Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, le cancer Centre allemand de recherche, l&#39;Université de Tübingen, et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (accorder. Pas 0312040). Nous remercions Eduard Hermann de nous aider à automatiser l&#39;analyse des données de la courbe de la force et le Dr Jakob Suckale la lecture attentive de ce manuscrit.

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) 11,12,21 <ol><li> Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions <ol><li> Préparer les tampons suivants à l&#39;avance. <ol><li> Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 137 mM, pH 7,2. </li><li> Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Préparer une solution de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissoudre les lipides suivants dans le chloroforme à une concentration désirée: par exemple, la di-oléyl-phosphatidylcholine (DOPC) à 25 mg / ml, la sphingomyéline (SM) à 25 mg / ml et le taux de cholestérol (Chol) à 10 mg / ml. </li><li> Prenez 18,38 pi de DOPC, 17,10 pi de SM et 11,30 pi de Chol pour faire une solution avec 1 mg de lipides totaux dans un 2: 2: 1 DOPC: rapport molaire Chol: SM. Variez les volumes en conséquence sur la base du concentrations des lipides préparés en 1.1.2. Cependant, maintenir le rapport molaire de 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, que de changer le rapport molaire va changer les caractéristiques de phase de la membrane 25. </li><li> Mélanger la solution complètement au vortex. Ajouter un colorant fluorescent lipidique à 0,05% en moles si l&#39;on veut visualiser la bicouche par un microscope à fluorescence. Remarque: La famille de dialkylcarbocyanines à longue chaîne, comme l&#39;a fait, Dil et DiO couvrent un large éventail de longueurs d&#39;onde et peuvent être idéalement utilisés pour marquer des membranes lipidiques. En variante, des lipides marqués par fluorescence, tels que la phosphatidyléthanolamine ou la rhodamine-BODIPY-cholestérol peuvent être utilisés. Dans tous les cas, la concentration du colorant doit être optimisée en fonction du réglage de la microscopie, en gardant à l&#39;esprit que des concentrations élevées du fluorophore lié au lipide peuvent modifier le comportement des lipides 19. </li><li> Séchez le chloroforme en utilisant du gaz N 2 (ou tout gaz inerte disponibles tels que Ar et He). </li><li> En outre t secil lipide mélange sous vide pendant au moins 1 heure. Note: Si vous rangez ce mélange lipidique, purger l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. Aliquoter excès de lipides-en-chloroforme dans de petits flacons bruns. Séchez-les d&#39;une manière similaire à celle du mélange de lipides, déplacer l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. </li><li> Dissoudre les lipides séchés dans du tampon PBS à une concentration de 10 mg / ml. </li><li> Vortex vigoureusement le mélange pendant environ 20 sec à 1 min pour obtenir une suspension trouble, contenant des vésicules multilamellaires. Assurez-vous que la il n&#39;y a pas de films lipidiques coller aux parois de la fiole. </li><li> Distribuer cette suspension dans 10 aliquotes (1 mg de lipides fait 10 aliquotes). </li><li> Stocker à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Préparation de vésicules unilamellaires Remarque: Les diverses tailles des vésicules unilamellaires peuvent être préparés en utilisant le procédé de sonication ou le procédé d&#39;extrusion. Sonication utilise sound énergie pour agiter le mélange et séparer les couches de la suspension multilamellaire. Ceci est indiqué par le nettoyage de la suspension brumeux. Extrusion force les vésicules multilamellaires de passer à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore définie. <ol><li> Méthode de Sonication <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer le mélange dans de petits (2 ml) flacons de verre plafonnés et sceller avec du Parafilm. </li><li> Soniquer le mélange à la température ambiante dans un bain sonique pendant 10 min ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne clair pour donner de petites vésicules unilamellaires (SUV, en dessous de 50 nm de diamètre). </li></ol></li><li> Extrusion Méthode <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer la suspension dans un tube cryogénique. </li><li> Geler la suspension de lipides en immergeant le tube cryogénique pour quelques secondes dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Décongeler lesuspension lipidique en immergeant le tube cryogénique dans un bain d&#39;eau à température ambiante ou 37 ° C pendant quelques minutes. Répétez les étapes de gel-dégel au moins 10 fois. </li><li> Pour extruder la suspension de lipides, en utilisant une membrane de polycarbonate de 200 nm de taille de pores (d&#39;autres tailles de pores sont disponibles comme, 100 nm ou 400 nm) et un dispositif d&#39;extrusion 26 commerciale. Remarque: Actuellement, il existe deux dispositifs d&#39;extrusion disponibles dans le commerce: une extrudeuse manuel est disponible pour de petits volumes (200 pi à quelques ml). Dans ce cas, l&#39;échantillon est extrudé à travers la membrane en poussant manuellement la suspension avant et en arrière entre deux seringues. Selon le fabricant, devraient être combinées pour atteindre son volume minimum de la