Ce travail a été soutenu ya CIRM bourse pré-doctorale (CDIP), le Prix du jeune chercheur NARSAD (DK) et le prix NIMH CERVEAUX (R01MH087495) (NSP).

Anesthésie et l&#39;analgésie: Trente minutes avant l&#39;anesthésie, injecter le rat avec 0,05 mg de buprénorphine / kg sous-cutanée pour l&#39;analgésie. Initier une anesthésie avec 30-40 mg / kg par voie intrapéritonéale de sodium pentobarbital. À ce stade, aussi injecter de l&#39;atropine pour éviter une insuffisance respiratoire (0,4 mg / kg, sous-cutanée) et le méloxicam comme analgésique supplémentaire (2 mg / kg sous-cutanée). Si après 5 minutes, le rat est encore mobile ou sensible à pincement de l&#39;orteil, administrer les doses suivantes de pentobarbital de sodium à 5 mg / kg (par voie intrapéritonéale) jusqu&#39;à ce que le rat ne répond pas à la douleur. Avant d&#39;effectuer la première incision, injecter de lidocaïne (5 mg / kg, par voie intradermique) à l&#39;endroit de l&#39;incision pour l&#39;anesthésie locale. Six à huit heures après l&#39;injection initiale, injecter le rat avec 0,05 mg de buprénorphine / kg sous-cutanée pour l&#39;analgésie. La buprénorphine peut être injecté tous les 6-8 heures qui suivent, si nécessaire, si ce n&#39;est généralement pas nécessaire. Il est important de noter que d&#39;autres formes de c l&#39;anesthésieune interférer avec lésions excitotoxiques. Par exemple, bien que la kétamine est une forme couramment utilisé de l&#39;anesthésie chez les rongeurs, il peut interférer avec des lésions induites par le NMDA, car il est un antagoniste du récepteur NMDA. Il est important de choisir une méthode d&#39;induction de l&#39;anesthésie qui ne réduit pas la taille des lésions. Si l&#39;anesthésie au gaz est souhaitée, la plupart des appareils stéréotaxiques, y compris celles qui sont décrites ici peuvent accueillir des adaptateurs de masques à gaz. Remarque: Les matériaux sont décrits plus loin dans le tableau des réactifs spécifiques et des équipements ci-dessous. 1. Préparation de la pompe et Stereotax <ol><li> Remplissez un seringue de 10 ul Hamilton à l&#39;eau stérile et le monter dans le chariot d&#39;une pompe 6 seringue programmable. Fixer l&#39;extrémité du piston de seringue dans le support fixé à la pompe. </li><li> Prefill gaz stérilisée PE20 tube avec de l&#39;eau stérile à l&#39;aide d&#39;une aiguille et seringue de 1 ml. Coulisser l&#39;extrémité ouverte du tube à la seringue Hamilton, étant soinsutile pour éviter de créer des bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Serrer le Calibre 30, plate-coupe, une extrémité de pouce aiguille de perfusion de la tubulure sur le bras d&#39;un dispositif stéréotaxique utilisant un manipulateur d&#39;électrode barillet de style. Insérer l&#39;aiguille de perfusion entre le collier et le canon rainurée. Fixer la pince sur une pièce de la tubulure aiguille métallique contenant en son sein afin d&#39;éviter l&#39;aplatissement du tube et en limitant l&#39;écoulement de fluide. </li><li> Réglez le débit de la pompe à&gt; 5 pi / min et tourner sur la pompe. Un cordon de l&#39;eau doit apparaître à la pointe de l&#39;aiguille de perfusion. Vérifiez la longueur de la tubulure et de ses articulations pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites. </li><li> Essuyez l&#39;eau perle avec un écouvillon stérile et régler la pompe à se retirer. Retirer une bulle d&#39;air 2 pl. Le sommet de la bulle devrait être visible dans le tube. </li><li> Immerger la pointe de l&#39;aiguille de perfusion dans une solution à 20 mg / ml de NMDA dans stérile 0,1 M PBS et retirer ul 4-5. Une bulle d&#39;air ne devrait être visible entre l&#39;eau stérile et la solution NMDAdans la pointe. Il est important de noter que NMDA est une puissante neurotoxine et la prudence doit être utilisé dans la préparation et la manipulation de cette solution. Gants et lunettes de protection est conseillé à tout moment. </li></ol> 2. Montez le Rat dans l&#39;appareil stéréotaxique <ol><li> La figure 1 illustre les éléments de base de l&#39;appareil de stéréotaxie. Après le rasage de tête du rat à partir de la ligne des yeux aux oreilles, de charger les dents de devant du rat sur la barre de morsure, avec le corps du rat reposant sur un coussin chauffant à feu moyen. La langue doit pendre en dessous de la barre de morsure, avec la mâchoire