Les auteurs tiennent à remercier les familles des donneurs et des d&#39;approvisionnement en organes impliqués dans cette recherche et Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, Agarwal et Roshan pour leur aide d&#39;experts. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) à l&#39;appui du Réseau des donneurs d&#39;organes atteints de diabète pancréatique.

1. Microtomie pour les sections non colorées <ol><li> Mettre en place bain d&#39;eau et microtome que pour microtomie paraffine standard. Utilisez des lames chargées positivement et pré-étiquette avec le numéro de dossier, la région du pancréas (l&#39;échantillon) et le numéro de diapositive. Bloc de paraffine place dans le mandrin microtome avec l&#39;étiquette de cassette sur le côté gauche. </li><li> Suivre les procédures normales, Microtomie section dans le bloc jusqu&#39;à ce que le tissu est uniformément rencontrés. Produire un ruban de coupes sériées (4 m d&#39;épaisseur, 3-6 selon le nombre de taches initiales requises (voir formulaire de soumission de cas, l&#39;annexe 1)). Des sections distinctes dans le ruban, ramasser chacun dans l&#39;ordre, et le lieu sur des lames à l&#39;ordre numéroté au crayon. Notons si une section est utilisé par la numérotation des sections dans l&#39;ordre exact. Maintenir la même orientation sur la diapositive que l&#39;on trouve dans la cassette avec le label diapositive orienté vers la gauche. Sécher toute la nuit à température ambiante puis procéder à la coloration ou la distribution aux enquêteurs. </li><li> Ressurface eal de bloc de paraffine d&#39;une fine couche de paraffine à préserver les tissus et d&#39;archivage à la température ambiante ou à -20 ° C. </li><li> Pour microtomie ultérieure, de maintenir de numérotation pour les coupes en série à chaque niveau comme ci-dessus. Obtenez 1 chariot supplémentaire et tacher par diapositive H &amp; E pour chaque niveau de ~ 100 pM au sein de chaque bloc. </li></ol> 2. H &amp; E coloration <ol><li> Placer le premier coulisseau série une coupe de chaque bloc dans une grille coulissante puis dans le premier plateau sur la coloration automatique. </li><li> Sélectionnez la norme H &amp; E du programme tache et procéder comme d&#39;habitude. </li><li> Lorsque vous avez terminé la coloration, retirez les lames de coloration automatique et le lieu dans la hotte pour lamelles. </li><li> Lamelle en utilisant la technique standard. Séchez soigneusement et l&#39;étiquette avec une étiquette imprimée (voir section 12). </li></ol> 3. IHC Set-up <ol><li> Sélectionnez le programme de Dako pour les taches et les numéros doubles d&#39;entrée de diapositives. Préparation des tampons TBST et le citrate, des anticorps, et d&#39;autres Reagents en fonction des volumes spécifiés (tableau 1). Chargez le plateau des réactifs et des diapositives. Rotation des lignes propres et des déchets sont programmés selon les recommandations du fabricant. </li><li> Si l&#39;exécution de ces tests manuellement, préparer les volumes estimés. Incuber les lames dans une chambre humide pour éviter le dessèchement des diapositives à n&#39;importe quelle étape. Suivez la même procédure pour chaque réactifs que lorsqu&#39;il est utilisé pour la coloration automatique. </li></ol> 4. Déparaffinage IHC et de restauration des antigènes <ol><li> Mettre les lames dans le xylène pendant 5 minutes. Répéter une fois. Ne pas laisser les lames sécher à tout moment ultérieur jusqu&#39;à ce que a indiqué que cela se traduira par de fond excessif et coloration pauvres. </li><li> Transfert diapositives à l&#39;éthanol à 100% pendant 2 minutes. Répéter une fois. </li><li> Mettre les lames dans fraîchement préparée 3% H 2 O 2 dans le méthanol pendant 10 minutes. </li><li> Tremper les lames dans l&#39;éthanol 90% puis placez-le dans l&#39;éthanol 90% pendant 3 minutes. </li><li> Transfert de glisseL&#39;éthanol à 70% pendant 1 minute. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Préchauffer le paquebot et un tampon de citrate dans une marguerite pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter des diapositives avec du citrate de mémoire tampon dans le bateau à vapeur et de la vapeur pendant 30 minutes. </li><li> Immédiatement le transfert des diapositives à l&#39;eau et tenir jusqu&#39;à glisse refroidir à température ambiante (~ 20 minutes). </li><li> Transfert diapositives à des racks Dako Autostainer selon la tache séquence (Figure 1) et exécutez le programme double coloration. Les principales étapes du programme Autostainer sont répertoriés afin que les points fixes manuelles pouvez dupliquer. </li></ol> 5. Premières Anticorps primaires (Ki-67, CD3, le polypeptide pancréatique) <ol><li> Bloc glisse avec une solution Sniper pendant 15 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Incuber les lames dans l&#39;anticorps primaire pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Incuber avec Mach2 chèvre anti-souris (Ki-67) ou anti-lapin (CD3, le polypeptide pancréatique) cheval peroxydase de raifort (HRP) polymère pour 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Appliquer 3,3-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (DAB) à des diapositives pendant 4 minutes. Laver deux fois avec de l&#39;eau. </li><li> Lames incubées avec le polypeptide pancréatique sont maintenus sur le Dako lorsque étant dosée et en même temps TBST utilisé pour tous les étapes suivantes pendant que les lames restantes sont incubées avec le second ensemble d&#39;anticorps primaires. Sinon, pour les dosages manuels, passez à la section 6. </li></ol> 