Ce travail a été soutenu par la NSF subvention IOS 1121692, et par l&#39;Université de Washington Research Foundation.

1. Follection volatile <ol><li> Dans cet exemple, nous utilisons les échantillons volatils de M. fleurs lewisii - un natif de fleurs sauvages alpines en Californie. Volatils sont recueillis à l&#39;aide des méthodes dynamiques de sorption selon Riffell et al. 14. En bref, cette méthode utilise un système en boucle fermée piégeage où les fleurs sont enfermées dans un sac en téflon. En utilisant une pompe à vide inerte, l&#39;air autour des fleurs est aspiré à travers un «piège» composé d&#39;une pipette Pasteur rempli de Porapak Q matrice. L&#39;air de retour de la pompe est filtrée par le charbon actif. Après une période de temps prescrite, dans notre cas, 24 h, le Porapak Q matrice est éluée avec un solvant non polaire, généralement hexane, pour recueillir l&#39;extrait concentré. L&#39;extrait est ensuite stocké dans -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse. Si nécessaire, les échantillons peuvent être concentrée avant l&#39;analyse sous un courant d&#39;azote gazeux. Sauf si l&#39;échantillon est déjà bien caractérisé, exécutez une aliquote de l&#39;un parchromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) pour identifier les composants volatils avant d&#39;utiliser l&#39;échantillon. </li></ol> 2. Préparation électrophysiologique <ol><li> Couper environ 1 cm de l&#39;extrémité d&#39;une pointe de pipette 1000 pi. Placez un bourdon (Bombus impatiens) dans la base de la pointe de pipette et poussez doucement vers l&#39;extrémité opposée de la pointe jusqu&#39;à ce que la tête est exposée. </li><li> Faire fondre la cire dentaire et la façonner autour de la tête exposée, en s&#39;assurant que les adhère cire sur les yeux composés de sécurité et de faire la tête de l&#39;abeille complètement immobile. Soyez sûr de ne pas obtenir la cire sur l&#39;antenne de l&#39;abeille. </li><li> Une fois que la tête est sûr, faire un carré, en forme de fenêtre, incision dans la capsule tête à l&#39;aide d&#39;un rasoir à lame coupe-circuit ou la taille adéquate scalpel pour couper les cuticules. Avec la lame de coupe-, à partir de la face dorsale de la tête de capsule, immédiatement derrière l&#39;antenne et une adjacente à des yeux à facettes. Couperune ligne droite et d&#39;un composé oeil à l&#39;oeil controlatéral composé. Après avoir coupé une ligne droite à l&#39;œil composé contraire, commencer à faire une incision dorsale jusqu&#39;à ce que les courbes de la capsule céphalique et se termine près de son thorax. À ce stade, commencer à couper vers l&#39;extrémité opposée de la capsule céphalique. Enfin, une fois qu&#39;une ligne a été coupée à l&#39;extrémité opposée, couper une ligne de retour à la position de départ de l&#39;incision initiale. Il est important de supprimer la cuticule qui est adjacente à l&#39;antenne, car cela empêcher l&#39;insertion de l&#39;électrode. </li><li> Une fois que la cuticule est coupé, utiliser une paire de pinces pour enlever la cuticule des abeilles, qui devrait ensuite exposer le cerveau de l&#39;abeille et, plus important encore, les lobes antennaires. Commencer immédiatement superfusing le cerveau des insectes avec une solution saline, de sorte que le cerveau ne soit pas desséché. Après le cerveau est exposé, soigneusement d&#39;utiliser une paire de pinces très fines pour retirer la gaine périneurale immédiatement au-dessus des lobes antennaires. Soyez très prudent de ne pasperforation du cerveau de l&#39;abeille avec la pince. </li></ol> 3. Chromatographie en phase gazeuse avec Multi-canal d&#39;enregistrement <ol><li> L&#39;abeille &quot;préparation&quot; - fixé dans un tube avec son cerveau exposé - est maintenant prêt pour l&#39;enregistrement électrophysiologique. Placer l&#39;abeille dans une pince, fixé sur un support magnétique qui se trouve sur une table pneumatique. </li><li> Fixer une poche de perfusion, régulateur de débit et un tube (rempli d&#39;une solution saline d&#39;insecte), de sorte que la solution saline superfuses continu du cerveau. </li><li> L&#39;aide d&#39;un micromanipulateur, insertareference électrode, faite de fil de tungstène, dans l&#39;œil de l&#39;abeille. </li><li> À l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur séparée, insérer le électrode à canaux multiples, par exemple un fil enroulé tétrode, ou de silicium multi-canaux d&#39;électrode (Technologies NeuroNexus), dans les lobes antennaires de l&#39;abeille. Cette électrode est reliée à un pré-amplificateur tel que le S-3 TDT système de série au processeur Z BioAmp Z-bus du système TDT. La sortie de la Chro gazdétecteur matogram par l&#39;intermédiaire d&#39;un câble blindé BNC peut être interfacé avec le système d&#39;acquisition de données et amplificateur de telle sorte que le signal à la fois nerveuse et GC est synchronisé. </li><li> Attendre environ 30-60 minutes pour les enregistrements de neurones pour se stabiliser. Une fois l&#39;activité spontanée et de la forme d&#39;onde d&#39;unités dans les canaux d&#39;enregistrement sont devenues compatibles, utilisez une seringue odeur de stimuler l&#39;abeille et observer la réponse des canaux d&#39;enregistrement à l&#39;odeur. </li><li> Enregistrer des pointes extracellulaires de neurones auto-seuillage par les canaux d&#39;enregistrement par 3,5 à 5 sigma du signal sur les canaux d&#39;enregistrement individuels. Seuillage manuel ne peut être exigée pour certains canaux pour éviter toute contamination du bruit