Nous remercions le Comprehensive Cancer Center analytique cytométrie de base installation Ohio State University, en particulier Katrina Moore, de l&#39;assistance technique à l&#39;analyse FACS. En outre, nous reconnaissons le Dr William Pu et son groupe pour leurs connaissances scientifiques. Ce travail a été soutenu par le NIH HL091878 (JL) et le Centre de cardiologie à l&#39;Hôpital pour enfants de Nationwide.

1 Préparation de l&#39;équipement et Solutions <ol><li> Stériliser les outils de dissection - ciseaux de tissus fins à extraire les cœurs adultes et deux pinces fines pour la dissection de la région valvulaire - à l&#39;autoclave dans un bac de l&#39;appareil visé. Pulvériser outils avec 70% d&#39;éthanol (EtOH) avant la dissection. </li><li> Préparer les solutions immédiatement avant l&#39;expérience et stériliser les solutions en les faisant passer à travers un filtre stérile de 0,2 pm. Conserver les solutions sur la glace jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Tampon de dissociation stérile (15 ml au total / échantillon). Mélanger 1,2 ml de collagénase IV, 300 pi de 2,5% de trypsine et 150 sérum de poussin ul. Amener le volume à 15 ml avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> Tri tampon stérile (12 ml de total). Mélanger l&#39;acide 25 ul de 0,5 M éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 12 pi de DNase I (RNase). Amener le volume à 12 ml avec de l&#39;HBSS. </li><li> CVE Culture, des Médias. Mix Les gro endothélialeswth médias selon les instructions du fabricant (voir matériau tableur) en ajoutant les composants aliquotée du kit à 500 ml d&#39;EBM2 médias. </li><li> GFP négative culture des médias (médias de cellules non-endothéliales). Mélanger 445 ml de milieu 199 1x avec 5 ml de pénicilline / streptomycine (stylo / angine) (1% concentration finale) et 50 ml de FBS (10% de concentration finale). </li></ol></li></ol> 2 Dissection de la région valvulaire de souris adultes et les embryons de E14.5 <ul><li> Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés et exécutés conformément aux directives recherche de l&#39;Hôpital Institut IACUC de la Nationwide Children. </li><li> Souris Tie-2-GFP ont été achetés auprès de Jackson Laboratories (numéro 003658) et 14 ont été maintenues génotypes homozygotes sur un FVB / N arrière-plan, et assurant ainsi que tous GFP hors ressort expresse dans les cellules endothéliales Tie-2-positifs. </li><li> Pour tri FACS, préparer un appariés pour l&#39;âge samp négativele ne contenant pas de GFP tel que C57 / BL6 grille pour définir des paramètres pour la GFP tri FACS. NOTE: Ce protocole et les résultats représentatifs sont basés sur l&#39;utilisation de trois, souris adultes-quatre mois ou une portée au jour embryonnaire (E) 14.5. </li></ul><ol><li> Les souris adultes: Immédiatement après le sacrifice de CO 2 anoxie, utiliser des ciseaux de dissection d&#39;ouvrir doucement la cavité thoracique et exposer le cœur et les poumons. Une fois exposée, saisir le coeur avec des pinces sur les grandes artères et le retirer du corps. Retirer le tissu pulmonaire si intact, et placer des coeurs dans HBSS froid à rincer. Retirez le ventricule et retirez les oreillettes de quitter le canal atrio-ventriculaire «anneau» et les régions de l&#39;aorte intacte. Faire une entaille sur le côté du canal atrio-ventriculaire d&#39;ouvrir le «anneau» et exposer les structures valvulaires. Retirez le myocarde et les régions de l&#39;aorte proximale par taquiner doucement avec une pince. Identifier les feuillets de la valve en blanc, tissu dense sur le myocarde rose. Deta doucementCH L&#39;cordages tendineux des valves auriculo-ventriculaires et enlever autant du myocarde reste possible. Soyez prudent de ne pas tirer ou gratter les feuillets de la valve pendant ce processus depuis CVE peuvent être délogés. Placez régions valvulaires taillés dans un tube de 1,5 ml Eppendorf contenant 1 ml de HBSS et garder sur la glace. REMARQUE: dissection minutieuse est essentielle pour éliminer les cellules endothéliales non valvulaires qui pourraient contaminer l&#39;échantillon. </li><li> Embryons: Sacrifice souris femelles 14,0 jours après prise de copulation est observée (le matin de prise de copulation = 0,5 jours). <ol><li> Immédiatement après le sacrifice, disséquer l&#39;utérus (contenant des embryons) et laver à l&#39;HBSS froid. Disséquer embryons individuels de l&#39;utérus et enlever la vésicule ombilicale embryonnaire entourant chaque embryon. Retirer le cœur de chacun des embryons et suivez l&#39;étape 2.1. (NOTE: pressant doucement l&#39;embryon avec une pince juste en dessous des appendices supérieurs devraient contribuer à exposer le cœur et faciliter leur retrait.