6. Deuxièmement Anticorps primaires (insuline, glucagon) <ol><li> Incuber les lames dans DEEB pendant 20 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Bloquer avec du sérum de chèvre normal à 10% en bloquant l&#39;avidine 20% dans TBST (insuline) ou Sniper (glucagon) dans TBST pendant 20 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Incuber avec de l&#39;insuline ou de l&#39;anticorps primaire glucagon pendant 15 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Insuline: Incuber les lames dans de chèvre anti-Guinée porc biotinylé à 1:300 de dilution pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. Incuber avec ve normector ABC-AP réactif pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Glucagon: Incuber les lames dans un tampon pendant 30 minutes, suivie par de chèvre anti-souris phosphatase alcaline (AP) polymère pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. </li><li> Tandis lames sont incubées dans des conjugués, chauffer le tampon LPR à la température ambiante. Ajouter 1 goutte de rouge permanente de liquide (LPR) par 3 ml de tampon immédiate avant l&#39;utilisation et le lieu dans le rack réactif Dako. Incuber les lames dans LPC pendant 4 minutes. Laver deux fois avec de l&#39;eau. </li><li> Incuber les lames dans l&#39;hématoxyline pendant 1 minute. Rincer deux fois avec de l&#39;eau. </li><li> Incuber les lames dans du TBS pH 7,6 pendant 1 minute. Rincer deux fois avec de l&#39;eau. </li><li> Décharger les lames de DAKO Autostainer. </li><li> Immédiatement Déshydrater les lames colorées pour le polypeptide pancréatique. Pour toutes les diapositives doubles colorées, sec pendant au moins 1 heure, puis déshydrater. </li></ol> 7. La déshydratation <ol><li> Lieu glisse dans l&#39;éthanol 80% pendant 1 minute. </li><li> Plonger les lames dans l&#39;éthanol à 95%. </li&gt; <li> Maintenez les lames dans l&#39;éthanol à 95% pendant 30 secondes. </li><li> Transfert diapositives à l&#39;éthanol 100% et maintenez 1 minute. Répéter. </li><li> Tremper les lames dans du xylène. </li><li> Tenez diapositives dans le xylène pendant 1 minute. Répéter. </li><li> Immédiatement monter des lamelles sur des lames en utilisant cytoseal. </li></ol> 8. Étiquetage diapositives <ol><li> Entrez les informations d&#39;identification cas y compris le nombre d&#39;organes et de bloc, de la teinture, la date et l&#39;impression. Numéro de la section de série est facultative pour les taches première diapositive de chaque bloc. Les niveaux suivants sont désignés par numérotation. </li><li> Placez les étiquettes sur les diapositives. </li></ol> 9. Numérisation diapositives <ol><li> Placez les lames colorées dans le bac du scanner et de numériser en fonction de l&#39;instrumentation. </li><li> Organisez vos diapositives par type donneur et les tissus (tête du pancréas, du corps, la queue, de la rate). </li><li> Diapositives Archives colorées à la température ambiante et toutes les diapositives restantes non colorées à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 10. RepreseRésultats ntative Ces procédures de coloration ont été développés pour le réseau de la FRDJ de donneurs d&#39;organes pancréatiques avec diabète (nPOD) pour fournir la caractérisation de base de paraffine et de frais blocs congelés. Chaque donateur a une caractérisation de base réalisée composé de coloration 2 blocs de chaque région du pancréas (tête, corps, et la queue) et de la rate (Figure 1, voir aussi formulaire de soumission cas, Annexe 1). La coloration H &amp; E est effectuée en utilisant un Autostainer programmé que pour une installation clinique de qualité clinique solutions utilisées tout au long. Comme blocs donneurs supplémentaires sont sectionnés, chacun a une diapositive prise pour H &amp; E pour montrer la morphologie des tissus. Lorsque les blocs sont sectionnés à nouveau, comme pour la distribution aux enquêteurs, des niveaux plus profonds devront également des diapositives prises pour le représentant de H &amp; E diapositives afin de documenter la morphologie des tissus tout le bloc, ainsi que la numérotation des coupes sériées à chaque niveau. Lames colorées sont étiquetés avecl&#39;identification des cas, la région du pancréas, le numéro de bloc, tache et la date (figure 2) et numérisés dans le système en ligne d&#39;information de gestion pathologie. Des images représentatives provenant d&#39;un donneur de contrôle sont présentés dans la figure 3, à deux grossissements haute et basse pour montrer les résultats escomptés à la suite de cette procédure. Les vitraux diapositive avec le polypeptide pancréatique (D, H) a été testée sur un autre jour avec le test effectué manuellement et montre réduit l&#39;intensité de la coloration de la contre-coloration hématoxyline. Les différences dans l&#39;intensité de la coloration des anticorps primaires ou du contre entre les dosages doit être évitée, en particulier si vous utilisez l&#39;analyse d&#39;image glisse autrement exiger la correction des couleurs individuel pour atteindre les zones de cellules mêmes chefs d&#39;accusation. Chaque laboratoire doit s&#39;attendre à optimiser les concentrations d&#39;anticorps comme étant le lot à lot de variation et d&#39;autres réactifs et les conditions peuvent avoir une incidence intensité de la coloration et la spécificité. Avec l&#39;acquisition de nouvelles raisonsmessieurs, les procédures de coloration sont validés avec des échantillons connus de contrôle positifs et négatifs pour atteindre le même degré d&#39;intensité tache comme réactifs anciens. Anticorps supplémentaires optimisées dans le noyau nPOD pathologie sont fournis dans le tableau 2 comme source de référence et ont été utilisés pour multilabeling immunofluorescence pour la microscopie confocale. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Grille de coloration Dako. Ce schéma représente une analyse de routine à partir d&#39;un pancréas de donneur nPOD effectuée sur un Dako Autostainer. Les bailleurs de fonds nPOD sont codés avec un numéro d&#39;identification à 4 chiffres. Deux plateaux coulissants sont présentés avec des diapositives organisées par tache. Configurations de diapositives Autres sont attendus en fonction du nombre de diapositives donateurs. Les contrôles positifs, notamment l&#39;intégration d&#39;un donneur connu positif pour les deux taches doubles et de la rate des donateurs pour le Ki-67 et CD3. Les contrôles négatifs sont doubles et comprennent deux slides d&#39;un bloc de pancréas de donneur incubées avec de l&#39;immunoglobuline (Ig) de l&#39;espèce hôte des anticorps primaires et deux diapositives à partir de la rate des donateurs pour l&#39;insuline et le glucagon. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Représentant double glissière teinté. Une diapositive fini typique est montré avec des paramètres en matière d&#39;étiquetage des diapositives et de placement des tissus avant la numérisation numérique est effectuée. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Représentant H &amp; E et les taches IHC dans les sections du pancréas. Les articles du pancréas d&#39;un donneur d&#39;organe femelle adulte (6096-04 Panhead) étaient tachés et analyses numériques effectuées telles que décrites dans le protocole. Les images ont été obtenues en utilisant le programme ImageScope la visualisation de toute la section (AD) et d&#39;un îlot (EH). Les intensités des îlots attendus détachants pour l&#39;insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique sontobservée pour les sections BD comme délimite D section que ce bloc de tête du pancréas contient une petite portion de la région unciforme ou lobe pancréatique ventrale que tous les îlots pancréatiques contiennent principalement polypeptide cellules positives. Notez que la contre-coloration hématoxyline dans le panneau D est trop léger alors que le hématoxyline recolorer intensités dans B et C sont optimales. Panneaux EH montrer un îlot du lobe dorsal avec la distribution attendue des cellules ß et α-cellules. A quelques cellules pancréatiques polypeptidiques se trouvent dans la partie inférieure gauche de l&#39;îlot (H). A, E-H &amp; E, B, F-Ki67 + insuline; C, G-CD3 + Glucagon; D, H-polypeptide pancréatique. AD, 0.2x, EH-12.8x.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Normalisation des procédures IHC est critique pour l&#39;analyse d&#39;image, en particulier lors de l&#39;utilisation des algorithmes informatiques, à travers un grand nombre de diapositives au fil du temps. La procédure de coloration IHC décrit dans le présent rapport permettront d&#39;analyser des échantillons de lots d&#39;un donateur donné de l&#39;aide d&#39;un Autostainer au sein d&#39;une journée de travail de 8 heures et sont modifiées à partir d&#39;un précédent rapport 5. Images numéri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène 30% (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Peroxydase endogène de blocage </td></tr><tr><td> ABC-phosphatase alcaline (AP) </td><td> Vecteur </td><td> AK-5000 </td><td> AP conjugué </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> L&#39;anticorps primaire </td></tr><tr><td> Avidine bloquant </td><td> Vecteur </td><td> SP-2001 </td><td> Bloquer la biotine endogène </td></tr><tr><td> Biotinylé de chèvre anti-Guinée cochon </td><td> Vecteur </td><td> BA-7000 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> Réactif bleuissant </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Tampon citrate, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> De restauration des antigènes </td></tr><tr><td> Clarificateur 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Lamelle milieu de montage </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vecteur </td><td> SK-4100 </td><td> HRP chromogène </td></tr><tr><td> DEEB </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> Endogène AP réactif de blocage </td></tr><tr><td> Éosine alcoolique Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Éthanols-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Divers </td><td> Déparaffinage et de lamelles de protection </td></tr><tr><td> Hématoxyline </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Hématoxyline 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (toutes les espèces d&#39;accueil pour les anticorps primaires) </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td> Les contrôles négatifs pour les primaires </td></tr><tr><td> Liquid Permanent Red (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP chromogène </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare médicale </td><td> MALP521L </td><td> Chèvre anti-souris conjugué AP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare médicale </td><td> MHRP520L </td><td> Chèvre anti-souris conjugué HRP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare médicale </td><td> RHRP520L </td><td> Chèvre anti-souris conjugué HRP </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> FisherScientific </td><td> Divers </td><td> H 2 O 2 diluant </td></tr><tr><td> Du sérum de chèvre normal </td><td> Vecteur </td><td> S-1000 </td><td> IHC réactif