électrique. Les potentiels d&#39;action des neurones apparaissent comme des pointes de tension dans le canal d&#39;enregistrement. Lorsque la tension de la chaîne dépasse le seuil, le système de mémoire tampon et permet d&#39;économiser les quelques millisecondes avant et après le franchissement du seuil, ce qui takinga instantané de la forme d&#39;onde, ou une pointe. </li><li> Juste à côté de la table de l&#39;air est le GC. Avant d&#39;injecter l&#39;extrait floral dans la GC, assurez-vous que la méthode de la rampe de température de la piste de GC est correcte. Dans notre exemple, nous utilisons une méthode de la température de départ à 50 ° C pendant 4 min suivie d&#39;une augmentation de la température à une vitesse de 10 ° C / min. à 220 ° C, à laquelle nous tenons la GC pour un autre 6 min. Nous utilisons une colonne DB-5 GC (J &amp; W Scientific, Folsom, CA, USA), avec l&#39;hélium comme gaz porteur. L&#39;entrée est sans division, avec une température réglée à 200 ° C. La température du détecteur à ionisation de flamme est réglée à 230 ° C. </li><li> Injecter l&#39;échantillon extrait de l&#39;espace de tête florale dans le port d&#39;injection chauffée de la GC pour libérer les composés volatils adsorbés dans la colonne GC. L&#39;effluent de la colonne est divisée 1:1 entre le détecteur à ionisation de flamme (FID) et l&#39;antenne d&#39;abeille à l&#39;aide d&#39;un verre &quot;Y&quot; (J &amp; W Scientific). Commencez recording de l&#39;électrode comme vous injecter un échantillon dans la GC. </li><li> Après la course GC est terminée, laisser reposer la préparation pendant 5 à 15 min. Ensuite, soit injecter un autre échantillon dans la GC ou de stimuler la préparation à l&#39;aide simples composés volatils ou mélanges de composés. Dans ce dernier mode de stimulation de la préparation, des impulsions d&#39;air à partir d&#39;un flux d&#39;air constant est dévié à travers une seringue en verre contenant un morceau de papier filtre sur laquelle les composés ont été déposés. Le stimulus d&#39;odeur a été puisées au moyen d&#39;une électrovanne à commande contrôlée par le logiciel. </li><li> Si l&#39;activité de l&#39;unité s&#39;arrête soudainement ou modifications, consultez le goutte à goutte une solution saline et laissez reposer la préparation pendant 15 min. Si l&#39;activité spontanée ne retrouve pas son niveau précédent, puis la préparation doit être jeté et une autre abeille utilisés s&#39;ils sont disponibles. </li><li> Après l&#39;expérience, le cerveau fixer avec 5% de formol pendant 20 min avec la sonde reste dans le tissu. Ensuite, le cerveau d&#39;acciseet placez-le dans du glutaraldéhyde à 2% pendant 4 heures, puis faire une série d&#39;éthanol à la déshydratation et effacer le cerveau avec du salicylate de méthyle. Sur la base de la fixation et de la compensation du tissu, les emplacements de la AL où les électrodes perforé le tissu doit être clairement visible par microscopie confocale. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Analyser les données recueillies après l&#39;expérience pour séparer et identifier les unités de disques de neurones. Utiliser des logiciels typiques (trieuse Hors ligne, MClust et SClust) aux formes d&#39;onde distincte, ou «pointes», basé sur des formes pointe, tels que l&#39;amplitude crête ou de vallée, pic demi-largeur, etc, ou des mesures réduites (composantes principales) 17 , 18 (figure 2). Utilisez uniquement les grappes de pointes qui se sont séparés dans l&#39;espace tridimensionnel (PC1-PC3) et sont statistiquement différents entre eux (ANOVA multivariée, p &lt;0,05) (figure 2) pour une analyse plus approfondie. S&#39;il vous plaît se référer àcitation # s 17-19 pour une description complète de l&#39;enregistrement tétrode et pointes de tri des méthodologies. </li><li> Horodater les pointes dans chaque grappe, et d&#39;exporter ces données pour l&#39;analyse en utilisant MATLAB ou Neuroexplorer (Technologies Nex, Winston-Salem, Caroline du Nord) pour créer des parcelles de trame et les réponses cadence de tir (figures 2, 3A). </li><li> Identifier les temps de rétention des composés volatils à partir des données enregistrées simultanément GC. Utiliser les temps de rétention des substances volatiles, déterminées par le sommet du pic du chromatogramme, pour examiner les réponses unitaires à ces points dans le temps. </li><li> Pour examiner les réponses des unités individuelles à travers la course GC, ben le nombre de pics dans les intervalles 100 ms et d&#39;examiner l&#39;évolution temporelle de tirer des réponses de taux par rapport à la durée de rétention d&#39;élution volatiles. Le regroupement des pointes à 100 ms intervalles fournit suffisamment de détails, ou signal, à propos de l&#39;évolution temporelle de la réponse neuronale à une substance odorante éluant de la GC. </li><li> Pour exaextraire les réactions des populations aux substances volatiles élution différents, intégrer les réponses de fréquence de décharge des unités individuelles au cours d&#39;une fenêtre d&#39;échantillonnage 3 sec, 1,5 sec avant et après 1,5 secondes, le temps de rétention du volatile (figure 3). Cette période de temps est typique de la durée d&#39;une élution volatile de la GC. Nous montrons tir réponses tarifaires des unités de codage couleur entre eux (le rouge est une réponse tir à haut débit, le bleu est une réponse faible) et en les disposant comme une matrice des activités à chaque ligne représentant la réponse d&#39;ensemble à l&#39;effluent GC (colonnes) ( Figure 3). </li></ol>

