La transplantation d’îlots est l’une des approches les plus prometteuses pour le traitement du diabète sucré de type I. Et la recherche d’un site approprié pour la transplantation d’îlots est en cours. La transplantation d’îlot au tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal est une méthode simple mais efficace qui peut avoir des implications cliniques.
L’extrapolation de cette procédure à la clinique peut mener au développement d’un traitement pour les diabétiques de type I. Cette méthode pourrait fournir un aperçu de la transplantation clinique d’îlot car le lingual a été déterminé pour ne pas être un emplacement idéal pour l’engraftment d’îlot. Il est important de suivre attentivement chaque étape de la procédure, en particulier les étapes clés, telles que la digestion du pancréas.
La démonstration visuelle aidera les chercheurs à mettre au point une nouvelle technique afin de mieux déterminer comment effectuer l’isolement des îlots et la transmutation. Pour la récolte des îlots, vaporisez d’abord la fourrure d’une souris noire C57 de 10 semaines avec 75 % d’éthanol et remplissez une seringue de cinq millilitres d’une solution de collagène fraîchement préparée. Équiper la seringue d’une aiguille de perfusion pointue émoussée de flexion de calibre 32 et placer la souris en position supinée sur un sac de glace.
Utilisez des ciseaux ophtalmiques pointus droits pour faire une ouverture transversale dans la peau de la région pubienne, et étendre l’incision vers la tête de l’animal. Ouvrez complètement l’abdomen par une incision en V de la région pubienne au processus xiphoïde, et déplacez le foie pour exposer la vésicule biliaire et toute la longueur du canal biliaire commun. Ensuite, utilisez une pince vasculaire pour fermer l’ouverture duodénanale du canal biliaire commun et couper une petite ouverture dans la vésicule biliaire.
Cannulate le canal biliaire commun par l’ouverture avec l’aiguille de perfusion précédemment préparée, et injecter approximativement deux millilitres de solution de collagène dans le pancréas. Lorsque toutes les collagènes ont été livrées, utilisez deux paires de micro pinces non invasives pour séparer le pancréas perfusé des intestins, de l’estomac et de la rate, et placez le pancréas dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Lorsque tous les échantillons ont été prélevés, ajouter 100 microlitres de Dnase I par pancréas aux tubes de 50 millilitres et secouer vigoureusement chaque tube environ 40 fois sur une période de 10 secondes avant de placer les tissus dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes avec des secousses modérées.
À la fin de l’incubation, ajouter jusqu’à un volume final de 50 millilitres de Stop Solution pour arrêter la digestion. Et pulsez centrifuger les tubes à une vitesse de 750 fois G à quatre degrés Celsius avant d’arrêter rapidement la centrifugeuse. Après avoir jeté les supernatants, lavez les granulés deux fois en 15 à 25 millilitres de solution stop par lavage dans les mêmes conditions de centrifugation que ce qui vient de le démontrer.
Après le deuxième lavage, mettre en commun trois granulés par tube dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Et résuspendez les cellules pancréatiques dans un volume total de dix millilitres d’Histopaque 1119. Ajoutez ensuite soigneusement cinq millilitres d’Histopaque 1077 sur le côté de chaque tube, suivis de cinq millilitres de HBSS.
Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette Pasteur de cinq millilitres pour recueillir les îlots de l’interface HBSS Histopaque 1077. Mettre les îlots en commun dans un nouveau tube conique de 50 millilitres dans un volume final de 50 millilitres de solution stop pour centrifugation pulsée, et jeter le supernatant. Resuspendez la pastille en 30 millilitres de solution stop fraîche pour une centrifugation d’une minute, et réutilisez les îlots en 30 millilitres de milieu de culture.
Décanter les îlots en un plat de culture léger de 10 centimètres par tube. Et placez le plat sous le microscope stéréo. À l’aide de 200 pointes de pipette à chargement de gel microlimétrique, choisissez à la main les îlots sphéroïdaux blancs de la solution.