de blocage </td></tr><tr><td> Tireur isolé </td><td> Biocare médicale </td><td> BS966M </td><td> IHC réactif de blocage </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC tampon </td></tr><tr><td> Trilogie 20x </td><td> Marque cellulaire </td><td> 920P-06 </td><td> Récupération d&#39;antigène </td></tr><tr><td> Xylène </td><td> FisherScientific </td><td> Divers </td><td> Déparaffinage et de lamelles de protection </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps primaire </td><td> Espèces hôtes </td><td> Vendeur </td><td> Cat. # </td><td> Commentaires et récupération d&#39;antigène </td></tr><tr><td> Paraffine </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amylase </td><td> Souris </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46657 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> Souris </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> L&#39;anhydrase carbonique 19,9 </td><td> Souris </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, clivé </td><td> Lapin </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 9961 </td><td> Citrate ou Trilogie </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> Citrate ou Trilogie </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Lapin </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Souris </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 3569 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> Citrate </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Chromogranine A </td><td> Lapin </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> C-peptide </td><td> Lapin </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 4593 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> Rat </td><td> e Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citrate </td></tr><tr><td> La ghréline </td><td> Chèvre </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> La ghréline </td><td> Lapin </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Lapin </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Souris </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Guinée Pig </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Glut-1 </td><td> Souris </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Glut-2 </td><td> Lapin </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> Pas exprimé dans les îlots humains </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Guinée Pig </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> Lapin </td><td> Novus biologique </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Polypeptide pancréatique </td><td> Lapin </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Guinée Pig </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citrate ou Trilogie </td></tr><tr><td> Proinsuline </td><td> Souris </td><td> Novocastra </td><td> NCL-PROIN-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsuline </td><td> Souris </td><td> Developmental Studies Hybridoma Banque </td><td> GS-9A8 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Lapin </td><td> Sigma </td><td> HPA 006641 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> L&#39;actine musculaire lisse </td><td> Lapin </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> La somatostatine </td><td> Lapin </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> Citrate </td></tr><tr><td> Frais congelé </td><td> Espèces hôtes </td><td> Vendeur </td><td> Cat. # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Rat </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Fixer avec PF 4% </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Lapin </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Souris </td><td> Novus biologique </td><td> NB 600-564 </td><td> Utilisez une nuit d&#39;incubation pour les coupes en paraffine </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Souris </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Fixer avec de l&#39;acétone </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Souris </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130569 </td><td> Fixer avec PF 4% </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Souris </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> Fixer avec de l&#39;acétone ou PF 4% </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Anticorps primaires. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Aperio ScanScope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Scanner de diapositives numérique </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer Plus </td><td> DAKO </td><td></td><td> Taches IHC </td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;impression d&#39;étiquettes Matrice </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Logiciel de étiquette de la diapositive </td></tr><tr><td> Leica Autostainer XL </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E taches </td></tr><tr><td> Prime lamelle couvre-objet </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Lamelle </td></tr><tr><td> Gestionnaire de l&#39;information du spectre </td><td> Aperio </td><td></td><td> Logiciel du scanner </td></tr><tr><td> Superfrost Plus glisse </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Des lames chargées positivement </td></tr><tr><td> Vapeur de légumes </td><td> Black &amp; Decker </td><td> Divers </td><td> De restauration des antigènes </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Imprimante d&#39;étiquettes Diapositive </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Fournitures et équipements spécifiques.