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M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+(Brassicaceae)+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+(Coleoptera,+Curculionidae).">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li><li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb.">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li><li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Olfactif des insectes à médiation comportements conduire de nombreux processus différents, y compris la reproduction, la sélection du site d&#39;accueil, et l&#39;identification des ressources alimentaires appropriées. L&#39;étude de ces processus nécessite la capacité d&#39;identifier les composés volatils émis par la source, ainsi que la capacité d&#39;identifier les composés qui sont médiatrices les comportements. Pour compliquer les choses, c&#39;est que les odeurs sont composées de quelques dizaines ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;objet </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Porapak Q Type 80-100 mesh </td><td> Eaux </td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td> Sacs Four Reynolds </td><td> Reynolds </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td> Agilent </td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> Colonne GC </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA, USA </td><td> DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 um) </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;analyse de gaz vecteur hélium </td><td> Praxair </td><td> HE K </td><td> 1 cc / min </td></tr><tr><td> 16-canal électrode de silicium </td><td> NeuroNexus Technologies </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td> NiCr fil fin, 0,012 mm de diamètre) </td><td> Sandvik Kanthal HP Reid </td><td> PX000004 </td><td> Pour faire tétrodes personnalisés et stereotrodes </td></tr><tr><td> Pré-amplificateur </td><td> Tucker-Davis Système </td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur </td><td> Tucker-Davis Système </td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acquisition de données système - OpenEx Suite </td><td> Tucker-Davis Système </td><td></td><td></td></tr><tr><td> En ligne spike-tri logiciels - SpikePac </td><td> Tucker-Davis Système </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hors ligne spike-tri logiciels - Mclust Spike-tri boîte à outils </td><td> David Redish, Department of Neuroscience, Universitédu Minnesota </td><td> Téléchargement gratuit à <a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> MATLAB boîte à outils </td></tr></tbody></table>

