectrofotómetro para determinar as concentrações de DNA e RNA. Um típico soco PVN rendimentos ~ 600 ng de DNA e ~ 400 ng de RNA. Para a análise de expressão do gene por PCR quantitativo (qPCR), que usam tipicamente ~ 100 ng de RNA na reacção de transcrição reversa. 4. Conversão Bissulfito Bissulfito de sódio é usado para converter não-metilados citosinas para uracilos. Em contraste, citosinas metiladas são protegidos de conversão. Portanto, todos os citosinas que são detectados no sequenciamento final do bissulfito de PCR-amplicon representam citosinas metiladas. Bissulfito de conversão provoca a degradação do DNA substancial que pode ser um fator limitante na análise de PCR. Condições de reacção optimizados que maximizam a conversão citosina, reduzir a fragmentação de ADN e manter single-stranded DNA mesmo a temperaturas mais baixas pode ser conseguido usandoKit Qiagen do Bissulfito EpiTect. Nas nossas mãos ~ 200 ng de ADN purificado a partir de micropunches fornecer uma quantidade suficiente de material de partida para a reacção de bissulfito. Para evitar que as diferenças na eficiência da reacção de conversão, a quantidade de ADN molde deverá ser mantida constante entre todas as amostras processadas durante uma experiência. Além disso, a sequência lê deve ser examinada para a eficiência de conversão através da análise da taxa de não-convertidos não-CpGs. Esta taxa deve exceder 98%. Os valores mais baixos indicam conversão incompleta ou bissulfito ineficiente e as sequências subjacentes devem ser excluídos da análise. 5. PCR bissulfito <ol><li> Bissulfito projeto de seqüenciamento primers específicos para DNA bissulfito convertidos (ver discussão); Primer Metil expresso de software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Pt / EUA / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602.121) vai ajudar esta e ajudar a determinar ótimas temperaturas de recozimento em experiências-piloto. </li><li> Preparar PCR-Master-Mix (para uma reacção) como se segue: 2,5 ul de tampão de PCR 10x 0,5 ul de 10 mM de dNTPs 1 ml de 10 mM de primers para a frente 1 uL 10 iniciador reverso iM 0,125 ul Qiagen HotStart Taq Mais encher até 23 ul com H2O </li><li> Adicionar 2 DNA tratado com bissulfito uL de reacção. </li><li> Amplificar usando as seguintes condições: 1 ciclo 6 min 95 ° C 45-50 ciclos de 1 min 95 ° C, 1 min à temperatura de recozimento óptima, 1 min a 72 ° C 1 ciclo de 5 min 72 ° C </li></ol> Analise 7 uL de produto de PCR por electroforese em gel de agarose para verificar o tamanho do fragmento amplificado e purificar restante reacção de PCR para a ligação subsequente utilizando um kit comercialmente disponível PCR clean-up (por exemplo, Macherey-Nagel Nucleospin Extrair). No caso de produtos indesejados de PCR adicionais são obtidos, purificação em gel é recomendado. 6. Seqüenciamento Bissulfito De alta resolução perfis de metilação deduzidas a partir de leituras único clone pode detectar pequenas alterações na metilação do DNA e identificar regiões regulatórias que respondam ao tratamento (programação ambiental). O processo de seqüenciamento bissulfito compreende três etapas consecutivas de trabalho. Em primeiro lugar, os produtos de PCR obtidos por antes bissulfito de PCR são ligados num vector e transformado em bactérias. Em segundo lugar, a colónia de PCR a partir de clones individuais é empregue para determinar o tamanho correcto da inserção. Em terceiro lugar, PCRs de colônias positivas são limpos e submetidos a Big-Dye reação de seqüenciamento. Após um passo de limpeza, os produtos são a electroforese em um sequenciador capilar. 6,1 Ligadura e Transformação Nota: Nós rotineiramente usar o pGEM-T vector cloning kit (Promega). Em nossa experiência, a eficiência da clonagem depende criticamente sobre a inserção de ser ligado. Vectores diferentes devem ser testados em caso baixos números de clones recombinantes são repetidamente obtido. <ol><li> Configure reacção de ligação: 5 tampão de ligação ul 2x 1 ml pGEM-T Vector 1 uL de T4-ligase 3 ul limpo, por produto de PCR </li><li> Mistura de reacção por pipetagem e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: A ligadura pode também ser realizada durante 1 h à RT, bem. Para aumentar o número de clones recombinantes, sobre a ligadura noite a 4 ° C é preferido. </li><li> Limpe-up de produtos de ligação por precipitação com etanol: <ol class="lalpha"><li> Adicionar 1 glicogénio uL, 1 ul 3M NaAc e 25 ul de EtOH a 100% para a reacção de ligação com o precipitado durante 1 min em azoto líquido. </li><li> Centrifugar (15,0000 g durante 30 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. </li><li> Lava-se com 300 uLEtOH 70% e de centrifugação (15.000 g durante 20 min a 4 ° C), descarte pelete sobrenadante e seca à temperatura ambiente (10 min). </li><li> Ressuspender o granulado