Ce travail a été financé par le programme de découverte individuelle du CRSNG, le CRSNG / IRSC Programme de recherche concertée sur la santé (PRCS), et le CRSNG CREATE Programme canadien de formation astrobiologie (CATP).

1. Solubilisation QD Il s&#39;agit d&#39;une méthode appropriée pour le CdTe. Des méthodes similaires peuvent être utilisés avec d&#39;autres types de boîtes quantiques tels que InP / ZnS 20 et CdSe / ZnS 21. <ol><li> Préparer une solution de BQs CdTe dans le toluène à 15 um (densité optique = 2,5 au sommet exciton en premier). </li><li> Transférer 200 ul de ce stock dans un flacon en verre. Ne pas utiliser de plastique! </li><li> Ajouter 800 ul du toluène, 1 mL de tampon de 200 mM de borate (pH 9) et 2 ul de 11,5 M d&#39;acide mercaptopropionique (MPA). </li><li> Boucher le flacon et agiter vigoureusement pendant 30-60 secondes. </li><li> Les phases aqueuses et solvants organiques se sépare spontanément. La phase aqueuse va devenir la couleur des points quantiques. Pour éviter la couche de toluène, le retirer et le jeter. Puis transférer la phase aqueuse dans un flacon propre. </li><li> Purifier les points quantiques solubilisées par lavage / filtrage quatre fois en utilisant un pl 500, 10000 filtre moléculaire centrifugeuse poids de coupure. Les filtres doivent êtrefilé à 3000 xg pendant 13 minutes. Pour au moins les deux dernières lavages, se laver avec le tampon final désiré. </li><li> Après le lavage final, de suspendre les boîtes quantiques lavées dans 50 mM tampon borate à pH désiré et conserver à 4 ° C. Ils seront stables pendant 1-2 semaines. </li><li> Mesurer des spectres d&#39;absorption et d&#39;émission pour estimer la concentration basée sur des formules publiées 22. </li></ol> Les résultats représentatifs: Figure 1 montre une image de points quantiques de CdTe sous un éclairage lampe UV, et les spectres d&#39;émission avant et après solubilisation de l&#39;eau, montrant un changement négligeable de l&#39;échange bouchon. Les valeurs de taille sont le diamètre du noyau mesurée par microscopie électronique. 2. Conjugaison QD antibiotiques Cette partie du protocole est applicable à tout chargé négativement l&#39;eau solubilisée nanoparticules, y compris les points quantiques les plus commerciaux, des particules métalliques, et plus 19. <ol><li> Toute molécule qui travaillera either auto-assemble les points quantiques de charge négative solubilisées, ou qui a un groupe réactif qui peut être conjugué, tel qu&#39;une amine primaire. Dans cet exemple, nous utilisons la polymyxine B (PMB), qui est chargée positivement et s&#39;auto-assemble sans avoir besoin de réactifs de conjugaison. Dissoudre le PMB en H 2 O à 60 uM. (Si l&#39;antibiotique choisi n&#39;est pas soluble dans l&#39;H 2 O, dissoudre dans du DMSO ou de l&#39;éthanol à une concentration de 0,1-1 mM). Ce sera une solution 10x (en H 2 O) ou une solution 100x (dans un solvant). </li><li> Calculer la quantité de solution QD vous aurez besoin pour les expériences de toxicité bactériennes. Pour une plaque de 96 puits avec 0,3 ml par puits dans quadruplicates, 0,5 mL de 200 nM conjugué est nécessaire. Préparer deux tubes contenant 100 pi de 1 uM points quantiques dans 50 mM tampon borate. </li><li> Si le couplage à une amine primaire, de préparer un mg 19 / ml (100 mM) solution de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) dans H 2 O. EDC en solution n&#39;est pas stable; Utiliser immédiatement et jeter le reste. </li><li> Ajouter 50 ul de la solution 10x antibiotiques (en H 2 O) ou 5 ul de la solution 100x (dans un solvant) sur le tube de conjugué. Pour PMB: Conjugaison CdTe à un rapport molaire de 30:1, ajouter 50 ul de 60 uM PMB. Ajouter H 2 O ou de solvant pour le tube de contrôle ne QD. </li><li> Si nécessaire, ajoutez 1 ul de la solution mère d&#39;EDC sur le tube de conjugué. </li><li> Apportez le volume conjugué à 0,5 mL avec le tampon approprié (tampon borate ou de PBS; aucun tampons contenant des amines comme Tris, car ils inhibent EDC). </li><li> Tubes protéger de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium, et le lieu ou sur un nutator rocker pendant 1 heure. Si l&#39;agrégation se produit, répétez la conjugaison avec des concentrations plus faibles d&#39;antibiotiques. Titrer vers le haut jusqu&#39;à ce que la concentration des particules ne s&#39;agrègent pas. </li><li> Laver les conjugués en passant par un filtre approprié. 10000 coupure de poids moléculaire fonctionne pour la plupart des antibiotiques, mais pas pour des protéines ou des anticorps. </li&gt; <li> En fonction de la molécule, différentes méthodes peuvent être utilisées pour estimer le nombre de molécules antibiotiques par QD: la spectroscopie d&#39;absorption ou de fluorescence, électrophorèse sur gel, ou spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). </li></ol> Les résultats représentatifs. Dans cet exemple, la conjugaison PMB est caractérisée par des changements dans le spectre d&#39;émission QD. La figure 2 montre les spectres de BQs CdTe avec plus PMB. 3. Préparation de bactéries pour l&#39;écran de 96 puits; Détermination de la antibiotiques IC 50 Ceci est applicable à presque toute souche bactérienne cultivée dans le milieu approprié 18. La longueur exacte de temps les enregistrements devraient continuer dépend du taux de croissance bactérienne. Dans notre exemple, nous utilisons Escherichia coli cultivées dans un bouillon de lysogénie (LB). <ol><li> Afin de choisir les concentrations appropriées conjugués QD, il est important de connaître laIC 50 de l&#39;antibiotique à être conjugués et si les points quantiques à