Le réticulum endoplasmique contient un domaine tubulaire dynamique qui interagit continuellement avec le cytosquelette subit un mouvement constant et un réarrangement. La façon dont les ER génèrent et maintiennent cette organisation n’est pas encore pleinement comprise. Ici, nous présentons une matière pratique pour former un modèle d’organelle structurale ascendante pour les ER, qui se compose d’un système membranaires sans protéines solidement supporté qui peut être transféré à des réseaux complexes de nanotubes lipidiques.
L’hydrophilie est un composé organique pour l’énergie. La purification des protéines et l’extraction des protéines ne sont pas nécessaires. Les seuls composants essentiels sont le substrat solide et les phospholipides fournissant le modèle er le plus basique.
Transférez les solutions lipidiques dissoutes dans un flacon inversé de 10 millilitres en forme de poire, ce qui représente une quantité totale de 3 000 microgrammes de lipides et 300 microlitres de chloroforme. Connectez ensuite le flacon à un évaporateur rotatif et placez-le avec une inclinaison de 45 degrés. Faites pivoter le flacon à 24 RPM à l’intérieur d’un bain d’eau à 23 degrés Celsius pendant six heures avec une pression d’air réduite pour enlever lentement et complètement le chloroforme.
Commencez à réduire la pression juste après avoir amorcé la rotation par étapes de 20 kilopascales toutes les deux minutes jusqu’à ce que la pression atteigne 20 kilopascals. Après six heures, arrêter la rotation et augmenter la pression de l’air à nouveau progressivement par des étapes de 20 kilopascales toutes les deux minutes jusqu’à atteindre 100 kilopascals. Retirer le flacon de l’évaporateur rotatif et ajouter trois millilitres de PBS et 30 microlitres de glycérol.
Faites pivoter doucement le flacon pour dissoudre le glycérol. Utilisez un bouchon de verre étanche à l’air pour sceller le flacon contenant les lipides. Conservez le flacon au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour la réhydratation et l’enflure des films lipidiques.
Le lendemain, sonicate les lipides avec un bain d’eau ultrasonique à température ambiante et à la fréquence de 35 kilohertz jusqu’à atteindre une suspension lipidique uniforme légèrement turbide. La sonication peut prendre environ 10 à 30 secondes. La sonication prolongée produit de la chaleur et nuit à la formation vésicale.
Ces étapes donnent lieu à une suspension contenant deux types de structures vésiculaires. Vésicules multilamellar et vésicules unilamellar géantes. Pour le stockage, divisez la suspension lipidique en aliquots de 100 microlitres à l’aide d’un total de 30 tubes de microcentrifugeuse.
Conserver les aliquots dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. La congélation éclair avec de l’azote liquide n’est pas nécessaire. Décongeler la suspension lipidique et transférer une gouttelette de suspension de quatre microlitres sur une lame de microscope en verre propre ou un glissement de couvercle.
Après 20 minutes de dessiccation, la gouttelette s’effondrera en un film circulaire plat de lipides qui est visible à l’œil nu. Réhydratez le film lipidique avec un millilitre de tampon HEPES pendant 3 minutes. Préparez la chambre d’observation avec un dessus ouvert pour permettre l’échange tampon au moyen d’une pipette automatique, qui est nécessaire pour initier la transformation des urgences telle que détaillée dans le protocole de texte.
Après avoir enlevé la dalle PDMS durcie à l’aide d’une spatule, utilisez un scalpel pour couper le cadre dans les dimensions et la géométrie appropriées à l’ouverture disponible au stade du microscope. Les dimensions de 1,5 par 1,5 par 0,5 centimètre conviennent à la plupart des configurations. Mettre le côté lisse du cadre PDMS en contact avec le côté actif de la surface où réside le film d’oxyde d’aluminium et appliquer doucement une pression pour pousser le cadre et la surface les uns contre les autres pour les faire adhérer.
Remplissez immédiatement la chambre d’observation d’un tampon HEPES de calcium. Ne remplissez pas tout le volume de la chambre pour permettre l’ajout des lipides réhydratés dans l’étape suivante. Placez la chambre sur l’étape du microscope confocal.
Transférer le matériau lipidique réhydraté, maintenant une suspension contenant des vésicules géantes, dans la chambre avec une pipette de pâturage en plastique. Attendez 10 à 20 minutes pour laisser les vésicules adhérer au substrat et étendre sur toute la surface. La propagation commence immédiatement après le dépôt des lipides à la surface.
Avant que le lipide ne propage la structure, l’échange tampon doit être fait aussi doucement que possible l’enlèvement rapide ou l’ajout rapide de la mémoire tampon perturbant les structures lipidiques à la surface. Après avoir observé plusieurs écarts lipidiques, retirez lentement le tampon ambiant par pipette automatique. De sorte que seul un mince film tampon reste sur le fond.
Prenez soin d’éviter l’enlèvement rapide. Procéder à l’échange tampon ambiant en remplissant lentement la chambre d’observation avec le tampon HEPES chélateur à l’aide d’une pipette automatique. Évitez l’ajout brusque.
La dernière étape donne des réseaux nanotubulaires dynamiques formés à la suite du chelator induit depinning et de rétractation du DLBM aux vésicules multilamellar. On y voit des micrographes des réseaux de nanotubes obtenus dans le protocole. Dans cette image, les régions rouge vif continu sont la fraction rétractante du DLBM, qui est marquée d’une ligne bleue pointillée.
Montré ici, est un micrographe d’un réseau tubulaire qui a été inversé pour augmenter le contraste. Ici, la réduction de la densité tubulaire est indiquée sur une région membranaire sur une période de trois heures et 20 minutes. La diminution de la densité tubulaire se produit en raison du dépinning progressif suivi de la rétractation du DLBM de la surface.
L’emplacement des points d’épinglant œncissants à base de calcium peut être établi comme les points où les tubes ont des virages terminaux ou aigus. Les virages serrés sont appelés jonctions v ou points de retournement en raison du changement soudain de direction de l’alignement des tubes. Le point d’extrémité représente le terminus du tube qui empêche le tube de se rétracter.
Si la propagation se poursuit pendant de longues périodes, la tension membranaire augmente conduisant à des ruptures. Puisque les lipides sont étiquetés fluorescentement, la rupture peut être directement observée. Un indicateur clé de la rupture est la baisse significative de l’intensité de fluorescence dans la région rompue.
Une déshydratation complète de l’échantillon ou un échange rapide de tampons provoque des perturbations, des ruptures ou des déformations des patchs. La complexité du modèle peut être accumulée en ajoutant des composants associés aux ER tels que les protéines lipidiques. Et ce modèle peut également être impliqué pour étudier l’auto-assemblage, les nanofluidiques, le flux marangoni et les phénomènes de transport.
Chloroforme est toxique et très volatile, il doit toujours être manipulé sous un capot de fumée et avec l’équipement de protection individuelle associé, y compris les gants de laboratoire en acétate de polyvinyle, manteau de laboratoire, et des lunettes de sécurité.