inférieure. Si disponible, un coussin chauffant la température retour serait préférable. Surveillance de la température rectale serait également idéal. </li><li> Tenir le cou du rat avec le pouce et l&#39;index, déplacez le canal de l&#39;oreille droite sur la barre horizontale oreille droite. La barre devrait se sentir comme elle est posée sur une place solide, pas comme il s&#39;enfonce loin dans la tête. En tenant le côté droit de la tête droite, faites glisser à l&#39;oreille gauchebarre dans la gauche du rat canal horizontal. Il devrait se sentir comme elle est posée sur une place solide. Les pennes devrait ressembler symétrique et devrait apparaître à plat sur les barres d&#39;oreilles. La hausse du torchage de pennes indique un mauvais positionnement des barres d&#39;oreilles. La tête ne doit pas vaciller en réponse à la pression au niveau du cou. </li><li> Visser la barre le nez. Soyez doux. Les os dans le nez est délicat et la barre de nez n&#39;a pas besoin d&#39;être serré. Vérifiez que le rat est encore anesthésié avant de procéder. </li></ol> 3. Préparation du Rat pour la chirurgie <ol><li> Avec un écouvillon stérile, placez doucement une petite quantité de pommade ophtalmique lubrifiante vétérinaire dans chacun des yeux du rat pour les protéger du dessèchement et de débris. </li><li> Concentrique à partir du site d&#39;incision planifiée à l&#39;arête de la région rasé, essuyer le cuir chevelu du rat avec une solution de chlorhexidine 2% à 70% d&#39;éthanol suivie trois fois. Gommage chlorhexidine peut également être utilisé si désinfectant plus efficace est souhaitée.Terminer en essuyant avec une solution de povidone iodée à 10%. Le cuir chevelu est maintenant préparé stérile et ne doit être touché avec des matériaux stériles. </li><li> Enfiler des gants stériles pour des mesures supplémentaires parce que vous allez faire face à la prochaine sur le site préparé chirurgicale. </li><li> Placez un champ stérile de sorte que la fenestration expose le site chirurgical. </li></ol> 4. Création de la fenêtre chirurgicale <ol><li> Utilisation d&#39;une lame de scalpel # 10, faire une incision (environ 2 cm de longueur) le long de la ligne médiane longitudinale du cuir chevelu. L&#39;incision doit commencer postérieure à la ligne des yeux. Avec le pouce et l&#39;index de la main non-dominante, maintenir le cuir chevelu dans traction perpendiculaire à la direction de l&#39;incision. </li><li> Tirez sur le fascia recouvrant la surface du crâne sur les bords du site chirurgical à l&#39;aide de coton stériles conseils. Il faudra une certaine force pour effacer le crâne afin qu&#39;il puisse être vu. </li><li> Utilisez les quatre courbes, hémostatiques stériles pour créer une fenêtre chirurgicale. Fascia Clamp (PAS la peau) sur l&#39;évaluation environnementaleCH côté des faces antérieure et postérieure de l&#39;incision et ensuite fixer les colliers aux côtés de l&#39;animal, tirant ainsi l&#39;incision ouverte et complètement exposer le crâne. </li></ol> 5. Mise à niveau du crâne et Création le trou <ol><li> Localisez bregma, le point antérieur, où les trois principales plaques du crâne de répondre, comme le montre la figure 2. Déplacer l&#39;aiguille de perfusion de sorte que la pointe de l&#39;aiguille touche juste le crâne au bregma. Notez le dorso-ventral de coordonnées. Figure 3 montre comment lire les coordonnées sur un dispositif Stoelting stéréotaxique. Remarque, à ce stade, des gants ne sont plus stériles et ne doit pas toucher le site de la chirurgie stérile directement. Remarque: Après avoir touché l&#39;appareil stéréotaxique non stérile, le chirurgien n&#39;est plus stérile et ne doit pas toucher le site opératoire, ni les pièces d&#39;équipement qui va toucher le site opératoire. </li><li> Localisez lambda, la pointe postérieure, où les trois principales plaques du crâne de répondre, comme depicted sur la figure 2. Soulevez légèrement l&#39;aiguille de perfusion et de le déplacer vers l&#39;arrière à la lambda. Abaissez l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche le crâne à lambda. Lire la coordonnée dorso-ventral. Si le crâne est de niveau, il sera à moins de 0,1 mm de la lecture bregma. Si elle est plus loin que cela, déplacer l&#39;aiguille vers le haut (hors de la voie), desserrer la barre nez, augmenter ou d&#39;abaisser la