eux seuls sont toxiques. Cela devrait être commencé 2 jours avant l&#39;expérience de conjugaison. Dans la soirée, des semences de 10 mL de milieu de croissance bactérienne à partir d&#39;une colonie fraîche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité. </li><li> Le lendemain, 1-2 heures avant l&#39;expérience, de remplir chacun des puits d&#39;une claire-96 puits à fond plat avec une quantité presque-maximale de milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 ul de la culture bactérienne (la concentration dépendra de la rapidité de la souche particulière se développe et devra être calibré par votre laboratoire). </li><li> Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à une longueur d&#39;onde déterminée (généralement 600 nm). Surveiller la plaque de sorte que les bactéries ne se développent pas trop dense trop vite. </li><li> Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l&#39;enregistrement. </li><li> Ajouter médicament seul et seul à points quantiquesdes concentrations différentes dans au moins triple. Utilisation d&#39;un côté de la plaque en tant que &quot;noir&quot; contrôle et une moitié d&#39;être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 3. Les concentrations doivent couvrir un éventail suffisamment large pour inclure une concentration qui inhibe les bactéries très peu, et celui qui les tue tous. </li><li> Protégez le côté &quot;obscur&quot; de la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. Exposer l&#39;autre côté à une lampe à la longueur d&#39;onde désirée. Nous utilisons une coutume de 96 puits, 440-nm lampe fabriqué à partir de 2,4 mW LED (Figure 4) et irradient pendant 30-60 min. Les plaques noires avec des fonds clairs aider à protéger les bactéries non exposées de la lumière parasite. Une colonne vide peut également être utilisé entre les parties exposées et non-exposés. </li><li> Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l&#39;enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures selon le taux de croissance. Maintenir la température &lt;32 ° C si possible pour éviter le dessèchement des cultures. </li><li> Tracer des courbes de croissanceà un moment choisi en fonction de log [concentration] et de déterminer l&#39;IC 50 de l&#39;antibiotique en utilisant l&#39;équation de Hill: </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> où H est le coefficient de Hill, y max est le point culminant de la croissance (idéalement sur ​​un plateau), et y min est le point zéro, idéalement sur ​​un plateau. Il est peu probable que les points quantiques à eux seuls montrent une toxicité beaucoup à des cellules aux concentrations utilisées, de sorte qu&#39;une valeur ne sera pas déterminé. Des résultats représentatifs. À la fin de la période d&#39;enregistrement, les puits clairs indiquent la mort cellulaire complète, et un gradient de densité cellulaire doit apparaître le long des concentrations croissantes de la drogue. Les bactéries doivent montrer les courbes de croissance en forme de S (Figure 5); l&#39;emplacement du plateau maximum varie grandement d&#39;une souche à autre et dépend également de la température. Un point de temps donné peut êtrechoisi comme représentant et les valeurs représentées vs Connexion [antibiotiques] pour donner le IC 50 (figure 5 B). Pour évaluer la toxicité QD, la survie vs Connexion [QD] peut également être tracées, mais la réalisation significative bactéricide avec QDs seul est rare (figure 5 C). 4. Préparation de bactéries pour l&#39;écran de 96 puits avec des antibiotiques ou points quantiques <ol><li> La veille de l&#39;expérience, 10 ml de graines de la culture à partir d&#39;une colonie fraîche dans le milieu approprié riche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité. Le conjugué QD-antibiotique doit être préparé à ce jour, à moins qu&#39;il est très instable. </li><li> 1-2 heures avant l&#39;essai, remplir chacun des puits d&#39;une claire-bas plaque à 96 puits avec une quantité pratiquement-maximale d&#39;un milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 pl de culture bactérienne. </li><li> Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à la même longueur d&#39;onde dans la partie 3.</li><li> Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l&#39;enregistrement. </li><li> Ajouter conjugués QD à différentes concentrations dans au moins quatre exemplaires. Utilisation d&#39;un côté de la plaque en tant que &quot;noir&quot; contrôle et une moitié d&#39;être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 6. Une bande de contrôle de bactéries ne devraient toujours être inclus dans les problèmes de cas avec la culture, de la température, etc influer sur les conditions de croissance. Une seule bande de seul médicament et QD ne devrait également être inclus afin de s&#39;assurer qu&#39;elles correspondent à la plaque de contrôle fait précédemment. Le reste des puits sont consacrés à conjugués afin de permettre aux bonnes statistiques. </li><li> Protégez le côté &quot;obscur&quot; de la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. Exposer l&#39;autre côté à une lampe à la longueur d&#39;onde désirée. </li><li> Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l&#39;enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures. Maintenir la température &lt;32 ° C si possible pour éviter drying des cultures. </li></ol> Des résultats représentatifs. La combinaison de boîtes quantiques et d&#39;antibiotiques peut être moins toxique que le seul antibiotique; également toxique, ou plus toxique. Ceci peut être quantifié à l&#39;aide des courbes de croissance et IC 50 mesures. La figure 7 montre un exemple de conjugués qui tout aussi toxique que seuls antibiotiques, et un exemple de conjugués qui sont plus toxiques. 