Zu RWS Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Pittsburgh-Stiftung und der National Institutes of Health (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] unterstützt. Die Unterstützung für die UPCI Lentivirale Fazilität wurde zu RWS durch die Cancer Center Support Stipendium der National Institutes of Health [P30 CA047904]. Unterstützung wurde auch von der University of Pittsburgh Abteilung für Pharmakologie und Chemische Biologie an DS zur Verfügung gestellt. Unterstützung wurde auch durch ESTRO zu Lebenslauf zur Verfügung gestellt.

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	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. 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Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

RWS ist ein wissenschaftlicher Berater Trevigen, Inc. Die übrigen Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte.

Es gibt über 600 Zitate mit dem Begriff &quot;Molecular Beacon&quot; zur Detektion und Quantifizierung zahlreiche Moleküle und enzymatische Aktivitäten, einschließlich Helikaseaktivität 6, DNA-Polymerase-Aktivität 7,8, DNA-Ligase Aktivität 9, Telomerase-Aktivität 10, 11 DNA-Photolyase Aktivität und DNA / RNA-Hybride 12, unter vielen anderen. Neben der Verwendung von Molecular Beacons für die Messung der DNA-Reparatur oben genannten Aktivitäten, haben wir ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fischer </td><td> P217-500 </td><td> Molekulare Klasse </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> BP229-1 </td><td> Molekulare Klasse </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Fischer </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Salz </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 &amp;mgr; m-Filter </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyseprodukten </td><td> Durchstechen </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Fischer </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Fischer </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fischer </td><td> 05-408-129 </td><td> Schwarz </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tubes </td><td> Fischer </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein Assay Farbstoff re-Konzentrat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons. Das Substrat (Beacon) aus einem Deoxyoligonukleotid enthaltend eine einzelne Base Läsion mit einem 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) konjugiert an die 5&#39;-Ende und ein DABCYL-Rest konjugiert an das 3&#39;-Ende des Oligonukleotids umfaßt. Die BER Molecular Beacon ist 43 Basen Länge und die Sequenz wurde entwickelt, um die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur mit 13 Nukleotiden in der Schleife und 15 Basenpaaren in dem Schaft 1,2 zu präsentieren. In dieser Konfiguration geklappt und der 6-FAM-Einheit durch Dabcyl in einem nicht-fluoreszierenden Weise über Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4 abgeschreckt. Die Läsion ist so, dass die folgenden Basis-Läsion Entfernung und Strangbruch die restlichen 5 Basis-Oligonukleotid mit der 6-FAM-Rest vom Stamm gelöst wird positioniert. Lassen Sie einRunde Ablösung von den Quencher (Dabcyl) führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die im Verhältnis zu der Ebene der DNA-Reparatur. Durch das Sammeln mehrerer liest der Fluoreszenz-Werte, ist eine Echtzeit-Bewertung von BER-Aktivität möglich. Der Einsatz von Standard quantitative Echtzeit-PCR-Instrumente erlaubt die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben. Das Design dieser BER Molecular Beacons mit einer einzigen Basisstation Läsion, zugänglich ist, um kinetische Analysen, Quantifizierung und BER-Inhibitor Validierung und anpassbar ist für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität in Gewebe und Tumor Zelllysaten oder mit gereinigten Proteinen. Die Analyse der BER-Aktivität in Tumorlysaten oder Gewebe saugt Verwendung dieser Molecular Beacons kann für funktionelle Biomarker Messungen. Ferner stellt die Analyse von BER-Aktivität mit gereinigten Proteinen mit diesen quantitativen Assay eine schnelle, High-Throughput-Verfahren zur Identifizierung und Validierung von BER-Inhibitoren.

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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13.5K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.