plate-forme barre de morsure, selon le extrémité de la tête est trop élevé, et puis re-mesure. </li><li> Déplacer l&#39;aiguille de perfusion au cours bregma et enregistrer les coordonnées antéro-postérieur et médio-latérale. Calculer où l&#39;aiguille doit être déplacé sur la base de coordonnées de la région du cerveau d&#39;intérêt selon un cerveau atlas 12. Pour la BLA, soustraire 2,8 mm de la coordonnée antéro-postérieure et soit ajouter ou de soustraire 5,1 mm vers / à partir de la coordonnée médio-latérale en fonction de si vous souhaitez cibler la gauche ou la droite. Déplacer l&#39;aiguille de perfusion à la position calculée. </li><li> Balancez le necDLE de la route, en prenant soin de garder une trace de l&#39;endroit où il a été établi et, ensuite percer un trou d&#39;environ 2 mm de diamètre à cet endroit en utilisant un outil de Dremel moto-avec une mèche dentaire stérile attaché. Percer soigneusement que lorsque le foret perce le crâne, il aura tendance à tirer vers le bas, qui risque d&#39;endommager la dure-mère et le tissu cérébral en dessous. Equarrissez le trou pour l&#39;agrandir. </li><li> Absorber le sang avec un coton-tige stérile. </li></ol> 6. La perfusion de neurotoxine <ol><li> Balancez le dos aiguille dans la position. Abaisser l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la surface du cerveau. Notez les coordonnées dorso-ventral. Il s&#39;agit du niveau de la dure-mère. Soustraire la valeur appropriée pour atteindre la région du cerveau d&#39;intérêt. Pour l&#39;amygdale basolatérale, soustraire 6,7 mm. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille de perfusion pour le niveau calculé lentement. Puis le soulever back up, bien au-dessus du crâne. Utilisez un fil Hamilton nettoyage seringue pour débloquer la pointe de l&#39;aiguille de perfusion, en faisant attention de ne pas touch l&#39;extrémité du fil qui vient en contact avec l&#39;aiguille de perfusion non stérile avec des gants. </li><li> Faire fonctionner la pompe à&gt; 5 pi / min et assurez-vous voir un cordon de liquide sortir de l&#39;aiguille de perfusion. Si ce n&#39;est pas, déboucher avec le fil et essayez à nouveau. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille de perfusion à l&#39;souhaitée dorsale / ventrale niveau lentement. </li><li> Réglez le taux de la pompe à perfusion à 0,1 ul / min et commencer la perfusion. Laisser infuser pendant 2 min. </li><li> Une fois la perfusion a commencé, marquer les deux extrémités de la bulle d&#39;air dans le tube avec un marqueur noir. Si les deux extrémités ne se déplacent pas, votre aiguille est bouchée. Arrêter la perfusion, relever l &#39;aiguille, déboucher avec le fil, contrôler le débit avec un débit élevé, ne rabaissez pas l&#39;aiguille et essayez à nouveau. </li><li> Une fois la perfusion est terminée, arrêter la pompe et attendre 5 min pour le NMDA de diffuser loin de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Relevez l&#39;aiguille de 0,5 mm, et laisser infuser pendant 1 min. Attendre 2,5 min pour le NMDA à diffuser hors de l&#39;aiguille à pointe. Cette infusion supplémentaire, ilLPS sorte que toutes les BLA est couvert par la perfusion. Que cela est nécessaire pour d&#39;autres régions cérébrales doit déterminer expérimentalement. </li><li> Relevez l&#39;aiguille sur le cerveau lentement et balancer le bras stéréotaxique de la route. </li></ol> 7. Fermeture de l&#39;incision <ol><li> Don de nouveaux gants stériles à fermer l&#39;incision. </li><li> Essuyer tout excès de sang sur le crâne avec de coton stériles conseils et enlever les pinces de l&#39;aponévrose. </li><li> En utilisant des pinces de Londres, poussez les deux côtés de l&#39;incision ensemble. Les bords intérieurs de la peau devrait se réunir et le bord externe de la peau ne devrait pas être autorisé à se recourber dans l&#39;incision. Tout en appuyant sur l&#39;incision fermée, s&#39;appliquent clips plaie pour fermer la saillie fermement. Continuer à pousser la peau ensemble et discontinues sur la longueur de l&#39;incision. Cela prend habituellement 3-5 clips de la plaie. </li><li> Après avoir placé tous les clips de la plaie, utilisez la pince pour pincer les agrafes à nouveau, en s&#39;assurant qu&#39;ils sont en sécurité. Le t plus sûril clips, moins il est probable qu&#39;un rat de les sortir avant l&#39;incision est guérie. </li><li> Swab l&#39;incision agrafé avec une solution de povidone iodée à 10% et de retourner chez le rat dans sa cage la maison et moniteur jusqu&#39;à ce que la mobilité est rétablie (habituellement 1-2 heures après l&#39;anesthésie, la chirurgie du temps total de l&#39;induction à la fermeture étant 30-45 min). À ce stade, le rat peut être retourné à la salle de la colonie. Après une semaine, enlever les agrafes avec un outil Dégrafeuse sous anesthésie à l&#39;isoflurane. </li><li> Utilisez un stérilisateur à chaud talon pour stériliser les surfaces d&#39;embout de tous les instruments avant de l&#39;utiliser sur le rat prochaine. Les instruments doivent être immergés dans les perles pour plus de 15 secondes, ou bien ils peuvent devenir trop chaud pour manipuler. Les instruments doivent être complètement refroidi avant d&#39;être utilisé sur un autre animal. </li></ol> 8. Récupération <ol><li> Il est possible que les rats présentent une activité de saisie dans les jours qui suivent la lésion. Selon la région du cerveau endommagées, d&#39;autres comportements comme la consommation d&#39;aliments ou de grooming peut être affectée. Il est important que les animaux soient surveillés sur une base quotidienne afin de s&#39;assurer qu&#39;ils restent en bonne santé lors de la récupération. Les soins de soutien, tels que la nourriture liquide, à haute teneur en calories des aliments, ou d&#39;une analgésie supplémentaire peut être nécessaire. La mortalité due à l&#39;anesthésie survient dans un faible pourcentage de rats, habituellement de moins de 5%. La mortalité due à d&#39;autres causes (infection, saignement) est extrêmement rare. Tout signe de détresse après la récupération de l&#39;anesthésie peut être cause d&#39;exclusion de futures études, mais sont extrêmement rares. La figure 4 illustre la perte de poids pendant les premiers jours qui suivent la chirurgie comme il devrait être prévu. Le poids corporel devrait rebondir dans 1 semaine. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Une semaine ou plus après la perfusion NMDA, la lésion peut être visualisée en utilisant un contre-coloration crésyl-violet et microscopie en fond clair. Brains devrait être perfusé avec de la glace du paraformaldéhyde à 4% à froid, équilibrée dans saccharose à 30% dans 0,1 M PBS et frozfr. Ils devraient ensuite être tranché à 30-60 um, dans une série de 1:06-1:12 et montés sur des lames de verre recouvertes de gélatine avant de subir un contre violette norme de crésyl. La lésion doit correspondre à un &quot;calvitie&quot; ou une zone de violet de crésyl diminué en raison tache à la mort cellulaire suite d&#39;une lésion. Les figures 5A et B montrent une lésion représentant de la BLA et le CEA. Cette image a été obtenue en utilisant un scanner à plat avec un scan à haute résolution (1200 dpi). Pour visualiser la lésion, il contribue à recolorer une série de sections dans une grande partie du tissu qui entoure la zone cible afin d&#39;une lésion mal placée peut être situé. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Figure 1. Configuration stéréotaxique. Cette figure montre la stéréotaxique chez le rat avec les parties concernées étiquetés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Figure 2. Bregma et lambda sur le sku ratll. Cette illustration montre les emplacements des bregma et lambda. Toutes les coordonnées sont mesurées par rapport à bregma. Lambda est utilisé pour faire en sorte que le crâne est de niveau. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Figure 3. Lecture des coordonnées stéréotaxiques. Ce dessin représente une lecture standard stéréotaxique. Pour obtenir les chiffres à la gauche de la décimale, utilisez les marqueurs sur le côté droit. Le chiffre marqué correspond à l&#39;endroit des dizaines (c.-à-1 = 10, 2 = 20). Les marques de hachage entre les chiffres marqués correspondent à des unités simples (1-9). La ligne de zéro indique à quel nombre entier l&#39;stereotax est réglé. Ici, la ligne zéro est compris entre 10 et 11 de la marqueurs, indiquant que la température est comprise entre 10 et 11. Pour déterminer les chiffres à la droite de la virgule décimale, utilisez les marqueurs sur le côté gauche. Les marques de hachage sur la gauche sont numérotés de 0 à 10, avec chaque hachage non marqué qui représente une différence de l&#39;unitéceux côté. Quelle que soit la marque de hachage sur les lignes à gauche le mieux avec les marques de hachage sur la droite indique la première décimale de la lecture de coordonnées. Ici, la marque de hachage sur la gauche correspondant au numéro 9 lignes mieux avec les marques du côté droit de hachage de sorte que la décimale est de 9. La lecture finale est de 10,9 mm. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Figure 4. Le changement de poids après la chirurgie. Ce graphique montre la moyenne (± SEM) de poids des rats ayant subi une chirurgie stéréotaxique (n = 17) ou n&#39;avaient pas été opérés (n = 6). Jour 0 est le jour de la chirurgie. Après la chirurgie, le poids des rats a diminué pendant 2-3 jours après la chirurgie et a ensuite augmenté la journée autour de 5-6. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Figure 5. Par exemple une lésion excitotoxique. A) Cette image montre un violet de crésyl recolorer sur une tranche 30 um coronale avec le chauve &quot;spot »de la lésion de l&#39;amygdale NMDA basolatérale. Les flèches blanches donnent un aperçu de la lésion. Il peut être comparé au côté opposé de la tranche du cerveau qui n&#39;a pas de lésion. B) Une lésion similaire de la centrale amygdale noyau.

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	<li>Kirby, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+amygdala+regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+and+fear-related+activation+of+newborn+neurons.">Basolateral amygdala regulation of adult hippocampal neurogenesis and fear-related activation of newborn neurons.</a> Mol. Psychiatry. , (2011).</li><li>Goosens, K. A., Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextual+and+auditory+fear+conditioning+are+mediated+by+the+lateral,+basal,+and+central+amygdaloid+nuclei+in+rats.">Contextual and auditory fear conditioning are mediated by the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats.</a> Learn Mem. 8, 148-155 (2001).</li><li>Korz, V., Frey, J. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode présentée ici permet stéréotaxique pour une lésion excitotoxique des zones spécifiques du cerveau par l&#39;intermédiaire d&#39;infusion de NMDA. Les méthodes de base stéréotaxiques peut être adapté pour infuser une variété d&#39;agents pharmacologiques et biologiques d&#39;une manière spécifique au site. Il peut également être adaptée pour cibler une variété de régions du cerveau, définis par leurs coordonnées stéréotaxiques du cerveau dans un atlas 12. Adaptation à d&#...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> N-méthyl-D-aspartique acide 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Double standard Lab stéréotaxique W/45 °. Barres d&#39;oreilles </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Fournisseur alternatif: Kopf * note de prudence: assurer la compatibilité des accessoires stéréotaxiques si l&#39;achat auprès de fournisseurs multiples </td></tr><tr><td> 10 ul SYR SPECIAL (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-outil </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Fournisseur alternatif: Kopf </td></tr><tr><td> Fraises au carbure, la pièce à main HP, taille 2 </td><td> Schein </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Programme seringuePompe programmable </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Fournisseur alternatif: Kopf </td></tr><tr><td> Acier inoxydable 316 hypodermique paroi du tube régulier de calibre 30 0.0123 &quot;OD x 0,00625&quot; ID x .003 &quot;mur (aiguille de perfusion) </td><td> Petites pièces </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 tubes (tubulure de perfusion) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Clips Reflex, 9mm, non stérile </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> INS500346 </td><td> Fournisseur alternatif: Outils belle science </td></tr><tr><td> Applicateur de clips Reflex pour les clips 9mm </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> 12031-09 </td><td> Fournisseur alternatif: Outils belle science </td></tr><tr><td> Courbé hémostatique Hartman </td><td> Outils belle science </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> Londres pince </td><td> Outils Sceince Beaux- </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Une solution de chlorhexidine à 2% </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Fournisseur alternatif: PetSolutions </td></tr><tr><td> 10% de solution d&#39;iode povidone </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot stérilisateur à billes </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Table des réactifs spécifiques et des équipements.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

