Ce protocole bien défini examine la migration primaire de la crête neurale chez les mammifères. Nous utilisons la migration primaire de crête neurale afin d’étudier des défauts de naissance qui affectent la crête neurale. Cette approche nous permet d’examiner de plus près les cellules de crête neurale à mesure qu’elles sortent de la plaque neurale.
L’essai pour des comportements cellulaires dans les tissus portant des allures mutantes de gènes ou après traitement pharmaceutique, permet le criblage de santé pour les effets du traitement de drogue ou des changements environnementaux pendant le développement embryonnaire. Une approche similaire peut être utilisée pour étudier les cellules de crête neuronale qui migrent vers le cœur ou l’intestin ou pour étudier les cellules tumorales métastatiques. Deviner l’anatomie du droit embryonnaire est difficile.
Ses tissus changent très rapidement au cours du développement précoce. Nous suggérons de pratiquer la microdissection avant d’entreprendre une grande expérience. Parce que les embryons sont vivants et tridimensionnels, la vitesse et la précision sont cruciales.
Au jour embryonnaire 8.5, utilisez des outils stériles et des solutions pour récolter l’utérus dans un récipient de PBS glacé. Couper le mésometrium pour séparer chaque embryon. Disséquez soigneusement l’utérus, séparant chaque gonflement decidual.
La récolte de l’embryon au bon stade de développement est essentielle à la réduction de la variabilité et à l’augmentation du succès de l’adhérence de l’explantation à la matrice ainsi qu’à la migration cellulaire. Faites glisser les forceps entre la couche musculaire et le tissucidue de l’embryon et utilisez une deuxième paire de forceps pour enlever la couche musculaire. Utilisez les forceps pour percer le decidua sur les bords de la traction mésometriale et utilisez la deuxième paire de forceps pour déchirer le tissu ouvert perpendiculairement à la traction.
Peler le tissu decidual avec les forceps pour visualiser la membrane ricarts avant d’enlever soigneusement la membrane. Le sak jaune viscéral deviendra visible et l’embryon sera observé à l’intérieur. Retirer le sak jaune viscéral et l’anion, et positionner l’embryon pour permettre la visualisation du pli de la tête.
Couper le pli de la tête au-dessus du cœur et gratter le mésoderm sous-jacent pour obtenir une plaque neurale propre. Les bordures des plaques neurales devraient alors être disséquées. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférer la plaque neurale disséquée sur un plat recouvert d’hydrogel rempli d’une crête neurale conditionnée moyenne et faire tourbillonner doucement le plat pour positionner la plaque neurale au milieu du puits.
Puis incuber la plaque neurale à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la période expérimentale appropriée. À 24 heures après l’explantation, placez le plat de culture tissulaire dans le porte-spécimen d’un microscope à contraste du visage, et collez le couvercle de la plaque et l’aiguille de dioxyde de carbone pour éviter de trembler lors de l’acquisition de plusieurs puits. Ensuite, concentrez-vous sur les cellules de crête neurale crânienne à un grossissement 10 fois avec un anneau de phase correspondant dans le condenseur sélectionné.
Pour quantifier la capacité migratoire de la cellule de crête neurale, réglez le microscope pour acquérir un cadre toutes les cinq minutes à un grossissement 10 fois. Pour quantifier la morphologie cellulaire, réglez le microscope pour acquérir un cadre par minute à un grossissement 40 fois. Pour quantifier la dynamique de lamellipodia, réglez le microscope pour acquérir un cadre toutes les 10 secondes pendant 10 minutes à un grossissement 40 fois.
Pour l’imagerie multi-puits, réglez le stade mécanique pour vous déplacer entre les positions d’intérêt X et Y sélectionnées, et confirmez que les cellules de crête neurale crânienne sont au point et que les positions de scène sont correctes. Cliquez ensuite sur acquérir pour démarrer l’imagerie time lapse. Pour le suivi d’une seule cellule, ouvrez l’image J et importez les données sous forme de fichiers tiff stack.