Placer les îlots dans un plat de culture cellulaire non traité contenant 10 millilitres de milieu de culture au fur et à mesure qu’ils sont récoltés. Vérifiez la pureté des îlots cueillis à la main en soudant la dithizone au microscope léger. Et détecter la viabilité des îlots par la fluorescéine diacétate propidium iodure tacher sous un microscope florescent.
Ensuite, la culture des îlots isolés dans le milieu de culture fraîche à 37 degrés Celsius dans 95% d’air et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à la transplantation. À partir des jours trois et quatre après l’induction du diabète, percer la veine caudale de chaque streptozotocine injectée huit semaines mâle C57 noir six souris vers 10:00 a.m. pour recueillir un échantillon de sang de chaque animal receveur.
Utilisez un instrument de surveillance de base de la glycémie pour déterminer le taux de glucose sanguin non à jeun de chaque souris, puis ajoutez le sang sur des bandes d’essai individuelles. Lorsqu’un animal a démontré un taux de glucose sanguin d’au moins 20 millimoles par litre deux jours de suite, pesez et marquez la souris receveur et confirmez un manque de réponse au réflexe de pédale chez les animaux anesthésiés. Placez un aliquot d’hydrogel de moins 20 degrés Celsius sur la glace pour le dégel.
Et transférer 450 à 500 équivalents îlots par destinataire dans un tube stérile centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de milieu par tube sur la glace. Écouvillonner la zone inguinale gauche du receveur avec 75% d’éthanol et placer la souris dans la position supine. Fixer les membres avec du ruban chirurgical, et utiliser des tondeuses pour enlever les cheveux autour du site chirurgical.
Écouvillonner la zone chirurgicale avec l’iodophor et faire une incision verticale dans la peau désinfectée. Identifiez l’artère et la veine épigastriques inférieures à l’intérieur de l’ISWAT et créez une petite poche au-dessus des vaisseaux. Sédimenter les îlots par centrifugation et enlever autant de supernatant que possible.
Ajouter 20 microlitres d’hydrogel décongelé à chaque tube, et resuspendre doucement les îlots, en prenant soin d’éviter les bulles. Lorsqu’une suspension homogène a été obtenue, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour livrer soigneusement l’ensemble du mélange hydrogel de l’îlot à partir d’un tube dans la poche. Lorsque l’hydrogel s’est complètement solidifié, ajouter 20 microlitres de céphalosporine au site de transplantation, et fermer le muscle et la peau avec une suture chirurgicale continue 5-0.
Ensuite, placez le destinataire dans une cage propre sur un tampon thermique avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Après le traitement de l’îlot murin tel que démontré, les îlots murins isolés seront suffisamment purs pour la transplantation. Seuls les îlots isolés à haute viabilité doivent être utilisés pour la transplantation.
Après un mélange complet des greffes d’îlots avec de l’hydrogel, la greffe peut être implantée sur le site de l’ISWAT. Après environ un mois de transplantation dans l’ISWAT, les greffes d’îlot inversent l’hyperglycémie tandis que le poids corporel des souris destinataires augmente graduellement. À 100 jours après la transplantation, l’ablation des greffes entraîne une augmentation immédiate de la .m 10:00.
taux de glucose sanguin non à jeun. L’analyse histologique à ce stade, révèle que les greffes d’îlot sont restées intactes. Et la coloration immunofluorescente d’insuline et de glucagon indiquent que les îlots transplantés sont également fonctionnels à 100 jours après transplantation.
Veillez à ne pas secouer les cellules du pancréas profusé trop robustement ou bien la capacité des îlots obtenus sera compromise. Les îlots isolés peuvent être transplantés sous la capsule rénale comme un contrôle pour comparer les effets de la transplantation isolée dans le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal au site. La procédure ajoutera l’initiation des essais cliniques de transplantation d’îlot à d’autres emplacements que le foie.
