Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Pittsburgh e pelo National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Suporte para o Mecanismo de UPCI Lentivirus foi fornecido RWS pela Grant Suporte Cancer Center do National Institutes of Health [P30 CA047904]. O suporte também foi fornecida pelo Departamento da Universidade de Pittsburgh de Farmacologia e Biologia Química para DS. Foi também prestado apoio por ESTRO para CV.

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	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. 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T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

RWS é consultor científico Trevigen, Inc. O resto dos autores declaram que não existem conflitos de interesse.

Existem mais de 600 citações usando &quot;farol molecular&quot; o prazo para detectar e quantificar as inúmeras moléculas e as atividades enzimáticas, incluindo atividade de helicase 6, atividade DNA polimerase 7,8, a atividade DNA ligase 9, a atividade da telomerase 10, a atividade DNA fotoliase 11 e DNA / RNA híbridos 12, entre muitos outros. Além da utilização de balizas molecular para a medição das actividades de ADN de reparação listados...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Pescador </td><td> P217-500 </td><td> Grau molecular </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> BP229-1 </td><td> Grau molecular </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Pescador </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Solução </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Sal </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de Potássio </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtro </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Produtos de diálise </td><td> Perfurar </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Pescador </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Pescador </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL </td><td> Pescador </td><td> 05-408-129 </td><td> Preto </td></tr><tr><td> 15 mL Falcon Tubos </td><td> Pescador </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Kit de Extração Protéica </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Beacons Molecular </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteína BioRad ensaio corante reconcentrado de agente </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados ​​utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular. O substrato (farol) é composto de um deoxyoligonucleotide contendo uma lesão de uma única base com um 6-Carboxifluoresceína (6-FAM) porção conjugada com o extremo 5 &#39;e uma porção DABCYL conjugada com a extremidade 3&#39; do oligonucleótido. O RIC farol molecular é de 43 bases de comprimento ea sequência foi concebida para promover a formação de uma estrutura de haste loop-com 13 nucleótidos no loop e 15 pares de bases no 1,2-tronco. Quando dobrada nesta configuração da porção 6-FAM é extinta por DABCYL de uma maneira não fluorescente via Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 3,4. A lesão é posicionada de tal modo que a remoção da lesão seguinte base e cisão vertente o oligonucleótido de base restante 5 contendo a porção 6-FAM é libertado a partir da haste. Solte umadescolamento nd do (DABCYL) Quencher resulta em um aumento de fluorescência que é proporcional ao nível de reparo do DNA. Ao coletar várias leituras dos valores de fluorescência, em tempo real avaliação da atividade da RIC é possível. O uso de padrão quantitativo PCR em tempo real instrumentos permite a análise simultânea de várias amostras. O desenho destes balizas BER moleculares, com uma lesão de uma única base, é passível de análises cinéticos, quantificação BER e validação inibidor e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecidos e os lisados ​​de células de tumor ou com proteínas purificadas. A análise da actividade BER em lisados ​​de tumor ou tecido aspira usando estas balizas molecular pode ser aplicável a medições de biomarcadores funcionais. Além disso, a análise da actividade BER com proteínas purificadas usando este ensaio quantitativo fornece uma rápida, o método de alto rendimento para a descoberta e validação de inibidores de BER.

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular