Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (à la fois pour RGM).

A. Matériel nécessaire: Voir le tableau 1 (réactifs) avant la préparation <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml H 2 0 + 1% de pénicilline / streptomycine (stockée dans le réfrigérateur ou sur de la glace). </li><li> 20% actions BSA est faite dans l&#39;eau et aliquotés et conservés à -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml de HBSS 1X (P / S) + 3 ml de BSA 20% (concentrations finales BSA est de 0,3%) </li><li> Islet moyenne: RPMI + 10% FBS + glutamine 1% + 1% de pénicilline / streptomycine </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> Suture 4-0 (McKesson): couper en morceaux 2 ¾ pouces et stockés dans une boîte de Petri de 10 cm </li><li> Instruments: Pliez la pince de Outils Fine Science à 90 °, et limer les dents crénelées de toutes les trois paires de pinces. L&#39;objectif est de ternes les dents, ne pas les supprimer. </li><li> Canule pour l&#39;administration de la collagénase / protéase mélange: 27G ½ po aiguille, 30 ½ poaiguille, tube PE50 coupé en morceaux de 12 po. Déposer les deux aiguilles vers le bas jusqu&#39;à une extrémité arrondie lisse qui n&#39;a pas de bords tranchants. Insérer l&#39;aiguille 27G dans une extrémité d&#39;une pièce de 12 po PE50 tube. Retirez l&#39;aiguille 30G de l&#39;enveloppe en brisant le boîtier avec une paire de pinces, tournant le boîtier ¼ de tour à chaque fois. Retirer l&#39;aiguille de la pince de l&#39;enveloppe et de l&#39;insérer dans l&#39;autre extrémité de la tubulure PE50 sous un microscope à dissection. Veillez à ne pas plier le tuyau que vous insérez l&#39;aiguille dans le tube PE50. L&#39;aiguille 27G est la fin que vous allez fixer la seringue de la collagénase. </li><li> Protéase collagénase (enzyme CI MA) et de neutre (CI enzyme BP). Reconstituer le TDE selon les instructions du fabricant. Reportez-vous au certificat spécifique du lot d&#39;analyse pour calculer la concentration de l&#39;activité enzymatique. Transférer un total de 350.000 collagène dégradantes d&#39;activité (CDA) des unités de la collagénase reconstitué et 100.000 unités de protéase neutre de la reconstittribué protéase BP dans un tube conique et diluer jusqu&#39;à 15 ml au total dans du HBSS (P / S) </li></ol> B. Step-by-Step Protocole 1. L&#39;inflation de pancréas avec la collagénase / protéase Mélange <ol><li> Euthanasier souris par dislocation cervicale, saturer le torse de la souris avec de l&#39;EtOH 70%, cavité abdominale ouverte complètement de l&#39;anus à membrane avec des ciseaux et des pinces à dissection. </li><li> Placez la souris sur la plate-forme d&#39;un microscope à dissection. </li><li> Tirez le caecum et le côlon ascendant et de les mettre en dehors de la cavité du corps à votre gauche. Voir la figure 1 pour un résumé des étapes suivantes. </li><li> Positionner les lobes du foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est suffisamment ouvert. Trouvez l&#39;artère hépatique, la veine porte et le faisceau voie biliaire conduisant dans le foie en saisissant le duodénum avec des pinces courbes. Avec une autre paire de pinces courbées, les mains sous l&#39;artère, veine, et conduit bundle et tirez un 2 ¾ po morceau de suture 4-0 sous l&#39;artère, veine voie biliaire, et l&#39;attacher fois et serrer au plus près du foie que possible. </li><li> L&#39;utilisation de deux paires de pinces courbes, bien saisir le duodénum et de trouver la voie biliaire au duodénum attaché à la papille. Utilisez une pince de la pince à pointer à travers le pancréas et le tissu