staining protocols for human pancreatic islets

Estimations de la superficie des îlots et les numéros et la composition des cellules endocrines dans le pancréas humain adulte varie de plusieurs centaines de milliers à plusieurs millions de gammes de masse et bêta à partir de 500 à 1500 1-3 mg. Avec cette hétérogénéité connue, un traitement standard et procédure de coloration a été développé afin que les régions du pancréas ont été clairement définis et îlots caractérisés par l&#39;histopathologie et rigoureuse des examens immunolocalisation. Des procédures normalisées pour le traitement de pancréas humain récupéré à partir de donneurs d&#39;organes sont décrites dans la partie 1 de cette série. Le pancréas est transformé en 3 grandes régions (tête, corps, queue), suivis par les sections transversales. Des coupes transversales de la tête du pancréas sont encore divisés, comme indiqué sur la base de la taille, et numérotées par ordre alphabétique pour désigner paragraphes. Cette standardisation permet une analyse complète de la section transversale de la région de la tête, y compris la région unciforme qui contient des îlots composésprincipalement de cellules pancréatiques polypeptidiques à la région de la queue. Le présent rapport comprend une partie 2 de cette série et décrit les procédures utilisées pour les coupes sériées et la caractérisation histopathologique des coupes en paraffine pancréatiques en mettant l&#39;accent sur les cellules endocrines des îlots de Langerhans, la réplication et de cellules T des infiltrats. Pathologie des sections du pancréas est destiné à caractériser à la fois exocrine, ductulaire, et composants du système endocrinien. Le compartiment exocrine est évalué pour détecter la présence de la pancréatite (actif ou chronique), l&#39;atrophie, la fibrose, et la graisse, ainsi que le système de conduits, en particulier en relation avec la présence d&#39;une néoplasie pancréatique intracanalaire 4. Les îlots sont évalués pour la morphologie, la taille et la densité, les cellules endocrines, l&#39;inflammation, la fibrose, l&#39;amyloïde, et la présence de cellules en réplication ou apoptotiques en utilisant H &amp; E et les taches IHC. Le dernier élément décrit dans la partie 2 est la disposition de la lame colorées comme images numérisées de diapositives entières. Les diapositives numérisées sont organisées au cas par cas et dans la région du pancréas dans une base de données en ligne la création d&#39;une pathologie virtuelle biobanque. L&#39;accès à cette collection en ligne est actuellement fourni à plus de 200 cliniciens et les scientifiques impliqués dans la recherche du diabète de type 1. La base de données en ligne fournit un moyen de partage des données rapide et complète et pour les enquêteurs de sélectionner des blocs de paraffine ou congelés pour des coupes sériées.

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) et l&#39;immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H &amp; E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des infiltrats inflammatoires (H &amp; E, CD3). La région est localisée à l&#39;aide unciforme IHC pour le polypeptide pancréatique.

Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

26.7K vues.  University of Florida. Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l'hématoxyline et l'éosine (H & E) et l'immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H & E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des i...

Vidéo: Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

L&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Recherche

Médecine

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur la paraffine Diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Interventions chirurgicales pour un modèle de rat de transplantation hépatique orthotopique partielle avec reconstruction artérielle hépatique

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...