L’objectif de cette recherche est d’approfondir notre compréhension du rôle du système vasculaire pancréatique dans la biologie pancréatique normale et le développement de la maladie. En enrichissant avec succès la fraction endothéliale, nous cherchons à identifier des voies spécifiques au sein du système vasculaire qui régissent les fonctions pancréatiques, qui peuvent potentiellement être ciblées pour restaurer et améliorer les fonctions pancréatiques dans les contextes pathologiques. Récemment, l’accent a été mis de plus en plus sur le rôle du dysfonctionnement des cellules endothéliales dans les pathologies pancréatiques.
L’identification de l’hétérogénéité des populations de cellules endothéliales dans le pancréas a permis de comprendre comment les interactions endothéliales du pancréas luttent ou protègent contre les maladies. Des approches omiques telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique ou à noyau unique, la protéomique et la génomique sont utilisées pour étudier le pancréas au niveau cellulaire. Pour obtenir des informations au niveau tissulaire ou spatial, de nouvelles plateformes utilisant des approches impartiales et basées sur des sondes telles que Visium et Xenium sont mises en œuvre.
Dans ce protocole, nous décrivons une technique de dissociation douce qui minimise les enzymes pancréatiques endogènes de la diminution de la viabilité cellulaire et une procédure de tri cellulaire magnétique pour enrichir sélectivement les cellules endothéliales. La stratégie de dissociation et d’enrichissement de notre protocole permettra de mieux comprendre à la fois les marqueurs de surface cellulaire et le transcriptome des cellules endothéliales pancréatiques qui étaient auparavant sous-explorés en raison de limitations techniques. Pour commencer, placez la souris euthanasiée sur la table d’opération.
Étirez les membres de la souris et fixez-les avec des épingles. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision médiane à travers la peau et le péritoine à partir de la région abdominale inférieure et étendez-la vers la région thoracique. Coupez à travers le diaphragme et soulevez la cage thoracique pour exposer le cœur.
Insérez une aiguille de calibre 25 à 30 reliée à une seringue contenant du PBS stérile glacé dans le ventricule gauche du cœur. Perfuser le cœur à un rythme de cinq à 10 millilitres par minute et arrêter après avoir injecté 10 millilitres. Ensuite, à l’aide de ciseaux de dissection et de pinces, extrayez soigneusement le pancréas.
Transférez le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS glacé, avec l’inhibiteur de trypsine et placez le tube sur de la glace. Pour commencer, prélevez le pancréas murin dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler, retirez soigneusement l’excès de tissu.
Transférez le pancréas paré dans un tube de cinq millilitres contenant un millilitre de solution de dissociation. À l’aide de ciseaux à disséquer, coupez les tissus pancréatiques en petits morceaux, en gardant le tube sur de la glace. Transférez le lysat dans un tube de 50 millilitres placé sur de la glace.
Ajoutez deux millilitres de solution de collagénase dans le tube de cinq millilitres pour éliminer tout tissu pancréatique résiduel et transférez-le dans le tube de 50 millilitres. Incuber le tube dans un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Placez le tube avec l’homogénat de tissu sur de la glace et laissez-le se déposer par gravité.
Ensuite, passez le surnageant à travers un filtre de 70 micromètres et ajoutez cinq millilitres de solution d’arrêt de dissociation. À l’aide d’une aiguille de calibre 27, triturez la pastille restante avec un millilitre supplémentaire de solution de dissociation et passez-la à travers le filtre comme précédemment. Faites tourner la suspension cellulaire à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lavage.
Incuber une fois 10 à la puissance sept cellules avec un microlitre d’anticorps anti-biotine CD31 sur un rotateur. Ajoutez 20 microlitres de MicroBeads anti-biotine et incubez pendant 40 minutes de plus. Installez ensuite un support magnétique avec le support de séparateur de colonne et appliquez la colonne.
Après avoir équilibré la colonne, ajoutez-y l’échantillon et lavez-le avec un total de neuf millilitres de tampon de lavage. Retirez la colonne du support et placez-la dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de tampon de lavage dans la colonne.
À l’aide d’un piston, enfoncez les cellules dans la colonne pour recueillir l’élution contenant les cellules endothéliales. Enfin, faites tourner les fractions d’écoulement et d’élution. Après la remise en suspension, comptez les cellules et mesurez la viabilité.
L’analyse PCR quantitative visant à valider l’enrichissement des cellules endothéliales a montré que les fractions enrichies présentaient des niveaux significativement plus élevés de gènes marqueurs, Pecam1 et Kdr par rapport aux échantillons à flux continu. Un niveau plus faible de NK6 homeobox 1, un facteur de transcription dans les cellules endocrines pancréatiques, a été observé dans les fractions enrichies. Le Western blot a montré de forts signaux de CD31 à la taille attendue, confirmant davantage l’enrichissement en cellules endothéliales dans les fractions.