Modifiez l’orientation et la luminosité et les niveaux de contraste et cliquez sur analyser et définir l’échelle pour calibrer les fichiers point stk en micromètres pixel selon les paramètres du microscope. Cliquez sur plug-ins, suivi et suivi manuel pour ouvrir l’image J plugin de suivi cellulaire manuel et sélectionnez ajouter piste pour commencer le suivi cellulaire. Suivez ensuite les cellules à travers tous les cadres de films en accéléré en utilisant le noyau comme point de référence.
Pour évaluer la capacité migratoire de la crête neuronale, ouvrez un logiciel d’analyse de migration approprié et cliquez sur l’onglet données d’importation pour importer les données de suivi cellulaire sous forme de fichier point txt. Dans le cadre d’ensembles de données et d’initialisation, sélectionnez le nombre de tranches ou d’images à analyser et définissez l’étalonnage X Y et l’intervalle de temps entre les images. Sélectionnez appliquer les paramètres pour enregistrer les paramètres.
Sélectionnez ensuite le symbole de données de l’intrigue pour former des tracés de trajectoire et sélectionnez le symbole statistique pour quantifier les mesures de distance et de vitesse. Pour quantifier la zone et la circularité des cellules de crête neurale, ouvrir l’image J et sous analyser et définir les mesures, cliquez pour sélectionner les paramètres de forme cellulaire, la zone cellulaire, le périmètre et le descripteur de forme. Utilisez l’outil de sélection des mains libres pour dessiner manuellement un contour autour de chaque cellule en utilisant les limites de la membrane cellulaire comme guide.
Appuyez sur les touches Control+B sur le clavier pour maintenir la superposition du contour de la cellule sur l’image et répéter pour chaque cellule sur chaque laps de temps cadre. Cliquez sur la superposition d’images et pour atteindre le gestionnaire d’intérêt et sélectionner les cellules d’intérêt. Cliquez ensuite sur mesurer pour obtenir les valeurs des paramètres de forme cellulaire sélectionnés d’intérêt.
Dans les 24 heures suivant l’explantation et la culture, une région de la crête neurale crânienne épithéliale pré-migratrice peut clairement être observée pour entourer l’explantation de plaque neurale. En outre, une sous-population de cellules de crête neurale aura subi la transition épithéliale à mésenchymale et semblera entièrement mésenchymal. Les cultures explantées plaquées sur un hydrogel ou une fibronectine à base de matrice extracellulaire forment des structures explantatives similaires composées de crêtes neurales prémigratoires de plaques neurales et de populations de cellules de crête neurales migratrices.
Toutefois, les explantations plaquées sur la fibronectine produisent des cellules avec la lamellipodia plus proéminente au bord d’attaque cellulaire apparemment plus polarisé dans le sens de la migration. La microscopie time lapse permet le suivi des coordonnées X, Y des cellules individuelles et l’analyse de la migration des cellules de crête neurale et l’analyse de la dynamique de morphologie des cellules de crête neurale crânienne au fil du temps. En décrivant les membranes cellulaires individuelles, les mesures de la zone cellulaire et du périmètre peuvent être calculées à partir de tous les cadres des films afin de permettre la quantification ultérieure de la zone cellulaire et la circularité des individus et des groupes de cellules.
Notez qu’à mesure que les cellules migrent loin de l’explantation, la zone cellulaire augmente considérablement tandis que la circularité des cellules reste relativement constante, ce qui suggère qu’à mesure que les cellules s’éloignent du bord épithélial et perdent des contacts cellulaires, elles montrent une zone de propagation cellulaire accrue. Portez une attention particulière à racler le mésoderm sous-jacent pour obtenir une plaque neurale propre, car cela favorise la migration des cellules de crête neurale loin du tissu. Beaucoup d’autres techniques telles que l’immunostaining, rtpcr, ou l’analyse de cellules simples peuvent être exécutées pour analyser différentes protéines ou gènes d’intérêt parmi différentes populations de cellules de culture.
Nous nous intéressons aux rouleaux de développement de certains gènes clés du neuroblastome qui pourraient être impliqués dans la migration des cellules de crête neuronale et dans l’utilisation de cette approche pour étudier les gènes des maladies humaines.