De nombreuses fonctions de comportement chez les mammifères, y compris les rongeurs et les humains, sont médiés principalement par les régions discrètes du cerveau. Une méthode courante pour discerner la fonction de diverses régions du cerveau pour le comportement ou d&#39;autres résultats expérimentaux est de mettre en œuvre une ablation localisée de la fonction. Chez les humains, les populations de patients atteints de lésions cérébrales localisées sont souvent étudiés pour les déficits, dans l&#39;espoir de révéler la fonction sous-jacente de la zone endommagée. Chez les rongeurs, on peut induire expérimentalement des lésions de régions spécifiques du cerveau. Lésion peut être accompli de plusieurs façons. Lésions électrolytiques peuvent provoquer des dommages localisés, mais peuvent endommager une variété de types cellulaires ainsi que les fibres qui traversent des autres régions du cerveau qui se trouvent près de la site de la lésion. Inductibles techniques génétiques à l&#39;aide de cellules de type promoteurs spécifiques peuvent également permettre un ciblage spécifique au site. Ces techniques sont complexes et pas toujours pratique en fonction de la zone du cerveau cible. Excitotlésion oxique utilisant la chirurgie stéréotaxique, en revanche, est l&#39;une des méthodes les plus fiables et pratiques de lesioning neurones excitateurs, sans endommager les cellules gliales locales ou traversant des fibres. Ici, nous présentons un protocole pour perfusion stéréotaxique du excitotoxine, N-méthyl-D-aspartate (NMDA), dans le complexe basolatéral amygdale. En utilisant les indications anatomiques, nous appliquons les coordonnées stéréotaxiques pour déterminer l&#39;emplacement de notre région du cerveau cible et abaisser une aiguille d&#39;injection en place juste au-dessus de la cible. Nous avons ensuite infuser notre excitotoxine dans le cerveau, entraînant la mort excitotoxique des neurones voisins. Bien que notre sujet expérimental de choix est un rat, les mêmes méthodes peuvent être appliquées à d&#39;autres mammifères, avec les ajustements appropriés dans les équipements et les coordonnées. Cette méthode peut être utilisée sur une variété de régions du cerveau, y compris l&#39;amygdale basolatérale 1-6, d&#39;autres noyaux amygdale 6, 7, 8 hippocampe, entorhinal cortex 9 et du cortex préfrontal 10. Il peut également être utilisé pour infuser composés biologiques tels que des vecteurs viraux, 11 1. La technique de base stéréotaxique pourrait également être adapté pour l&#39;implantation de plus de permanents pompes osmotiques, ce qui permet une exposition plus prolongée à un composé d&#39;intérêt.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

L&#39;ablation ciblée de la région spécifique du cerveau (s) par perfusion d&#39;une excitotoxine en utilisant les coordonnées stéréotaxique est décrite. Cette technique pourrait également être adapté pour perfusion d&#39;autres produits chimiques dans le cerveau de rat.

Chirurgie stéréotaxique pour lésion excitotoxique des zones spécifiques du cerveau chez le rat adulte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.2K vues.  University of California Berkeley. L'ablation ciblée de la région spécifique du cerveau (s) par perfusion d'une excitotoxine en utilisant les coordonnées stéréotaxique est décrite. Cette technique pourrait également être adapté pour perfusion d'autres produits chimiques dans le cerveau de rat.

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Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgie stéréotaxique rongeurs et des améliorations pour la protection des animaux Résultat Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

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Neurosciences

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulation de l&#39;expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d&#39;oligonucléotides Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).