Ce protocole exige l’utilisation d’un gradient de densité unique le rendant sensiblement moins laborieux et plus rentable comparé aux méthodes conventionnelles plus complexes d’isolement d’îlot. Le principal avantage de ce protocole est que l’enzyme est livrée directement au pancréas, ce qui entraîne une digestion accrue des tissus et une augmentation du rendement des îlots. Commencez par enregistrer les membres de la souris en position supine et pulvériser le corps avec 70% d’éthanol.
À l’aide de forceps en verre de couverture et de ciseaux chirurgicaux incurvés, faites une incision abdominale horizontale d’environ trois centimètres de la peau et ouvrez la peau pour exposer la paroi abdominale. Faire une incision verticale de trois à quatre centimètres sur le péritoine abdominal pour exposer complètement le pancréas et placer la souris sous un microscope disséquant. Poussez le lobe hépatique de façon supérieure pour exposer le canal biliaire qui apparaît comme un tube rose pâle et déplacez doucement les intestins de la région lombaire et iliaque droite à droite de la cavité abdominale pour exposer le canal biliaire et l’artère hépatique.
Utilisez les micro serrefines Schwartz pour serrer soigneusement le canal biliaire commun le plus près possible du foie et identifier l’ampulla de Vater qui est située à la papille duodénanale et formée par l’union du conduit pancréatique et du canal biliaire commun. À l’aide de forceps micro Adson pour tirer le canal biliaire commun enseigné, insérez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 fixée à une seringue de trois millilitres contenant trois millilitres de solution de collagène P fraîchement préparée dans l’ampulla de Vater poussant l’aiguille dans le conduit parallèle au navire pendant environ un quart de la longueur du navire. Une fois l’aiguille en place, stabiliser l’aiguille avec des forceps micro Adson et injecter lentement et régulièrement trois millilitres de solution de collagène P dans le conduit.
L’injection est considérée comme réussie si les régions de la tête, du cou, du corps et de la queue du pancréas sont entièrement gonflées. L’entrée appropriée dans l’ampulla et la cannulation du canal biliaire commun sont critiques pour une récolte réussie de digestion. Percer les parois ductal réduit l’efficacité de l’isolement.
À l’aide de forceps incurvés et micro Adson, retirez soigneusement le pancréas gonflé à partir de la rate et continuez vers l’estomac et le long du dudénome. Placez ensuite le pancréas dans un tube de digestion de 50 millilitres contenant trois millilitres de solution glacée de collagène P. Pour récolter les îlots, utilisez d’abord de fins ciseaux chirurgicaux pour hacher le pancréas pendant trois à cinq secondes avant de placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius à 100 à 120 rotations par minute pendant 12 à 13 minutes.
À la fin de l’incubation, secouez doucement le tube pendant environ 30 secondes pour perturber le tissu jusqu’à ce que la solution soit homogène, comme le confirment les particules de tissu pancréatique de sable fin. Dès que le tissu est digéré, placez le tube sur la glace et ajoutez 40 millilitres de solution d’arrêt froid pour mettre fin à la réaction enzymatique. Après avoir doucement perturbé la pastille, faites tourner le tissu digéré dans une centrifugeuse balançante suivie de deux centrifugations avec 20 millilitres de solution d’arrêt frais par lavage.
Après le dernier lavage, resuspendez la pastille dans 40 millilitres de HBSS glacé pour trois lavages supplémentaires, en réutilisant la pastille en cinq millilitres de solution de gradient de densité de température ambiante après le dernier lavage. Vortex le tube brièvement à basse vitesse jusqu’à ce que la solution soit homogénéisée avant d’ajouter un autre gradient de densité de température ambiante de cinq millilitres au tube. Utilisez maintenant une pipette de 10 millilitres pour ajouter doucement et lentement 10 millilitres de HBSS à température ambiante au tube d’une manière goutte-sage pour permettre la formation d’un gradient et utiliser une centrifugeuse balançante de seau pour isoler les populations cellulaires par séparation de gradient de densité.
À la fin de la centrifugation, utilisez une pipette de 10 millilitres pré-humide avec du HBSS froid pour recueillir de cinq à 10 millilitres de la couche d’îlot entre le gradient de densité et le HBSS. Transférer les îlots dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de HBSS froid et recueillir les cellules par centrifugation dans une centrifugeuse balançante. Aspirez soigneusement tous sauf les trois derniers millilitres du supernatant sans déranger la pastille et lavez les îlots au moins trois fois de plus avec 20 millilitres de HBSS frais par lavage.
Après le dernier lavage, remplacer le supernatant par quatre millilitres de 37 degrés Celsius RMPI 1640 moyen et tourbillonner doucement le tube pour déloger la pastille. Versez immédiatement les îlots dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et lavez le tube avec cinq millilitres de rpmi frais 1640 moyen pour recueillir les îlots restants mettant en commun le lavage avec les autres îlots. Ensuite, utilisez un microscope à dissection et une pointe de pipette de 20 microlitres pour choisir des îlots brun doré sphériques ou oblongs sains avec une surface lisse de la boîte de Petri pour le transfert dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 10 millilitres de rpmi complet 1640 milieu.
Lorsque tous les îlots ont été ramassés, placez les îlots dans un incubateur stérile à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’air humidifié pendant la nuit. Les îlots en bonne santé semblent avoir une forme ronde lisse tandis que les îlots endommagés présentent des bords rugueux. Le tissu exocrine non digéré est translucide dans l’aspect et démontre une forme irrégulière.
Une cannulation et une distribution appropriées de l’enzyme de collagène P peuvent être confirmées par une inflation de la partie splénique du pancréas. L’incubation pendant la nuit dans les médias à faible teneur en glucose peut amorce les îlots pour un test de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose le lendemain permettant un aperçu de la capacité sécrétaire d’insuline des îlots.