5. Numération sur plaque <ol><li> Choisissez un ou plusieurs puits de la zone traitée plaque de 96 puits qui seront utilisés pour des dilutions en série et le comptage de colonies. </li><li> Faire une dilution en série de chacun des échantillons sélectionnés bactériennes avec une solution de PBS ou de solution saline (NaCl 0,9%). Transférer 20 pl de la solution bactérienne et la diluer avec 180 ul de solution saline, changer la pointe de la pipette, mélanger et transférer 20 ul de solution bactérienne diluée à 180 ul de solution saline. Répétez 6 fois. </li><li> Prenez 10 uL de chaque dilution et la plaque à une échelle appropriée<html> solide plaque de support. Tous les 8 concentrations d&#39;un échantillon peut être étalées sur un 10 cm de Petri plat rond, bien plats rectangulaires sont préférés car il est plus facile d&#39;aligner les choses. </li><li> Laissez sécher sur le banc pendant 15 min. puis incuber à la température appropriée pour vos bactéries pendant 16 heures. </li><li> Compter les colonies et calculer des unités formant colonie (UFC) en fonction de (nombre de colonies x facteur de dilution) / volume plaqué = CFU / ml. </li></ol> La figure 8 montre une plaque UFC par exemple. 6. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figure 1. QDs CdTe. (A) Huit préparations de points quantiques de CdTe illuminé avec une baguette UV (365 nm). (B) des spectres d&#39;absorption et d&#39;émission de cinq tailles sélectionnées avant et après l&#39;eau-de solubilisation. Les lignes en pointillés sont des spectres dans le toluène, les lignes pleines sont dans l&#39;eau. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. L&#39;analyse spectrale et le gel des QD-PMB conjugués. QDs CdTe Orange-électroluminescentes ont été utilisés pour cet exemple, les effets sur d&#39;autres types de boîtes quantiques devront être évalués pour chaque expérience. (A) d&#39;absorbance typique (ligne grise) et les spectres d&#39;émission (ligne noire) des boîtes quantiques avant la conjugaison de PMB et l&#39;émission (ligne pointillée) après l&#39;addition de 160 équivalents molaires de PMB. (B) Relation entre le rapport de PMB et l&#39;intensité des émissions QD (carrés) et le pic de longueur d&#39;onde de localisation (triangles). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figure 3. Suggérée disposition de la plaque pour plaque de croissance de contrôle. Une large gamme de concentrations de PMB et QD est représenté. Une moitié de la plaque est irradiée (surlignée en bleu), et une moitié identique est protégé de la lumière. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici</a>pour agrandir la figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figure 4. Personnalisée 96-lampe LED pour l&#39;irradiation plaque uniforme, montrant l&#39;aspect hors et sous tension. Un type à main lampe UV peut également être utilisé, mais ne couvrira pas la totalité de la plaque uniformément. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figure 5. Exemples de résultats pour la plaque de croissance de contrôle. (A) représentant les courbes de croissance bactérienne avec différentes concentrations en médicament, de 0 à compléter la mort cellulaire. Les symboles ouverts sont PMB seulement avec des concentrations donnée, les symboles pleins sont CdTe-PMB sans irradiation, et les symboles sont remplis de demi-CdTe-PMB avec l&#39;irradiation. L&#39;irradiation n&#39;a eu aucun effet sur les échantillons PMB-seulement, de sorte que ces courbes ont été omis pour plus de clarté. Tous les conjugués PMB-CdTe sont 30:1 PMB: ratios QD. (B) Parcelles de valeurs de la courbe de croissance à 200 min vs Connexion [PMB] et s&#39;inscrit à l&#39;équation. (1). Pour control pour les effets de la lumière, une courbe se fait avec des antibiotiques seulement avec 30 min d&#39;exposition de la lumière. (C) la survie bactérienne à 200 min vs concentration QD, en utilisant les points quantiques de CdTe. Certains toxicité est observée avec exposition à la lumière, mais trop peu pour déterminer une valeur IC 50. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figure 6. Disposition suggérée pour plaque d&#39;essai conjugué. La moitié bleu en surbrillance de la plaque doit être exposée à la lumière, et la moitié unhighlighted est protégé. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figure 7. Exemple de résultats pour plaque d&#39;essai conjugué. Valeurs de la courbe de croissance à 200 min étaient plotted et en forme à l&#39;équation. (1). (A) CdTe-PMB conjugués présentent une augmentation de la toxicité sur PMB seul. (B) or nanoparticules Au-PMB conjugués ne montrent aucune augmentation de la toxicité sur PMB seul. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figure 8. Exemple d&#39;une plaque UFC. E. coli ensemencées dans une plaque de 96 puits a été traitée avec QD-PMB avec ou sans irradiation pendant 30 min. ensuite incubées à 32 ° C pendant 4 heures. Des dilutions en série de chaque échantillon bactérien ont été faites avec une solution saline, et 10 uL de 100 X 10 X 7 dilutions ont été étalées sur des plaques de gélose. Les plaques ont été incubées à 37 ° C et les colonies ont été comptées après 16 heures. La plaque montre les dilutions le long des lignes comme indiqué; les colonnes sont les suivants: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe irradiés, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiés, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irrairradiées.