conjonctif droit sous l&#39;étroite voie biliaire à la papille. Poke vos pinces rapidement à travers l&#39;organe à faire un trou, puis mettre les deux pinces de pinces à travers et prendre un autre morceau de 2 ¾ de pouce de suture 4-0 grâce et l&#39;attacher fois et tirez-le à un petit cercle, mais ne pas serrer. </li><li> Modifier les 90 ° forceps et aux ciseaux Vannas Superfine. Avec les 90 ° pince, pincez et tirez soigneusement l&#39;intestin grêle jusqu&#39;à ce que le canal cholédoque est tendu. Faire une coupe horizontale à travers la papille avec les ciseaux en piquant les ciseaux ouverts dans l&#39;intestin, puis couper avec un seul mouvement. Essayez de ne faire one recoupent la papille sans déloger la voie biliaire de la papille. </li><li> Tout en maintenant l&#39;intestin avec les 90 ° pince, insérez la canule dans le canal cholédoque jusqu&#39;à la moitié de la longueur de la voie biliaire, puis tirez doucement le fil de suture serrée autour de la canule. </li><li> Remplir une seringue de 3 ml avec 2,0 ml de collagénase / protéase mélange et les injecter dans la canule à un rythme lent et constant. </li><li> Après le gonflage du pancréas est terminée, retirez la canule de la voie biliaire principale et utiliser les pinces et ciseaux courbes incurvées printemps pour enlever le pancréas gonflé en commençant par le côlon descendant et coupant le tissu conjonctif que vous tirez les intestins vers le haut. Continuer à supprimer le pancréas dans l&#39;intestin jusqu&#39;à ce que vous atteigniez le canal biliaire, puis retirez le pancréas de la rate, puis l&#39;estomac, puis de les viscères de la cavité abdominale. Terminer la suppression en coupant les fils de suture loin. Ajouter le pancréas à un tube de 50 ml contenant 5 ml de HBSS(P / S). Ce tube doit être sur la glace. </li><li> Répétez la procédure ci-dessus pour chaque animal jusqu&#39;à quatre animaux. Pour des résultats optimaux, se dissocient seulement quatre pancréas en même temps. En règle générale, tandis que les quatre premiers sont dans le bain à 37 ° C de l&#39;eau, on gonfle un autre pancréas quatre. </li></ol> 2. Pancréas dissociation <ol><li> Placer les tubes de 50 ml contenant du pancréas dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Secouez doucement le tube et vérifier pour la dissociation des tissus, assurez-vous de tissu se détache facilement, puis tourbillonner les tubes 12 fois pendant que vous tenez le tube par le couvercle. </li><li> Ne pas ajouter plus de 30 ml de HBSS (BSA) (cela peut être un montant inférieur, en fonction de combien est nécessaire pour équilibrer les tubes pendant l&#39;étape de centrifugation) et centrifuger à 290 xg pendant une minute. </li><li> Aspirer le surnageant avec précaution et laisser une petite quantité de surnageant (2-3 ml) à la base afin de ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> L&#39;aide d&#39;un seringue 30 ml d&#39;Attached à 14G aiguille, ne pas ajouter plus de 10 ml de HBSS (BSA) et aspirer la suspension de haut en bas 2 fois. </li><li> Filtrer le mélange de cellules à travers une passoire à thé en plastique dans un tube de 50 ml et rincer avec un autre HBSS 10 ml (BSA). </li><li> Centrifuger à 330 xg pendant 2 min. </li><li> Décanter le surnageant et inverser les tubes égoutter sur du papier absorbant pendant 1 minute. </li><li> Resuspendre chaque tube de 10 ml à froid histopaque 1100. </li><li> Superposez la histopaque avec 10 ml de HBSS (BSA) et centrifuger à 900 xg pendant 18 min. </li><li> Retirez la totalité des 20 ml de surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette de grand alésage 25 ml et passer le surnageant à travers environ 70 um filtre inversées. </li><li> Rincer les îlots dans un plat de Pétri de 10 cm par pipetage 10 médias îlots ml à travers le filtre en le tenant à l&#39;endroit sur le plat. </li><li> Culture des îlots dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire avant d&#39;être prêt pour l&#39;expérimentation. En règle générale, les îlots sont cueillies à la main et comptés avant experimentation. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Rendements Islet, la morphologie et la qualité sont les paramètres généraux utilisés pour juger du succès de l&#39;isolement des îlots. Dans nos mains, les rendements des îlots de la moyenne C57BL / 6 souris sont de l&#39;ordre de 150-250 îlots qui utilisent ce protocole (voir le tableau 2), et sont comparables aux données obtenues en utilisant optimisé Sigma type XI collagénase. Cependant, les rendements peuvent varier en fonction de la souche de souris utilisée et l&#39;âge de la souris. La plupart des animaux que nous utilisons sont dans la gamme de 8-16 ans semaine Ce protocole a été testé sur plusieurs souches de souris, y compris C57BL / 6 (180 à 250 îlots / souris), CD1 (200-300 îlots / souris), 129 / B6 (200-300 îlots / souris), BLKS-db/db (120-200 îlots / souris), NOD (10 semaines d&#39;âge, 100-150 îlots / souris), et NOD-SCID (100-150 îlots / souris ). La morphologie des îlots typique est montrée à la figure 2, dans laquelle îlots faire un tour à la forme oblongue avec une taille relativement uniforme (bien que la taille uniformity peut varier d&#39;une souche à l&#39;autre). Figure 3 montre notre analyse typique du glucose stimulée par la sécrétion d&#39;insuline à partir de souris C57BL / 6 îlots isolés à l&#39;aide de la souris TDES purifiés vs Sigma type XI de la collagénase. Typiquement, un des résultats de haute qualité d&#39;îlots de préparation à une stimulation par l&#39;insuline à 25 mM de glucose qui est 6-20 fois supérieure à celle observée à 2,5 mM de glucose. D&#39;autres applications peut également être utilisé pour tester la qualité d&#39;îlots isolés, et il s&#39;agit notamment de l&#39;utilisation de techniques de périfusion, Ca 2 + d&#39;imagerie (avec Fura2), et transcription inverse PCR, entre autres 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un résumé de la canulation du canal cholédoque. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Aspect typique d&#39;îlots C57BL / 6 à 24 h isolement suivant. Images ont été acquises sur un enmicroscope à un grossissement de 40X convertis. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Stimulée par le glucose sécrétion d&#39;insuline de souris C57BL / 6 îlots. A 24 h suivant l&#39;isolement, 100 îlots ont été incubés dans un plat de 12 puits pendant 1 heure à 37 ° C dans de Krebs-Ringer HEPES solution tampon contenant 2,5 mM de glucose. Les îlots ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer HEPES à 2,5 mM de glucose pendant une heure supplémentaire, après quoi le surnageant a été recueilli pour la mesure de l&#39;insuline à l&#39;aide d&#39;une à deux sites immunospécifique-enzymatique (ELISA) (Crystal Chem). Les îlots mêmes ont ensuite été transférés à Krebs-Ringer tamponné HEPES contenant 25 mM de glucose et de l&#39;insuline dans le milieu a été mesurée par ELISA après 1 heure d&#39;incubation.

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	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS, SAT, et RGM n&#39;avez rien à déclarer. AGB auteur est employé par VitaCyte. Auteur MRC détient une participation dans VitaCyte.