identification of olfactory volatiles using gas chromatography-multi-unit recordings (gcmr) in the insect antennal lobe

Tous les organismes vivent dans un monde plein de stimuli sensoriels qui déterminent leur réponse comportementale et physiologique à leur environnement. L&#39;olfaction est particulièrement important chez les insectes, qui utilisent leurs systèmes olfactifs à répondre et à discriminer entre les stimuli, d&#39;odeurs complexes. Ces odeurs susciter des comportements qui interviennent dans des processus tels que la reproduction et la sélection de l&#39;habitat 1-3. En outre, la détection chimique par la médiation des comportements des insectes qui sont très importants pour l&#39;agriculture et la santé humaine, y compris la pollinisation 4-6, herbivores de 7 cultures vivrières, et la transmission de la maladie de 8,9. Identification des signaux olfactifs et leur rôle dans le comportement des insectes est donc important de comprendre les processus écologiques et les ressources alimentaires de l&#39;homme et du bien-être. À ce jour, l&#39;identification des substances volatiles qui animent le comportement des insectes a été difficile et souvent fastidieux. Les techniques actuelles comprennentd&#39;enregistrement gaz électroantennogramme chromatographie couplée (GC-EAG) et chromatographie en phase gazeuse couplée simples enregistrements sensille (GC-SSR) 10-12. Ces techniques s&#39;est avéré crucial dans l&#39;identification de composés bioactifs. Nous avons développé une méthode qui utilise la chromatographie gazeuse couplée à canaux multiples enregistrements électrophysiologiques (appelé «GCMR &#39;) de neurones dans le lobe antennaire (AL; primaire de l&#39;insecte centre olfactif) 13,14. Cette technique state-of-the-art nous permet d&#39;explorer la manière dont l&#39;information odeur est représenté dans le cerveau des insectes. En outre, parce que les réponses neuronales aux odeurs à ce niveau de traitement en raison olfactive sont très sensibles au degré de convergence des neurones récepteurs de l&#39;antenne en neurones AL, AL enregistrements permettra la détection des constituants actifs des odeurs naturelles de manière efficace et avec une grande sensibilité. Nous décrivons ici GCMR et donner un exemple de son utilisation. Plusieurs étapes générales sont impliqués dans la détection des substances volatiles bioactives et de réponse aux insectes. Volatiles doivent d&#39;abord être recueillies auprès de sources d&#39;intérêt (dans cet exemple, nous utilisons des fleurs du genre Mimulus (Phyrmaceae)) et caractérisé, au besoin en utilisant des techniques de GC-MS 14-16. Les insectes sont préparés pour l&#39;étude en utilisant un minimum de dissection, après quoi, une électrode d&#39;enregistrement est inséré dans le lobe antennaire multi-canal et l&#39;enregistrement commence neuronal. Post-traitement des données neuronales qui révèle alors odorants particuliers entraîner des réactions neurales par le système nerveux des insectes. Bien que l&#39;exemple que nous présentons ici est spécifique aux études de pollinisation, GCMR peut être étendu à un large éventail d&#39;organismes d&#39;étude et des sources volatiles. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour l&#39;identification de substances odorantes attirant ou repoussant les insectes vecteurs et les ravageurs des cultures. En outre, GCMR peut également être utilisé pour identifier attractifs pour les insectes bénéfiques, tels que pollinators. La technique peut être étendue à des non-sujets insectes ainsi.

Dans l&#39;essai à l&#39;aide du GCMR M. lewisii parfum floral, nous injectons 3 pi de l&#39;extrait dans le CG. Le nombre total de substances volatiles élution à travers la GC est généralement 60-70 volatiles. Le parfum de M. lewisii est constitué en majorité de monoterpenoids, y compris β-myrcène (acyclique) et α-pinène, le reste de l&#39;odeur composée de six-carbone volatiles, tels que le 2-hexanol, et qui comprennent des sesquiterpénoïdes &lt;1% de l&#39;espace de t...

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Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Signaux olfactifs médiation de nombreux comportements différents chez les insectes, et sont des mélanges souvent complexes composées de quelques dizaines à quelques centaines de composés volatils. Chromatographie en phase gazeuse avec multi-canal d&#39;enregistrement dans le lobe antennaire des insectes, nous décrivons une méthode pour l&#39;identification de composés bioactifs.

L&#39;identification des composés volatils olfactifs chromatographie en phase gazeuse-à logements multiples enregistrements (GCMR) dans le lobe antennaire des insectes

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

identification-olfactory-volatiles-using-gas-chromatography-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

14.2K vues.  University of Washington. Signaux olfactifs médiation de nombreux comportements différents chez les insectes, et sont des mélanges souvent complexes composées de quelques dizaines à quelques centaines de composés volatils. Chromatographie en phase gazeuse avec multi-canal d'enregistrement dans le lobe antennaire des insectes, nous décrivons une méthode pour l'identification de composés bioactifs.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

Utilisation d&#39;insectes électroantennogramme capteurs sur autonome Robots Recherches olfactives

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de<em&gt; In Vivo</em&gt; intracellulaires Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor sources is an essential task for organism survival. Insects are well-studied organisms with regard to odor tracking, and their behavioral strategies have been applied to mobile robots for evaluation. This "bottom-up" approach is a fundamental way to develop biomimetic robots; however, the biological analyses and the modeling of behavioral mechanisms are still ongoing. Therefore, it is still unknown how such a biological system actually works as the controller of a robotic platform. To answer this question, we have developed an insect-controlled robot in which a male adult silkmoth (Bombyx mori) drives a robot car in response to odor stimuli; this can be regarded as a prototype of a future insect-mimetic robot. In the cockpit of the robot, a tethered silkmoth walked on an air-supported ball and an optical sensor measured the ball rotations. These rotations were translated into the movement of the two-wheeled robot. The advantage of this "hybrid" approach is that experimenters can manipulate any parameter of the robot, which enables the evaluation of the odor-tracking capability of insects and provides useful suggestions for robotic odor-tracking. Furthermore, these manipulations are non-invasive ways to alter the sensory-motor relationship of a pilot insect and will be a useful technique for understanding adaptive behaviors.

The capability to localize an odor source is necessary for insect survival and is expected to be applicable to artificial odor-tracking. The insect-controlled robot is driven by an actual silkmoth and enables us to evaluate the odor-tracking capability of insects through a robotic platform.

Robot Insecte contrôlée: Une plate-forme de robot mobile pour évaluer la capacité Odor-suivi d&#39;un insecte

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Investigating Object Representations in the Macaque Dorsal Visual Stream Using Single-unit Recordings

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined curved surfaces, and images of real-world objects (with and without disparity) in a similar manner as described in the ventral visual stream. In addition, parieto-frontal areas are believed to convert visual object information into appropriate motor outputs, such as the pre-shaping of the hand during grasping. To better characterize object selectivity in the cortical network involved in visuomotor transformations, we provide a battery of tests intended to analyze the visual object selectivity of neurons in parieto-frontal regions.

A detailed protocol to analyze object selectivity of parieto-frontal neurons involved in visuomotor transformations is presented.

Enquête sur les représentations d’objet dans le flux de Visual dorsale Macaque en utilisant des enregistrements unitaires

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined ...