Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Prix de l&#39;innovation collaborative. LAM a été soutenue par la signalisation cellulaire et le règlement par l&#39;Institut national de la santé une formation de subvention (T32 GM008759) et le NIH Ruth L. Kirschstein pré-doctoral (CA165349-01). Nous tenons à remercier le Professeur Michael Stowell (CU Boulder), Prof Rees Douglas et professeur Rob Phillips (Caltech) pour leurs précieux commentaires.

1. Préparation de liposomes <ol><li> Récupérer un flacon de 20 ml en verre avec un bouchon de téflon. </li><li> Nettoyez toute la verrerie et des seringues avec du chloroforme avant de l&#39;utiliser pour prévenir la contamination. </li><li> Transférer 100 ul de chloroforme de qualité réactif dans le flacon de verre en utilisant une seringue 250 ul de verre étanche à l&#39;air. </li><li> Ajouter 30 uL de méthanol de qualité réactif dans le flacon de verre en utilisant une même seringue de 100 ul de verre étanche à l&#39;air. </li><li> Pour préparer un 2 mM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC): phosphatidyléthanolamine (PAPE): solution de lipide de cholestérol, de transférer 216 ul de 10 mg / ml POPC, 42 ul de 10 uL mg / ml et 20 PAPE de 11 mg / ml des solutions de cholestérol dans CHCl 3 à la fiole de 20 ml en verre. </li><li> Évaporer les solvants organiques en utilisant lente débit d&#39;argon ou d&#39;azote jusqu&#39;à ce qu&#39;une fine pellicule de lipides est observée sur le fond du flacon. </li><li> Placez le flacon en verre non plafonnés dans un dessiccateur à vide pendant au moins 30 minutes pour éliminer le solvant résiduel. </li><li> Transfer 2 mL de tampon, préalablement passés à travers un filtre de 0,2 micron, de l&#39;ampoule de verre pour hydrater les lipides. </li><li> Incuber le mélange à 4 ° C pendant la nuit et utiliser dans les 48 heures. </li></ol> 2. Gel-et-dégel: Pour les tailles de liposomes de 30 - 100 nm seulement <ol><li> Congeler suspension de liposomes dans l&#39;azote liquide pendant 15 secondes. </li><li> Décongeler suspension de liposomes à l&#39;aide d&#39;un bloc de chauffage à 42 ° C de la température pour environ 3 minutes. </li><li> Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour un total de 5 cycles. </li></ol> 3. Extrusion Suivez les instructions AVESTIN à assembler correctement le LiposoFast LF-50 extrudeuse, en utilisant le contour instrument dans leur guide. <ol><li> Placer l&#39;écran large trou de support (avec des trous circulaires) dans la base de support de filtre, suivie par l&#39;antenne circulaire fritté (sans trous), un disque de drain (25 mm de diamètre), et une membrane de polycarbonate (25 mm de diamètre). </li><li> Placez le petit, noirTorique sur le dessus de la membrane pour le fixer à la base de support de filtre. </li><li> Fixez l&#39;extrudeuse dessus du filtre en serrant les 4 vis dans les 4 trous correspondants. </li><li> Assembler l&#39;unité de filtre à l&#39;extrudeuse sous le cylindre d&#39;extrudeuse grande. Ajouter la solution de liposomes à l&#39;barillet. Placez le suivant sur le dessus du cylindre d&#39;extrusion dans l&#39;ordre: grand cercle O-ring, casquette étroite, grand cercle O-ring, chapeau circulaire. </li><li> Attacher le régulateur de gaz au début cylindre d&#39;extrudeuse et fermer toutes les vannes pour empêcher les fuites d&#39;air, y compris la soupape de surpression. Placer un flacon en verre de 20 ml ou 50 ml Erlenmeyer en vertu de l&#39;unité d&#39;extrusion de filtre. Une soupape de sûreté est reliée au régulateur et se libérer en cas de pression supérieure à 600 psi. Allumer le gaz azote et ouvrir la vanne de gaz relié à l&#39;extrudeuse. </li><li> Augmenter la pression d&#39;azote à 25 psi pour 400 nm, liposomes 125 psi pour 100 nm, et des liposomes psi 400-500 pour 30 liposomes nm. </li><li> Regarder la susp liposomeension qu&#39;il éjecte dans le récipient en étant poussé par l&#39;atome d&#39;azote. Gardez le courant d&#39;azote jusqu&#39;à ce que vous ne respecterait plus aucun liquide passant à travers le filtre extrudeuse dans le flacon en verre. </li></ol> 4. Dynamic Light Scattering (DLS) Analyse <ol><li> Préparer 50 ul d&#39;une solution à 20 uM liposome. </li><li> Allumez la source d&#39;alimentation et la source de la lampe. </li><li> Ouvrez le logiciel DynaPro. </li><li> Réglez le logiciel pour le modèle algorithme MS / X pour détecter des liposomes de 30 nm et 100 nm et MS800 modèle algorithme pour détecter plus de 100 nm liposomes. </li><li> Connectez-vous à du matériel. </li><li> Pipeter 14 uL d&#39;échantillon liposome dans la cuvette de quartz et de l&#39;insérer dans le support de cellule. </li><li> Appuyez sur start. </li><li> Appuyez sur stop après environ 20 - 30 acquisitions. </li><li> Analyser les pics diamètre moyen des liposomes enregistrées sur l&#39;histogramme. </li></ol> 5. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA) <ol><li> Préparer un pl 500, 0,1 uM liposomeSolution. </li><li> Rincez le compartiment à échantillons avec de l&#39;eau et l&#39;éthanol. </li><li> Séchez le compartiment échantillon avec une serviette en papier non pelucheux. </li><li> Allumez la source laser de puissance et de l&#39;ordinateur. </li><li> Livrer 300 ul de 0,1 solution de liposomes uM à le compartiment à échantillons. </li><li> Ouvrez le contrôle de la température et le logiciel d&#39;analyse des nanoparticules de suivi. </li><li> Appuyez sur le bouton Capture pour allumer le laser. </li><li> Utilisation des réglages horizontaux et verticaux pour déplacer la scène et ajuster la mise au point du microscope. </li><li> Régler la température désirée (20 ° C) et temps d&#39;enregistrement (au moins 30 secondes). </li><li> Appuyez sur le bouton Enregistrer pour prendre cadres multiples des particules de liposome pour un montant de temps spécifiée. Analyser les pics correspondant aux diamètres de liposomes sur l&#39;histogramme comme il suit le mouvement de chaque particule. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un schéma décrivant le procédé d&#39;extrusion est psont représentés dans la figure 1. Pour obtenir un résultat optimal, la préparation de liposomes avec des diamètres de 30 nm nécessite une haute pression d&#39;environ 500 psi et un diamètre de 100 nm nécessite une pression de 125 psi à atteindre un taux rapide de filtre. Pour des diamètres de 400 nm, une basse pression de ~ 25 psi est recommandée pour obtenir un taux plus lent filtre, ce qui permet à des vésicules allongé et former des liposomes, des plus grandes homogènes. Nous avons effectué une série d&#39;expériences pour déterminer la pression optimale pour la production d&#39;uniformes tailles des vésicules sub-micronique. On fait varier la pression ainsi que le nombre de filtres passe à travers l&#39;extrusion de polycarbonate avec des tailles de pores de 30, 100 et 400 nm et découvert pression appropriée pour chaque taille souhaitée. Pendant 30 pores nm, une pression inférieure à 500 psi à réduire le taux d&#39;écoulement, provoquant un allongement et tailles plus grandes vésicules ainsi. Pour 100 nm pores, un flux constant a été réalisé à 125 psi. Pour 400 nm pores, à basse pression (25 psi) permet les vésicules à allongé en plus des vésicules sIzes. Un débit de filtration lente goutte à goutte est optimale pour créer plus sub-micronique vésicules 13. Nous avons effectué DLS pour déterminer les tailles des liposomes extrudées à travers trois diamètres différents, à savoir 30, 100 et 400 nm. DLS est une méthode établie qui recueille la lumière diffusée afin de déterminer le diamètre de particule. Nous extrudés liposomes hydratés de 2 mM à travers une membrane en polycarbonate nm 30 à 500 psi avec 5 passes à travers le filtre avec des pores, une membrane de polycarbonate de 100 nm à 125 psi avec 5 passes à travers le filtre avec des pores et une membrane en polycarbonate de 400 nm à 25 psi avec 2 passe à travers le filtre avec des pores. Les diamètres des liposomes et mesurées par DLS pour 30, 100 et 400 nm tailles de pores étaient de 66 ± 28, 138 ± 18 et 360 ± 25 nm (Figure 2). Une suspension de 50 billes de polystyrène nm a été utilisé comme étalon comme le montre la figure 2, où il a enregistré un diamètre de 47 ± 16 nm. Le polydispe pour centrsité montre qu&#39;il n&#39;y a pas de chevauchement dans les tailles des liposomes. Il est typique d&#39;observer diamètres supérieurs à 30 nm en utilisant l&#39;analyse DLS en raison de la partialité connue de cet instrument a les plus grosses particules vers 12. Intensités diffusion de la lumière à partir de particules grandes et petites sont collectées simultanément à partir d&#39;une méthode de détection et donc plus difficiles à résoudre des liposomes en suspension 12. Malgré cette limitation instrumentale, la courbe d&#39;étalonnage décrit une corrélation presque linéaire. NTA est une technologie qui mesure la taille de chaque particule de l&#39;observation directe de la diffusion dans un milieu liquide, indépendante de l&#39;indice de réfraction des particules ou de la densité. Cette technique de haute résolution peut être utilisée pour compléter la mesure de liposomes avec DLS. La NTA a enregistré des diamètres de 95 ± 48 et 356 ± 51 nm, 100 nm et deux solutions de polystyrène 400 nm ont été utilisées pour l&#39;étalonnage. Les émulsions lipidiques de 30 nm et 100 nm ont été observés pour avoir un échantillon plus<html> diamètre arables par rapport aux DLS comme le montre la figure 3, la production de taille moyenne de 29 ± 14, 95 ± 17 et 359 ± 73 nm. La NTA peut être une technique de caractérisation plus générale de quantifier les particules microscopiques depuis sa sensibilité lui permet de mesurer les particules de 50 à 1000 nm. La courbe d&#39;étalonnage montre une corrélation linéaire entre les pores de la membrane en polycarbonate par rapport au diamètre nominal NTA. <table border="1"><tbody><tr><td> Tailles liposomes </td><td> Seuil de détection </td><td> Prévue taille minimale de particules (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Paramètres NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Diagramme du procédé d&#39;extrusion, décrivant la façon dont la pression et le débit d&#39;azote contrôle de l&#39;homogénéité des différents diamètres de liposomes. À la suite d&#39;hydratation liposome, des vésicules unilamellaires de taille différente sont extrudés à travers les pores différentes polycarbonate filtre à membrane à des pressions différentes. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figure 2. Dynamiques de diffusion de lumière (DLS) des données décrivant les tailles quantitatives liposomes après extrusion. (A) Les diagrammes à barres sont représentés à décrire les diamètres des trois échantillons de liposomes. Un étalon de 50 nm de polystyrène (PS) a été utilisé perles comme une référence. Les diamètres moyens des liposomes sont indiqués ci-dessus la barre pour chaque échantillon. L&#39;axe des abscisses décrit les tailles de pores dont les solutions ont été extrudée à travers. L&#39;axe des y décrit le diamètre enregistrée par DLS. Bien que les 30 nm et 100 nm des tailles recorded des valeurs supérieures à leurs tailles de pores tandis que les plus de 400 nm de taille ont enregistré une taille légèrement inférieure, la courbe d&#39;étalonnage (b) montre une corrélation presque linéaire, où l&#39;axe des x exprime les tailles en polycarbonate pores de la membrane, et l&#39;axe des y décrit le enregistrée diamètre des liposomes par DLS. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figure 3. Nanoparticules analyse de suivi (NTA) des données décrivant les tailles des liposomes après extrusion. (A) Les diagrammes à barres représentent le diamètre de chaque échantillon de liposomes. L&#39;axe des abscisses décrit les tailles de pores dont les solutions ont été extrudée à travers. L&#39;axe des y décrit le diamètre de enregistrée par le NTA. Les diamètres moyens des liposomes sont étiquetés au dessus de chaque échantillon. (B) la courbe d&#39;étalonnage NTA présente une corrélation plus linéaire de la courbe d&#39;étalonnage DLS entre les tailles des pores du filtre à membrane par rapport au diamètre enregistrée. L&#39;axe des abscisses décrit les tailles en polycarbonate pores de la membrane. L&#39;axe des y décrit le diamètre nominal de liposome par NTA. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figure 4. Coloration négative microscopie électronique en transmission (TEM) des images illustrant chaque taille des liposomes (500 uM), suivie par extrusion. Carbone Formvar grilles mailles ont été négativement déchargée avant la coloration de l&#39;échantillon, où l&#39;acétate d&#39;uranyle 1% dans de l&#39;eau a été utilisée pour colorer les échantillons avant le séchage et l&#39;imagerie à 34.000 grossissement. Tailles 30, 100 et 400 nm sont clairement distinctes les unes des autres. Le grossissement a été fixé à 25 000 ×. La barre d&#39;échelle représente 0,5 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figure 5. Une expérience du temps bien sûr a été menée avec trois tailles de liposomes. Diffusion de la lumière dynamique (DLS) a été mesurée pour chaque solution de liposomes d&#39;extrusion qui suit immédiatement. Toutes les solutions ont été stockées dans des liposomes 4 °C pendant la nuit. Leurs diamètres ont été enregistrées par les DLS après une nuit d&#39;incubation. Peu ou pas de changement n&#39;a été observé après une période d&#39;incubation de 16 heures.