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe/ZnS+quantum+dots+in+water:+A+procedure+guided+by+computational+studies.">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li><li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP/ZnS+core-shell+quantum+dots.">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les nanoparticules représentent une approche prometteuse pour la création de nouveaux agents anti-microbiens. Analyse de la courbe de croissance est un moyen de contrôler la densité des cellules bactériennes qui distingue les cellules activement croissantes de-croissance des cellules inhibées. Lorsque couplée avec un nombre de plaques, il permet une analyse approfondie du potentiel antibiotique d&#39;un conjugué. Le format de 96 puits permet des variations relativement à haut débit de concentration et d&#39;au...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Borate composant tampon n ° 1 </td><td> Pêcheur </td><td> L&#39;acide borique A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Borate composant tampon n ° 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B9876 tétraborate de sodium </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Divers MWCO disponibles </td></tr><tr><td> Flacons en verre </td><td> Pêcheur </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxine B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Gr bactérienneoissance milieu (LB) Composante n ° 1 </td><td> Pêcheur </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 2 </td><td> BD </td><td> Tryptone 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 3 </td><td> BD </td><td> 211929 Extrait de levure </td><td></td></tr><tr><td> Lampe pour exposition à la lumière </td><td> Coutume </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clear-fond plaques à 96 puits </td><td> Pêcheur </td><td> 07-200-567 ou 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Spectromètre à fluorescence </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque d&#39;absorbance </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BactoAgar pour les milieux solides </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri autour </td><td> Pêcheur </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri rectangulaires </td><td> Pêcheur </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilization and bio-conjugation of quantum dots and bacterial toxicity assays by growth curve and plate count