Dans ce protocole, nous avons décrit notre procédure de cathétérisme, perfusion de collagénase, et la dissociation du pancréas de souris, dans le but d&#39;isoler les îlots de Langerhans. Techniquement, notre méthode, une fois maîtrisé, devrait permettre à l&#39;isolement du pancréas moins de 4 min de l&#39;euthanasie de l&#39;animal, et en 1 heure devrait aboutir à l&#39;isolement d&#39;îlots à partir d&#39;un seul animal. La rapidité de la technique nous permet d&#39;isoler les îlots de jusqu&#39;à 12 souris à un étirement typique, ce qui conduit à l&#39;isolement de jusqu&#39;à 3.000 îlots. Contrairement à d&#39;autres protocoles qui utilisent des préparations brutes de collagénase, notre protocole comprend l&#39;utilisation de protéases purifiées, CI enzyme collagénase et MA CI enzyme protéase BP. Les variations de la consistance des préparations TDE qui sont disponibles dans le commerce exige que chaque lot soit individuellement testées et optimisées avant l&#39;utilisation générale. Cette variabilité de lot à lot nous a conduit à envisager l&#39;utilisation de puriTDES fiés de VitaCyte. Ces TDES hautement purifiés sont caractérisés par plusieurs méthodes, y compris l&#39;utilisation de tests de fluorescence sensibles substrat marqué. Le dosage de fluorescence CDA est plus sensible aux différentes formes moléculaires de la collagénase qui ont des cinétiques différentes de collagène natif dégradants. Historique des dosages de substrats peptidiques fournir une évaluation incomplète de la collagénase. Caractérisation de la collagénase par des méthodes multiples assure une plus grande activité enzymatique entre les lots. Sur la base de notre propre test en utilisant une variété de préparations de collagenase disponibles dans le commerce, nous avons constaté que les combinaisons d&#39;enzymes purifiées donné reproductibles de lot à lot résultats. Les principaux avantages de l&#39;utilisation de TDES hautement purifiés et rigoureusement caractérisée dans la présente demande sont une fois de la composition enzymatique optimale est définie, la cohérence de ses performances de lot à lot est assurée. Cette cohérence élimine le processus laborieux de qualification beaucoup normalement requispour les produits bruts de la collagénase ou enrichi. TDES purifiées également permettre des modifications supplémentaires de la composition afin d&#39;améliorer le rendement et la qualité des îlots récupérés à partir de différentes souches de souris. Rapports compositions enzymatiques optimales pour l&#39;isolement des îlots de différentes souches de souris peuvent être plus efficacement communiquées. Ceci, à son tour, conduit à une utilisation plus productive des ressources et une meilleure flexibilité dans la conception expérimentale. Il ya beaucoup d&#39;étapes essentielles qui peuvent affecter le résultat de l&#39;isolement des îlots en utilisant notre protocole. Le premier est la nécessité de parvenir à l&#39;inflation effective du pancréas au cours de la perfusion de la préparation enzymatique. Il est important de commencer l&#39;inflation avec une force douce de la seringue, et augmenter la force que les gonfle pancréas. Il est utile de déplacer les intestins et le pancréas soulever lors du gonflage de sorte que la collagénase perfuse l&#39;organe entier. Une autre étape importante est la force avec laquelle on secoue l&#39;AFTE tubesr incubation à 37 ° C (étape 2,2). Nous avons constaté que le pancréas secouant durement contre le bouchon du tube provoque la fragmentation des îlots, mais sans aucune forme de dissociation mécanique à cette étape, les rendements des îlots peut chuter dramatiquement. Il est également impératif que lors de l&#39;étape de dissociation avec la seringue (étape 2.5), une force de niveau moyen est appliqué pendant le mouvement de haut en bas avec le piston, ce qui assure la dissociation tissulaire adéquate avant l&#39;étape de filtrage (2,6), où très peu de tissu doit être retenu sur le filtre passoire à thé. Enfin, la dernière étape à suivre attentivement l&#39;aspiration de l&#39;ensemble de 20 ml de HISTOPAQUE les îlots fractionnés. Bien que les îlots sont généralement à l&#39;interface de la histopaque et HBSS, nous avons constaté que nous perdons îlots quand nous essayons de supprimer uniquement l&#39;interface, au contraire, nous avons maintenant retirer la totalité des 20 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de grand alésage 25 ml. Nous avons ajouté la filtration à travers le filtre 70 um inversé (étape 2.11) afin d&#39;éliminer la nécessité de centrifuge les îlots à plusieurs reprises pour laver la histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td></td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> tout </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 suture rouleau de 100 m </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 14 g extrémité émoussée </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Sciss Superfine Vannas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux courbes de printemps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbes (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbes (pour 90 °) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 pouces aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 30G 1/2 pouce </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> Tube PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP protéase </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 30 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 boîte de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Passoire à thé en plastique </td><td> Toute fourniture cuisine </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs Tableau 1. Et équipement </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma type XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Rendements îlots moyen (± SD) en utilisant des lots différents TDE * * Les données représentent la moyenne des rendements des îlots d&#39;au moins 10 souris. Les numéros de lot entre parenthèses </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

L&#39;interrogatoire de l&#39;expression génique des cellules bêta et la fonction in vitro a carrément changé au fil des ans à partir de l&#39;étude des lignées de rongeurs tumorigènes de cellules à l&#39;étude des îlots isolés de rongeurs. Îlots primaires offrent l&#39;avantage qu&#39;elles reflètent plus fidèlement la biologie des voies de signalisation intracellulaires et les réponses sécrétoires. Considérant que la méthode d&#39;isolement des îlots de tissu à l&#39;aide d&#39;enzymes dissociant (TDE) préparatifs a été bien établi dans de nombreux laboratoires de 1-4, les variations de la consistance du rendement et de la qualité de l&#39;îlot n&#39;importe quelle souche de rongeurs donnée limiter la portée et la faisabilité des études primaires îlots. Ces variations se produisent souvent à la suite des TDES brut partiellement purifiés utilisés dans la procédure d&#39;isolement des îlots; TDES présentent souvent beaucoup à beaucoup variations de l&#39;activité et nécessitent souvent des ajustements de la dose d&#39;enzyme utilisée. Un petit nombre de rapports ont utilisé pour purifier TDES isolements cellulaires de rongeurs 5, 6 </sup&gt;, mais la pratique n&#39;est pas très répandue malgré l&#39;utilisation de routine et les avantages de purifier TDES pour isolements d&#39;îlots humains. En collaboration avec VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), nous avons développé un protocole de souris modifiée îlot isolement basé sur celui décrit par Gotoh 7, 8, dans lequel les TDES sont perfusés directement dans le canal pancréatique de souris, suivie d&#39;un fractionnement du tissu brut par un gradient Histopaque 9, et l&#39;isolement des îlots purifié. Une différence significative dans notre protocole est l&#39;utilisation de la collagénase purifiée (CI enzyme MA) et neutre protéase (enzyme CI BP) combinaison. La collagénase a été caractérisé par l&#39;utilisation d&#39;un 6 collagène fluorescence activité (CDA) test dégradants qui ont utilisé marquées par fluorescence solubles fibrilles peau de veau comme substrat 6. Ce substrat est plus prédictif de la cinétique de dégradation du collagène dans la matrice de tissu, car il repose sur le collagène natif comme substrat. La protéase est CHaracterized avec un test sensible cinétique fluorescente 10. L&#39;utilisation de ces tests améliorés ainsi que l&#39;analyse biochimique plus traditionnelle activer le chiffrement transparent des données à fabriquer plus cohérente, conduisant à la cohérence entre les lots de meilleures performances. Le protocole décrit ici a été optimisé pour un rendement maximal et de la morphologie des îlots îlot optimale en utilisant C57BL / 6. Au cours de l&#39;élaboration de ce protocole, plusieurs combinaisons de collagénase et de protéases neutres ont été évaluées à différentes concentrations, et le rapport final de la collagénase: protéase neutre de 35:10 représentent le rendement enzymatique comparable à Sigma Type XI. Parce que la variabilité importante des rendements des îlots moyenne de différentes souches de rats et de souris ont été signalés, des modifications supplémentaires de la composition TDE devraient être faits pour améliorer le rendement et la qualité des îlots de récupération à partir de différentes espèces et souches.

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Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d&#39;une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.2K vues.  Indiana University School of Medicine. Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Vidéo: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolement murin îlots pancréatiques

Recherche

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...