mise en place des aliquotes lipidiques. Pour de plus grands volumes (jusqu&#39;à 50 ml) dispositifs plus sophistiqués qui sont utilisés dans la suspension est forcée à travers la membrane de polycarbonate à l&#39;aide de gaz comprimé. SET-UP et extrusion conditions peuvent changer selon le model. Reportez-vous aux instructions du fabricant avant de l&#39;utiliser. Ce protocole se réfère à l&#39;extrudeuse manuelle pour les petits volumes. </li><li> Equilibrer l&#39;extrudeuse dans l&#39;eau en faisant passer l&#39;eau à travers l&#39;extrudeuse. Plonger la membrane dans l&#39;eau. </li><li> Placer la membrane entre les deux pistons, l&#39;assemblage du dispositif et équilibrer dans du tampon, en faisant passer le tampon à travers l&#39;extrudeuse, d&#39;une seringue à l&#39;autre. Cette étape permet de tester en outre la perméabilité du système. En cas de fuite, démonter et le remonter à nouveau changer la membrane. </li><li> Prendre la suspension de lipides en utilisant une seringue de l&#39;extrudeuse («côté sale &#39;). </li><li> Fixer la seringue contenant la suspension de lipides sur une chambre et la seringue vide sur la chambre adverse. </li><li> Poussez la seringue sur une extrémité. Filtrer la solution à travers la membrane et dans la seringue opposée. Ceci est la passe 1 er. </li><li> Passer à travers la membrane pour un total de 31 fois cesque la solution se termine sur la seringue opposée («côté propre»). Remarque: Vérifiez la membrane après extrusion. Si elle a été rompue, puis procédé d&#39;extrusion a échoué et doit être répétée. </li><li> Vider la seringue dans un petit tube. Grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont stables pendant 1-2 jours si elles sont conservées à 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de Mica et Lamelles <ol><li> Laver lamelles de première dans l&#39;eau puis dans l&#39;éthanol. Sécher à l&#39;air. </li><li> Prenez disques de mica et de décoller la couche externe avec du ruban adhésif. </li><li> Fixez le disque de mica sur la lamelle. Colles optiques transparents est optimisé de manière que l&#39;on peut vérifier les bicouches avec un microscope à fluorescence. </li><li> Attacher des cylindres en plastique (diamètre extérieur 2,5 cm, 2 cm de diamètre intérieur et 0,5 cm de hauteur) en utilisant de la colle optique / graisse. Assurez-vous que tout est scellé et qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Utiliser de la graisse quand on veut réutiliser les bouteilles, car ils peuvent être facilement détachés de ee lamelle et lavé. Les dimensions des cylindres en plastique dépendent de la taille du support de cantilever AFM et doivent être ajustés en conséquence. </li></ol></li><li> Dépôt de vésicules unilamellaires sur support solide <ol><li> Pipeter l&#39;ensemble de la solution de liposome directement sur le mica. Ajouter davantage de tampon SLB pour atteindre un volume de 300 pi. </li><li> Ajouter 0,9 pl d&#39;une solution de chlorure de calcium M pour atteindre une concentration finale de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant au moins 10 min. Toujours couvrir les bicouches avec le tampon. Le contact avec les bulles d&#39;air et aériennes détruire. Pendant l&#39;incubation, ajouter plus de mémoire tampon si nécessaire, surtout si incubation à des températures plus élevées. Remarque: Les températures d&#39;incubation varient en fonction des mélanges lipidiques et les phases nécessaires. Le temps d&#39;incubation d&#39;au moins 10 min est nécessaire pour former des bicouches en charge, mais il pourrait être plus long, en fonction de la température et de la composition. </li><li> Lavageavec la bicouche chaude (65 ° C) de 15 à 20 fois SLB tampon pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées. Prenez soin supplémentaire pendant les étapes de lavage pour garder la bicouche sous tampon et pipeter doucement la solution de lavage pour éviter de détruire la bicouche. </li><li> Bicouches frais pris en charge à la température ambiante avant les mesures de l&#39;AFM. Cela est nécessaire pour former les différentes phases de la membrane ainsi que de minimiser la dérive thermique dans l&#39;instrument. </li></ol></li></ol> 2. microscopie à force atomique Mesures 11,12 <ol><li> Imagerie Remarque: Effectuez imagerie par microscopie à force atomique en mode contact ou en mode taraudage. Image supportés bicouches en solution; ne permettent pas de solution à évaporer complètement car cela va détruire les bicouches. Comme on pouvait travailler avec tampon, s&#39;il vous plaît respecter les consignes de sécurité à faire en sorte qu&#39;une partie de l&#39;AFM est protégée contre les déversements de liquides. <ol><li> Sélectionnez un cantilever douce (inférieure à 0,2 N / m constante de ressort est conseillé) et le monter à til AFM. Le choix de la raideur en porte à faux est plus critique pour la spectroscopie de force (et cela sera discuté plus tard). </li><li> Monter l&#39;échantillon sur la scène de l&#39;AFM et assurez-vous que tous les modules de vibration-isolement sont allumés. Attendez au moins 15 minutes pour équilibrer et de réduire la dérive thermique du système. Selon l&#39;AFM set-up, tuning et d&#39;imagerie spécifications peuvent varier. Consultez le manuel du fabricant. </li><li> Approchez l&#39;échantillon avec