Boîtes quantiques (QDS) sont des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes dont la taille dépend de spectres d&#39;émission pouvant être excités par un choix large de longueurs d&#39;onde. QDs ont attiré beaucoup d&#39;intérêt pour l&#39;imagerie, le diagnostic et la thérapie en raison de leur brillante, la fluorescence stable 1,2 3,4,5. BQs peut être conjugué à une variété de molécules bio-actives pour se lier à des bactéries et des cellules mammaliennes 6. Les points quantiques sont également largement étudiée comme agents cytotoxiques pour assassinat ciblé des bactéries. L&#39;émergence de multiplier les souches bactériennes résistantes aux devient rapidement une crise de santé publique, en particulier dans le cas de germes à Gram négatif 7. En raison de l&#39;effet bien connu antimicrobienne de certains nanomatériaux, en particulier Ag, il ya des centaines d&#39;études portant sur ​​la toxicité des nanoparticules à des bactéries 8. Des études bactériennes ont été effectuées avec d&#39;autres types de nanoparticules semi-conductrices ainsi, spécially TiO 2 9,10-11, mais aussi de ZnO 12 et autres, y compris CuO 13. Quelques comparaisons de souches bactériennes ont été effectuées dans ces études, généralement comparant une souche à Gram négatif avec un Gram positif. Avec toutes ces particules, les mécanismes de toxicité sont attribués à l&#39;oxydation: soit l&#39;photogénération d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) par les particules ou le rejet direct d&#39;ions métalliques qui peuvent causer la toxicité oxydative. Même avec ces matériaux, les résultats des différentes études varient considérablement. Dans certaines études, la souche d&#39;essai à Gram positif est censément plus sensible que les 10 à Gram négatif, dans d&#39;autres c&#39;est le 14 en regard. Ces études ont été étudiées en 15. Dans toutes les études de nanoparticules, la composition des particules, la taille, la chimie de surface, l&#39;échantillon vieillissement / ventilation, et de longueur d&#39;onde, la puissance et la durée d&#39;exposition de lumière peuvent tous affecter les résultats de façon spectaculaire. En outre, SYNTHESIsous-produits s et les solvants doivent être considérées 16 17. Techniques de criblage à haut débit sont nécessaires pour être en mesure de développer des agents efficaces de la nanomédecine nouvelles. QDs CdTe ont effets anti-microbiens seuls 18 ou en combinaison avec des antibiotiques. Dans une étude précédente, nous avons montré que le couplage d&#39;antibiotiques pour CdTe peut augmenter la toxicité pour les bactéries, mais de diminuer la toxicité pour les cellules de mammifères, en raison de la production a diminué d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène à partir des conjugués 19. Bien qu&#39;il soit peu probable que le cadmium composés contenant sera approuvé pour utilisation chez les humains, ces préparations peuvent être utilisées pour la désinfection des surfaces ou la stérilisation de l&#39;eau. Dans ce protocole, nous donnons une approche simple pour solubiliser les points quantiques de CdTe avec de l&#39;acide mercaptopropionique (MPA). Les points quantiques sont prêts à utiliser moins d&#39;une heure. Nous démontrons ensuite le couplage à un agent antimicrobien. La deuxième partie du protocoledémontre un test d&#39;inhibition de 96 puits en utilisant des bactéries les boîtes quantiques conjugués et non conjugués. La densité optique est lue pendant plusieurs heures, permettant aux effets de l&#39;ajout QD et exposition à la lumière d&#39;être évalués immédiatement ainsi que, après une période de récupération. Nous présentons aussi un comptage des colonies pour quantifier la survie des bactéries.