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Utilisation de la Avestin LiposoFast LF-50 Extrudeuse, nous avons démontré comment les petites entreprises, les liposomes synthétiques sont préparés grâce à un système commandé par la pression. Il est important de noter que les vésicules multilamellaires se forment spontanément à la suite d&#39;hydratation des liposomes, ce qui peut conduire à la production de petites nanoparticules. Ces petites vésicules multilamellaires inévitablement couler à travers la plus grande taille en polycarbonate pores de la ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> Stabilisants 95% </td></tr><tr><td> Haut de méthanol de qualité </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> LiposoFast LF-50 Extrudeuse </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Les phospholipides </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pores en polycarbonate </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 mm de diamètre </td></tr><tr><td> Égoutter disques PE </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 mm de diamètre </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Les liposomes sont des vésicules préparées artificiellement constitués de phospholipides naturels et synthétiques qui sont largement utilisés comme une plate-forme de la membrane cellulaire mimant d&#39;étudier protéine-protéine et protéine-lipide interactions 3, l&#39;administration de médicaments moniteur 4,5, et l&#39;encapsulation 4. Les phospholipides naturellement créer bicouches lipidiques courbes, en se distinguant d&#39;une micelle. 6 liposomes sont traditionnellement classés par taille et le nombre de bicouches, c&#39;est à dire de grandes vésicules unilamellaires (LUV), de petites vésicules unilamellaires (SUV) et des vésicules multilamellaires (MLV) 7. En particulier, la préparation des liposomes homogènes de différentes tailles est important pour l&#39;étude de la courbure membranaire qui joue un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire, endocytose et exocytose, la fusion membranaire, et 8 le trafic de protéines. Plusieurs groupes d&#39;analyser comment les protéines sont utilisés pour moduler les processus qui impliquent courbure de la membrane et donc préparer des liposomes de diamètres &lt;100 - 400nm à étudier leur comportement sur ​​les 3 fonctions cellulaires. D&#39;autres se concentrent sur ​​les liposomes de drogue encapsulation, l&#39;étude des liposomes comme véhicules pour transporter et de livrer une drogue d&#39;intérêts 9. Encapsulation des drogues peut être réalisé comme indiqué lors de la formation des liposomes 9. Notre étape d&#39;extrusion ne devrait pas affecter le médicament encapsulé pour deux raisons, à savoir l&#39;encapsulation des médicaments (1) devrait être atteint avant cette étape et (2) des liposomes devraient conserver leur stabilité naturelle biophysique, en toute sécurité de transport de la drogue dans le cœur aqueux. Ces objectifs de recherche suggèrent en outre la nécessité d&#39;une méthode optimisée pour concevoir stables vésicules lipidiques sub-micronique. Néanmoins, les technologies actuelles de préparation des liposomes (sonication 10, gel-dégel et 10, sédimentation) ne permettent pas de préparation de liposomes avec une surface très incurvée (c.-à-diamètre &lt;100 nm) avec une cohérence et une efficacité élevées 10,5, ce qui limite la biophysique études d&#39;un Emergichamp ng de détection de courbure de membrane. Ici, nous présentons une méthode de préparation robuste pour une variété de liposomes biologiquement pertinentes. Extrusion manuelle à l&#39;aide de gaz étanches seringues et des membranes en polycarbonate 10,5 est une pratique courante, mais l&#39;hétérogénéité est souvent observée lors de l&#39;utilisation des tailles de pores inférieur à 100 nm en raison de raison de la variabilité de la pression manuelle appliquée. On a utilisé une installation d&#39;extrusion de pression constante contrôlée de synthèse pour préparer des liposomes dont les diamètres compris entre 30 et 400 nm. Diffusion de la lumière dynamique (DLS) 10, 11 et microscopie électronique à l&#39;analyse de suivi de nanoparticules (NTA) 12 ont été utilisés pour quantifier les tailles des liposomes comme décrit dans notre protocole, avec du polystyrène du commerce (PS) billes utilisées comme étalon. Une corrélation quasi linéaire a été observée entre les tailles des pores travailleurs et les liposomes déterminées expérimentalement, ce qui indique une grande fidélité de notre pression contrôlée préparation de liposomes a rencontréhod. En outre, nous avons montré que cette méthode de préparation lipidique des vésicules est généralement applicable, indépendamment de diverses tailles des liposomes. Enfin, nous avons aussi démontré dans une étude bien sûr du temps que ces liposomes préparés ont été stables pendant jusqu&#39;à 16 heures. Un représentant de taille nanométrique protocole de préparation des liposomes est démontré ci-dessous.

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Ce protocole décrit un procédé d&#39;extrusion pour la préparation des vésicules lipidiques de tailles submicroniques avec un haut degré d&#39;homogénéité. Cette méthode utilise un système de pression contrôlée avec contrôle des débits d&#39;azote pour la préparation des liposomes. La préparation lipidique<sup&gt; 1,2</sup&gt;, L&#39;extrusion des liposomes, et caractérisation de la taille sera présenté ici.

Constant procédé d&#39;extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

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Bioengineering

23.8K vues.  University of Colorado Boulder. Ce protocole décrit un procédé d'extrusion pour la préparation des vésicules lipidiques de tailles submicroniques avec un haut degré d'homogénéité. Cette méthode utilise un système de pression contrôlée avec contrôle des débits d'azote pour la préparation des liposomes. La préparation lipidique 1,2, L'extrusion des liposomes, et caractérisation de la taille sera présenté ici.

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

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Bio-ingénierie

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un procédé amélioré pour la préparation de collagène de type I de la peau

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Film Extrusion de<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / Gluten de blé Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...