em 10 uL de H2O </li></ol></li></ol> 6,2 Transformação de produtos de ligação em bactérias electrocompetentes <ol><li> Cuvetes precool electroporação (1 mm de largura) sobre gelo e descongelamento alíquota de electrocompetentes bactérias DH5a em gelo. </li><li> Adicionar 45 ul de bactérias DH5a para 10 uL limparam produto de ligação (ver acima) e transferir para cuvete. </li><li> Transformar bactérias a 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF e adicionar 1 ml de meio SOB pré-aquecido diretamente após a entrega de pulso. </li><li> Recuperar as bactérias durante 1 h, a 37 ° C, espalhar 100 ul de suspensão sobre placas de LB / ampicilina revestidas com IPTG / X-Gal. </li><li> Incubar as placas durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 6,3 Colony PCR Nota: Colony PCR a partir de clones individuais é conduzida para assegurar que as inserções sãode tamanho previsto. O desenvolvimento da coloração da seleção azul / branco, eventos de recombinação indesejáveis ​​durante a ligação, a incorporação de pares de primers oligoméricos ou produtos truncados PCR pode levar a resultados de outra forma de sequenciamento defeituosos. Nós usam rotineiramente T7 e SP6 primers para amplificar insere clonados; essa abordagem resulta em seqüências do vetor adicionais de aproximadamente 150 pb. Iniciador T7 é utilizado na reacção de sequenciação num passo posterior. <ol><li> Configurar reacção de PCR em colónias placa de 96 poços. Para uma reação de usar: 3 ul 2,5 mM de MgCl2 2,5 ul de tampão Taq 10x 1,5 mM dNTP 10 ul 2 uL 2,5 mM iniciador T7 2 uL 2,5 mM SP6 iniciador 1 uL Fermentas Polimerase Taq encher até 25 ul com H2O </li><li> Pipetar 25 uL / ​​poço de mistura principal em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Escolha clone (branco) positivo de placa com pipeta de ponta e mergulho na reação de PCR. </li><li> Amplificar usando folguintes condições: 1 ciclo de 4 min a 95 ° C 10 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 s, a 56 ° C e 30 s, a 72 ° C 30 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 s, a 48 ° C e 30 s, a 72 ° C 1 ciclo de 5 min a 72 ° C </li><li> Carregar 5 uL de colónia de PCR num gel de agarose e determinar as reacções que contêm o tamanho da pastilha a direita. </li><li> PCRs Colony contendo os amplicões desejados são limpas utilizando um kit comercialmente disponível (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6,4 Big-Dye terminator reação e seqüenciamento <ol><li> Prepare Mix Master para Big-Dye reação. Para uma reação de usar: 1 uL de H2O 0,5 reagente Big Dye-ul 1,5 ul de tampão de Seqüenciamento </li><li> Pipetar 3 uL / ​​poço em cada poço de uma placa de 96 poços, a cada poço adicionar 2 ul de produto limpo colónia PCR e executar reacção num termociclador com os seguintes parâmetros: 35 ciclos de 10 s a 96 ° C, 5 s, a 50 ° C e 4 min a 60 ° C </li><li> A reação Big-Dye é limpo usando um kit comercial (Millipore Montage 96 Seqüenciamento Clean-Up Kit) e processados ​​em um seqüenciador capilar (por exemplo, ABI 3100 DNA). </li><li> As seqüências são analisadas utilizando o Analisador Biq ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) ou a ferramenta on-line Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) para derivar o padrão de metilação da região do DNA investigados (Figura 4). </li></ol> 7. Os resultados representativos Para obter insights sobre a influência de ELS sobre a expressão Avp e status de metilação, os camundongos C57BL/6N foram processados ​​de acordo com o fluxo de trabalho descrito acima. Resumidamente, um grupo de ratinhos foi C57BL/6N subjected a ELS, enquanto o grupo controle foi deixado intacto. O PVN eo núcleo supraóptico (SON) foram perfuradas e DNA e RNA foram isoladas a partir de, simultaneamente, os perfuradores individuais. O ARN foi transcrito inverso e os níveis de transcritos de avp foram medidos por qPCR análise e normalizada para a expressão de genes de limpeza e HPRT GAPDH. O DNA foi tratado com bissulfito, amplificado com os iniciadores específicos para o intensificador de AVP (Figura 4a) e os produtos de PCR foram clonados e sequenciados. Pelo menos 20 clones recombinantes a partir de cada ratinho / PCR foram analisados ​​para determinar as frequências de metilação para os CpGs contidas no fragmento amplificado por PCR (Figura 4b). Comparados aos controles, ELS induziu uma significativa em hipometilação CpG10, CpG12, CpG13 e Cpg14 do enhancer Avp (p &lt;0,05, n = 6-8 animais), sugerindo epigenética marcação desta região reguladora até o início de experiências da vida. Em contraste com o PVN metilação, deo potenciador Avp não foi afectada pelo ELS na especificidade de tecido SON ilustrando de marcação epigenética (Figura 4c). Análise do estado de metilação do DNA em CpG10 e expressão do gene AVP em animais de controlo (n = 6), evidenciaram uma correlação negativa apontando para um papel de metilação de ADN no ajuste fino do AVP a expressão do gene (Figura 4d). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Micropunches Figura 1. São obtidos a partir de cérebros dissecados do controle e do início da vida ratos estressados. Na sequência de DNA e RNA de isolamento, a expressão do gene é determinada por qRT-PCR enquanto DNA bissulfito tratada é amplificado e produtos purificados foram clonados num vector adequado identificação de clones recombinantes, permitindo por azul / branco selecção. Tamanhos de pastilhas corretas são verificados porcolónia PCR antes da realização Big Dye-reacção e processamento em um sequenciador capilar. Padrão de metilação são visualizados por ferramentas de software apropriadas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figura 2. Timeline a partir de DNA / RNA de extracção para sequenciação bissulfito. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figura 3. De fluxo de trabalho para a extracção simultânea de DNA e RNA. O perfurador do núcleo hipotalâmico paraventricularis, um gene AVP minúscula expressando região do cérebro, é colocado em 400 uL de tampão GTA, vortex até interrompido e ainda homogeneizada por passagem através de uma seringa (29G). O homogenato é então dividido para a purificação de RNA e DNA. A divisão pode ser de 1:1 ou de proporções diferentes, dependendosobre a questão experimental particular. Homogenatos deve ser processado dentro de algumas horas. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figura 4. Metilação de CpG no locus AVP em 6 de controlo semanas de idade e animais ELS. (A) Esquema da cauda AVP e genes de oxitocina orientada para a cauda e separados pela região intergénica (IGR). Exons são representadas por open (numerada) caixas. A distribuição dos resíduos de CpG é indicado e tamanho e posição do fragmento amplificado por PCR respectivo contendo CpG 10 a CpG14 é marcado por uma linha a negrito. (B) Metilação do potenciador AVP no PVN em animais de controlo e ELS (n = 6-8). (C) Metilação do potenciador Avp no SON no controle e animais Els (n = 8-10). (D) Avp a expressão do gene foi correlacionadacom metilação na CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Programação epigenética é cada vez mais reconhecida como um importante mecanismo subjacente de saúde e doença. Aqui apresentamos um método refinado para o isolamento simultâneo de DNA e RNA de micropunches e os passos subsequentes para obter perfis de metilação do DNA através do seqüenciamento bissulfito. O fluxo de trabalho optimizado permite a análise conveniente de programação epigenética no cérebro em resposta a estímulos ambientais. Além disso, esta abordagem facilita a investigação da relação funcional entre a metilação do DNA e expressão do gene que ambos são analisadas a partir da mesma amostra. Finalmente, o número de animais necessários para a experiência pode ser significativamente reduzida. Certas precauções e orientações devem ser seguidas durante a realização do fluxo de trabalho apresentado. Considerando a complexidade extraordinária e heterogeneidade do cérebro e desde padrão de metilação e expressão pode variar de uma maneira células e tecido específico é de extremamicropunching importância que é realizado de forma padronizada. Como um caso no ponto, a programação epigenética de AVP é detectado no paravaventriuclar, mas não no núcleo supraóptico (Figura 4b-d), duas Avp expressando as regiões do hipotálamo 4. A este respeito, a disponibilidade de DNA e RNA a partir do soco mesmo tecido é vantajoso como RNA expressão de certos genes marcadores específicos de tecidos podem ser utilizados em alguns casos para certificar que a área correcta foi perfurado. Embora micropunching pode reduzir a heterogeneidade celular, que tem de ser lembrado que esta abordagem não conduz ao isolamento de tipos de células individuais ou populações. Etapas de purificação adicionais poderão ser considerados para abordar o tema. Para bissulfito de sequenciação desenho de primers de PCR óptima para tratamento com bissulfito de amplificação seguinte é essencial. Os produtos de PCR superiores a 400 pb de comprimento pode ser problemático devido à degradação do ADN pelo btratamento isulfite. Deve também ser notado que a PCR aninhada pode dar resultados enviesados ​​se apenas alguns modelos intactas contribuir para o processo de amplificação. Pares de iniciadores que são específicos para o fragmento amplificado modificado deve ser concebido; suas sequências não deve conter dinucleótidos CpG, a fim de evitar a metilação enviesada amplificação. Além disso, os iniciadores devem conter não CpG citosinas para evitar a amplificação de DNA não modificado ou incompletamente convertido. A amplificação de alguns modelos podem beneficiar de realização de arranque a quente PCR. Em qualquer caso, a adequação de pares de primers deve ser verificado em experiências piloto, de modo a evitar a deterioração de valiosos espécimes experimentais. Sequenciação de bissulfito representa um método padrão para site-specific análise de metilação como é capaz de forma fiável e precisa detectar a metilação de CpG individuais resíduos de uma forma específica de alelo 8. O sequenciamento direto do produto da PCR não é aconselhável como misto de metilação ofa resíduo CpG aparecerá como um pico C / T duplo na electroferograma, que pode impedir a quantificação de metilação no local em causa. Por este motivo um passo de clonagem intermediário é conduzido e vários clones são sequenciados (~ 20-30) para determinar a extensão de metilação. Pyrosequencing representa um método alternativo para quantificar a metilação do DNA. Também utiliza conversão bissulfito e bissulfito de PCR mas em vez de clonagem e sequenciação do fragmento amplificado é submetido a uma reacção directa pyrosequencing em que o estado de metilação de um resíduo de CpG é lido como um C / T único polimorfismo de nucleótidos que podem ser facilmente quantificados. Ambos os métodos detectar níveis semelhantes de metilação 9, mas uma vez que a clonagem passo pode ser omitido pyrosequencing é mais eficiente tempo. No entanto, dependendo do modelo de apenas 40-100 nucleótidos podem ser sequenciados de uma só vez a fim de que vários ciclos de pyrosequencing com iniciador de sequenciação diferente são necessárias. Esta é uma limitação crítica, dado that quantidades mais elevadas de DNA (cerca de 1 mg por reação) são obrigatórios, o que previsível exceder os montantes disponíveis a partir de pequenos socos tecido do cérebro. Assim, a digitalização inicial das regiões na gama de quilobases várias por pyrosequencing aparece menos adequado como leitura único clone. No entanto, após a identificação de uma pequena região de interesse pyrosequencing deve ser considerado. Coletivamente, o protocolo descrito acima fornece uma abordagem precisa, eficiente e simplificado para a análise rápida e custo-eficaz de micropunches cerebrais para mudanças epigenéticas. Espécimes múltiplas podem ser processadas num único ensaio e os métodos são adequados quando execução amostras de intermediário de tamanho experimentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sangue DNeasy &amp; Kit de Tecidos </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> Epitect Kit Bissulfito </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T vector de clonagem Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Seqüenciamento Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Polimerase Taq </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Polimerase Taq </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

A exposição a dieta, medicamentos e adversidades primeiros anos de vida durante as janelas de 1,2 sensíveis vida pode levar a mudanças duradouras na expressão de genes que contribuem para a exibição de fenótipos fisiológicos e comportamentais. Programação ambiental, é susceptível de aumentar a susceptibilidade a doenças metabólicas, cardiovasculares e mentais 3,4. Metilação do DNA e modificações de histonas são considerados processos-chave na mediação do diálogo gene-ambiente e aparecem também para calçar programação ambiental 5. Nos mamíferos, a metilação de DNA compreende tipicamente a adição covalente de um grupo metilo na posição 5 de citosina dentro do contexto de dinucleótidos CpG. Metilação de CpG ocorre de uma forma de tecidos e de células-específica altamente tornando-se um desafio para estudar discretas, pequenas regiões do cérebro onde heterogeneidade celular é elevada ea quantidade de tecido limitada. Além disso, ba expressão do gene omo e metilação estão intimamente ligados eventos, o valor aumentado pode ser obtida por comparação entre os dois parâmetros na mesma amostra. Aqui, um protocolo de passo-a-passo (Figura 1) para a investigação de programação epigenética no cérebro é apresentada usando o paradigma &#39;separação materna&#39; da adversidade vida precoce para fins ilustrativos. O protocolo descreve a preparação de micropunches de cérebros de rato diferencialmente-idade a partir do qual DNA e RNA podem ser simultaneamente isolados, permitindo assim que a metilação do DNA e as análises de expressão de genes na mesma amostra.

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Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

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JoVE Journal

Neuroscience

18.7K visualizações.  Max Planck Institute of Psychiatry. Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Vídeo: Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Neurociência

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...