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Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Les nanoparticules telles que les points quantiques à semi-conducteurs (QDS) peut être utilisé pour créer des agents photo-activables pour les applications anti-microbiens ou anti-cancer. Cette technique montre comment l&#39;eau solubiliser en tellurure de cadmium (CdTe) QDs, les conjuguer à un antibiotique, et d&#39;effectuer un test d&#39;inhibition bactérienne basée sur les courbes de croissance et numération sur plaque.

Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K vues.  McGill University, Montreal, QC Canada. Les nanoparticules telles que les points quantiques à semi-conducteurs (QDS) peut être utilisé pour créer des agents photo-activables pour les applications anti-microbiens ou anti-cancer. Cette technique montre comment l'eau solubiliser en tellurure de cadmium (CdTe) QDs, les conjuguer à un antibiotique, et d'effectuer un test d'inhibition bactérienne basée sur les courbes de croissance et numération sur plaque.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Croissance stretch Axon: La mécanotransduction de croissance neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Recherche

Bio-ingénierie

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG amplificateur régénérateur à disque mince

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Un système combiné de micro-dispositifs pour favoriser et surveiller la croissance des coraux

An Integrated Micro-Device System for Coral Growth and Monitoring

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of the coral culture environment is highly in demand for coral conservation and study. Here, we developed a semi-closed coral culture micro-device system as a multi-functional platform, which can provide accurate and programmable temperature control, a sterile initial environment, long-term stable water quality, an adjustable dissolved oxygen concentration, and a customized light spectrum for corals. Owing to the modular design, the coral culture system can be upgraded or modified by installing desirable new modules or removing existing ones. Currently, under appropriate conditions and with proper system maintenance, the sample corals can survive for at least 30 days in a healthy state. Furthermore, due to the controllable and sterile initial environment, this coral culture system can support research into the symbiotic relationship between corals and associated microorganisms. Therefore, this micro-device system can be applied to monitor and investigate sea corals in a relatively quantitative manner.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la culture des coraux - Créer un système de microenvironnement semi-contrôlé quantitativement pour contrer les limites actuelles 

This protocol describes the development of a modular controllable micro-device system that can be applied for the long-term culturing and monitoring of sea corals.

Un système de micro-dispositifs intégré pour la croissance et la surveillance des coraux

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of ...