la pointe de l&#39;AFM jusqu&#39;à ce contact. </li><li> Depuis bicouches lipidiques sont habituellement de 4 nm de hauteur, utiliser le Z-gamme de l&#39;instrument qui donnera la plus haute résolution z (par exemple 1,5 um). </li><li> Sélectionnez une région à l&#39;image. Pour avoir un aperçu de la bicouche lipidique, 50 um x 50 um ou 25 um x 25 um région sera un bon point à l&#39;image de départ. Si les petites fonctionnalités apparaissent, on peut image dans des zones plus petites (10 um x 10 um, ou 2 x 2 pm pm). Le choix de la zone de formation d&#39;image dépend également de la r travailange du scanner piézoélectrique. S&#39;il vous plaît consulter le manuel de l&#39;instrument pour cela. </li><li> Comme bicouches sont très fragiles, régler le point de la pointe AFM de jeu lors de l&#39;imagerie de garder la force au minimum et corriger la dérive thermique, tout en maintenant le contact avec l&#39;échantillon. En mode de contact, de minimiser le point de consigne. En mode tapping, maximiser le point de consigne. </li><li> Traiter les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de mise à niveau de polynômes. Effectue la suppression de la ligne pour les scans qui perdent contact avec la membrane en utilisant le logiciel propriétaire de l&#39;entreprise de fabrication de l&#39;AFM. </li></ol></li><li> Spectroscopie de force <ol><li> Calibrer le cantilever en suivant les instructions selon le protocole du fabricant. L&#39;étalonnage permet la conversion du signal électrique des photodiodes de force (Figure 1B). <ol><li> Calibrer la sensibilité de la pointe pour mesurer la déviation que le mouvement z-piézo (en unités de longueur) à la place du signal électrique en volts. <br /&gt; Remarque: AFM détecte les variations de la déviation du cantilever l&#39;aide d&#39;un laser réfléchi à l&#39;arrière du cantilever. Le laser atteint une photodiode qui peut spatialement détecter la position de la tache laser. Une modification de la déviation du cantilever tel qu&#39;il se plie lors d&#39;un contact avec l&#39;échantillon est détectée par la photodiode en tant que cette &quot;déviation verticale&quot;, ce qui est dans les unités de tension. Étant donné que le cantilever est proposé par l&#39;élément piézo-z, la déviation verticale est en relation avec le mouvement dans la piézo-z. Le rapport entre la déviation verticale et z-mouvement est appelé la sensibilité et la conversion de la tension à la distance. </li><li> Calculer la constante de ressort en porte à faux en utilisant la méthode de fréquence de bruit thermique, habituellement incorporé dans le logiciel de l&#39;AFM. Dans ce procédé, tracer l&#39;amplitude de vibration de bruit par rapport à la fréquence d&#39;oscillation, la création d&#39;un diagramme de densité spectrale de puissance. Cette parcelle se montrer un pic autour de la fréquence de résonance. La fréquence où l&#39;amplitude is la plus grande est la fréquence de résonance. Monter une fonction lorentzienne autour du pic de calculer automatiquement la constante de rappel par le logiciel. Certaines des ressources utiles pour la théorie de la méthode de bruit thermique sont données dans les références 27-30. </li></ol></li><li> Après imager une zone de la bicouche, sélectionner une région de 5 x 5 pm pm dans la bicouche à effectuer la spectroscopie de force. </li><li> Mettre en place l&#39;AFM afin qu&#39;il prenne courbes de force dans une grille de cette région 16 x 16. Cela se traduit par 256 courbes de force par région. L&#39;espace entre deux points voisins devrait être suffisant pour éviter que la surface de la membrane est sondée par un point coïnciderait avec le point suivant. Cela dépend sur le rayon de la pointe. Une distance de 100 nm entre deux points serait idéal. Diviser la région x 5 pm 5 pm en 16 x 16 grille. Selon la taille de la phase, on peut sélectionner une région plus ou moins grande, et ensuite ajuster la taille de la grille en conséquence. </li><li> Ensemble piézo-z de déplacement400 nm. Cela détermine la portée maximale de mouvement de la z-piézo. Il devrait être assez grand pour faire en sorte que le cantilever a complètement rétractée loin de l&#39;échantillon entre les deux mesures. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;approche de 800 nm / s et se rétracter vitesse à 200 nm / sec. Utiliser une vitesse d&#39;approche entre 400 à 6000 nm / s en fonction de la composition de la bicouche lipidique et de la phase à étudier 6,16. </li><li> Après la mise en place de tous les paramètres, acquérir courbes de force, en appuyant sur le bouton &quot;run&quot; du logiciel de l&#39;AFM. </li><li> Enregistrer courbes de force que la force en fonction des courbes de hauteur (une mesure de mouvement z-piézo). Ceci ne tient pas compte de la flexion de la poutre lors du contact avec l&#39;échantillon. Lors de l&#39;étape de traitement de données, le logiciel de l&#39;AFM permet correction pour cantilever pliage pour obtenir la force en fonction des courbes de séparation pointe de l&#39;échantillon (figure 1C), ce qui donnera des valeurs correctes pour l&#39;épaisseur de la bicouche. Les valeurs de correction sont habituellement incorporés dans le calibration, qui est enregistré avec chaque courbe de force. Calculer la séparation pointe-échantillon en soustrayant la déviation verticale du mouvement piézoélectrique à un moment donné. Remarque: Le pic de la courbe de force d&#39;approche (la valeur de la force descend même si le mouvement en porte à faux est toujours sur le cycle d&#39;approche) est la force de rupture de la membrane, tandis que la différence entre la position de ce pic et la position du point où la force commence à se lever à nouveau fournit l&#39;épaisseur de la membrane. </li><li> Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition d&#39;obtenir de bonnes statistiques. Tracer un histogramme des valeurs en utilisant des programmes comme origine ou de MatLab, et monter les histogrammes pour une distribution gaussienne pour obtenir le pic et la largeur de la distribution. </li></ol></li></ol>

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Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L D et L o phases. La phase L o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de 11 Ld. La séparation de la L o L d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circ...

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d&#39;une surface par balayage sur une zone de l&#39;échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine 1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l&#39;échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques - y compris les protéines, l&#39;ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l&#39;analyse des échantillons fixés dans l&#39;air ou de l&#39;état quasi-native dans un liquide 2-5. Outre sa capacité d&#39;imagerie à haute résolution dans l&#39;ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d&#39;interaction (d&#39;adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l&#39;échantillon 5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l&#39;échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu&#39;à ce qu&#39;il perd le contact avec l&#39;échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l&#39;applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d&#39;élasticité pour mesurer la rigidité d&#39;un matériau, et les forces d&#39;adhérence peuvent être obtenues. Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d&#39;un support solide - habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium 7 oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating 8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées 10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions 11 à 15. Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d&#39;approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L&#39;épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force 6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN 6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d&#39;insaturation) et modifié par des agents de la membrane 16 actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué 17 et d&#39;autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d&#39;approche affectent également la force de percée 15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques 11,19, les changements de composition dépendant 12,20, ainsi que des effets d&#39;autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane 21. Le plat d&#39;orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d&#39;autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface 22 et la microscopie à fluorescence 11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes. Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l&#39;AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L o) et désordonnés (L) d phases liquides ont été caractérisées 11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d&#39;autres processus cellulaires 23,24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), 88%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), &#62;99%</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 24x60 mm, 1mm thickness</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>2355036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica blocks</td>
			<td>NSC Mica Exports Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&#160; Always handle mica with gloves or tweezers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch and Die Set</td>
			<td>Precision Brand Products, Inc</td>
			<td>40105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA 88</td>
			<td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Equipment Grease</td>
			<td>Borer Chemie AG</td>
			<td>Glisseal N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome Extruder</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>LiposoFast-Basic</td>
			<td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Bandelin Sonorex Digitec</td>
			<td>DT-31</td>
			<td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Nitride AFM Cantilever&#160;</td>
			<td>Bruker AFM Probes</td>
			<td>DNP-10</td>
			<td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>JPK</td>
			<td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L o L d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l&#39;imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l&#39;épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K vues.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Vidéo: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...