Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de Pittsburgh et le National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] pour RWS. Prise en charge de l&#39;UPCI Facilité Lentiviral a été fournie à RWS par la subvention d&#39;appui du Centre du cancer de la National Institutes of Health [P30 CA047904]. Soutien a également été fourni par le ministère Université de Pittsburgh de pharmacologie et de biologie chimique à la DS. Soutien a également été fourni par l&#39;ESTRO à CV.

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	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

RWS est un consultant scientifique pour Trevigen, Inc Le reste des auteurs déclarent qu&#39;il n&#39;ya pas de conflits d&#39;intérêts.

Il ya plus de 600 citations à l&#39;aide «molecular beacon» le terme pour la détection et la quantification de nombreuses molécules et les activités enzymatiques, y compris l&#39;activité hélicase 6, une activité ADN polymérase 7,8, l&#39;ADN ligase l&#39;activité 9, 10 activité de la télomérase, l&#39;ADN photolyase d&#39;activité de 11 et de l&#39;ADN / ARN hybrides 12, parmi beaucoup d&#39;autres. En plus de l&#39;utilisation de balises moléculair...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Chlorure de potassium </td><td> Pêcheur </td><td> P217-500 </td><td> Pour la biologie moléculaire </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pêcheur </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> BP229-1 </td><td> Pour la biologie moléculaire </td></tr><tr><td> TNT </td><td> Pêcheur </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Sel </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxyde de potassium </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtre </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Produits de dialyse Slide-A-Lyzer </td><td> Percer </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Pêcheur </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille </td><td> Pêcheur </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Microtubes à centrifuger </td><td> Pêcheur </td><td> 05-408-129 </td><td> Noir </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tubes </td><td> Pêcheur </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Kit d&#39;extraction de protéines NucBuster </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Beacons moléculaires </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein dosage colorant reConcentré d&#39;agent </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l&#39;ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires de base à l&#39;aide de réparation excision (BER) des balises moléculaires. Le substrat (balise) est constitué d&#39;un désoxyoligonucléotide contenant une lésion de base unique avec une 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) fragment conjugué à l&#39;extrémité 5 &#39;et un fragment Dabcyl conjugué à l&#39;extrémité 3&#39; de l&#39;oligonucléotide. La balise BER moléculaire est de 43 bases de longueur et la séquence est conçu pour favoriser la formation d&#39;une structure tige-boucle avec 13 nucléotides dans la boucle et 15 paires de bases dans la tige 1,2. Lorsqu&#39;elle est pliée dans cette configuration, le groupe 6-FAM est désactivé par Dabcyl de manière non fluorescent par l&#39;intermédiaire d&#39;Förster résonance de l&#39;énergie de transfert (FRET) 3,4. La lésion est positionné de telle sorte que après le retrait lésion de base et la scission brin restants 5 oligonucléotide de base contenant le groupe 6-FAM est libéré de la tige. Libérer undétachement e des quencher (DABCYL) entraîne une augmentation de la fluorescence qui est proportionnelle au niveau de la réparation de l&#39;ADN. En recueillant de multiples lectures des valeurs de fluorescence, en temps réel d&#39;évaluation de l&#39;activité BER est possible. L&#39;utilisation de la norme quantitative instruments PCR en temps réel permet l&#39;analyse simultanée de nombreux échantillons. La conception de ces balises BER moléculaires, avec une lésion de base unique, est soumise à des analyses cinétiques, la quantification et la validation BER inhibiteur et est adaptable pour la quantification de l&#39;activité réparation de l&#39;ADN dans les tissus et les lysats de cellules tumorales ou avec des protéines purifiées. L&#39;analyse de l&#39;activité BER dans les lysats tumoraux ou de tissus aspire à l&#39;aide de ces balises moléculaires peuvent être applicables à des mesures de biomarqueurs fonctionnels. En outre, l&#39;analyse de l&#39;activité du TEB avec des protéines purifiées en utilisant ce dosage quantitatif fournit un moyen rapide, à haut débit méthode pour la découverte et la validation des inhibiteurs de BER.

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l&#39;ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires. Le test donne des taux d&#39;activité de réparation d&#39;ADN qui se prêtent à l&#39;analyse cinétique et est adaptable pour la quantification de l&#39;activité réparation de l&#39;ADN dans les tissus et les lysats tumoraux ou avec des protéines purifiées.

Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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