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Cellule de dissociation et préparation pour FACS <ol><li> En utilisant des pointes de pipettes stériles, retirer HBSS du tube Eppendorf contenant les régions valvulaires. </li><li> Remplacer avec 1 ml de tampon de dissociation et 4 pi DNase I. </li><li> Faire tourner les tubes à 37 ° C pendant 7 min. </li><li> Pipette de haut en bas 3 fois, puis laissez l&#39;échantillon se contenter de 15 sec. Récupérer le surnageant (contenant les cellules dissociées) dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Pour arrêter la réaction de la collagénase, ajouter 125 ul de sérum de cheval sur le tube de collecte. Gardez tube de prélèvement sur la glace. </li><li> Étapes de dissociation répétition (3.2 à 3.5) à neuf reprises pour recueillir des neuf fractions de surnageant. </li><li> Passer le recueil fractionné à travers un filtre de nylon de 70 um dans un nouveau tube de collecte pour assurer une suspension cellulaire unique en éliminant tout débris et des touffes. </li><li> Faites tourner la suspension à 400 g pendant 5 min à granulés les cellules. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon de tri etgarder sur la glace jusqu&#39;à ce que FACS. </li></ol> 4. FACS tri GFP CVE positif <ol><li> Réglez portes avant et en diffusion latérale à exclure les débris et de capturer des cellules individuelles; exclure les doublets en utilisant discrimination doublet déclenchement. Enregistrer l&#39;échantillon de contrôle négatif et définir les paramètres de grille afin de comparer et définir précisément la population de cellules GFP-positives dans l&#39;échantillon Tie-2-GFP. </li><li> Analyser les cellules GFP-positives par FACS et affiner les paramètres de grille. </li><li> Trier l&#39;échantillon et Tie-2-GFP recueillir les cellules positives pour la GFP et GFP-négatif. Si les cellules seront utilisés pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, en quelque sorte directement dans le tampon de tri. Pour les cellules en culture après FACS, collecter des cellules positives pour la GFP dans un tube stérile contenant 1 ml de médias VEC avec 1 ml de FBS, et de recueillir des cellules GFP négatifs en 1 ml de milieu non-endothéliales avec 1 ml de FBS. Utiliser cette combinaison support / 50% de sérum de 50% afin d&#39;améliorer la viabilité des cellules. Garder sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;analyse post-FACS. </li></ol> 5. Poster FACS analytis <ol><li> Extraction de l&#39;ARN: <ol><li> Immédiatement après FACS, les cellules positives et négatives centrifugeuse GFP à 1500 g pendant 8 min. </li><li> Pipette avec précaution le surnageant (tampon de tri) et jeter. </li><li> Reprendre le culot cellulaire (pastille n&#39;est pas visible pour les tailles d&#39;échantillons recommandées ici) dans 200 ul Trizol. </li><li> Congeler à -80 ° C ou commencer l&#39;extraction phénol-chloroforme standard pour isoler ARNm total comme décrit précédemment par notre laboratoire 15. </li><li> Utilisation de 50 à 200 ng d&#39;ARN de synthèse d&#39;ADNc en utilisant la Mastermix selon les instructions du fabricant. </li><li> ADNc Sous réserve de l&#39;amplification de la PCR quantitative en utilisant des sondes IDT Primetime qPCR contre des marqueurs de cellules endothéliales de la souris (CD31, facteur de von Willebrand (FvW)), marqueurs soupape de cellules interstitielles (α-actine musculaire lisse (α-SMA), Periostin (Postn)), des myocytes marqueurs (Mhc6, Mhc7) et GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> La culture murin CVE: <ol><li> Après collecte et tri FACS de cellules (étape 4.3), les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min. </li><li> Pipette avec précaution le surnageant (tri tampon + médias) et le jeter. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules GFP-positive dans 1 ml de milieu VEC et le culot de la GFP-négatif dans 1 ml de média non-endothéliales. </li><li> Plaque chaque échantillon dans un puits d&#39;une lame de matière plastique et la chambre croître jusqu&#39;à confluence. Culture pendant environ 1 semaine pour les cellules GFP négatives pour devenir confluentes et plus de 2 semaines pour les cellules GFP-positives à devenir confluentes (à partir d&#39;un échantillon de 3 souris adultes). Changer de support tous les deux jours. </li></ol></li><li> La coloration par immunofluorescence: <ol><li> Retirez le support de cellules et de fixer dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 30 min à température ambiante. Laver trois fois les cellules fixées pendant 5 minutes chacun dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Retirer les puits de la chambre de bloc de coulisseau et de sérum bovin à 5% d&#39;albumine / 1x PBS pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuberdiapositives O / N à 4 ° C avec des anticorps primaires (CD31, 1: 1000 ou l&#39;actine musculaire lisse α (α-SMA), 1: 100). Laver 3 fois pendant 5 minutes dans du PBS. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire (Alexa Fluor 568-chèvre anti-rat) 1: 400 dans du PBS, ajouter des lames, et incuber 1 heure à température ambiante. Diapositives rinçage 3x pendant 5 min dans du PBS. </li><li> Monter dans Vectashield contenant DAPI et incuber 1 h à 4 ° C avant de consulter. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici pour la première fois, une nouvelle méthode pour l&#39;isolement des CVE murines embryonnaires et adultes de souris Tie-2-GFP. Bien que cette lignée de souris a été largement utilisé pour l&#39;isolement des populations de cellules endothéliales, ce rapport est le premier montrant isolement sélectif des CVE. En raison de la fragilité de la population CVE, nous avons développé un protocole rigoureux qui permet l&#39;isolement d&#39;une cellule unique de la GFP positive (GFP et négatif) des cellules de valves cardiaques de souris embryonnaires et adultes. Par rapport à l&#39;édition originale en utilisant des embryons ou des organes entiers de Tie-2-GFP souris 14, nous avons optimisé les étapes de la collagénase et dissection basé sur la faible abondance de cette population de cellules endothéliales fragile pour isoler une population sélectionnée de cellules. Isolements CVE ont déjà été observés que dans les grands modèles animaux avec des outils génétiques et biomoléculaires limitées. Ces outils sont bien établis chez la souris et, par conséquent, la abilité d&#39;isoler CVE murins permet un ensemble élargi de modèles expérimentaux d&#39;être utilisés pour la recherche d&#39;une valve cardiaque. Par conséquent, un avantage important de cette approche est que les CVE peuvent être isolés dans le temps à partir de souris de type sauvage, et des modèles de maladies de la vanne et des blessures. Un deuxième avantage est que les CVE peuvent être isolés et analysés presque immédiatement après la dissection, la préservation des profils d&#39;expression qui reflètent la situation in vivo de façon plus précise. De plus, ce protocole d&#39;isolement est suffisant pour éliminer la culture de cellules pour l&#39;expansion du nombre et donc des changements phénotypiques potentiels induits par l&#39;environnement in vitro sont empêchés. Malgré les nouveautés et les avantages de ce protocole expérimental, nous reconnaissons que les restrictions existent encore. Tout d&#39;abord, la taille de la population à l&#39;intérieur des vannes de souris VEC est très faible et, par conséquent, de multiples portées embryonnaires temporisés sont nécessaires afin de produire l&#39;ARN suffisante pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique. Bien this peuvent être surmontés en utilisant plusieurs éleveurs, cela pourrait avoir un impact sur l&#39;application de certains outils d&#39;analyse post-isolement. Cette limitation a été un défi particulier pour l&#39;établissement de cultures confluentes de CVE GFP-positives afin d&#39;effectuer des analyses plus poussées des phénotypes CVE y compris les profils moléculaires et des tests fonctionnels. Par conséquent, nous reconnaissons que tous les difficultés ont été surmontées par notre approche mais c&#39;est un domaine d&#39;intérêt que nous nous efforçons de surmonter. Cette approche de l&#39;isolement des régions CVE valvulaires introduit la possibilité de contamination de Tie-GFP cellules endothéliales -positif, non valvulaires de l&#39;endocarde, ou des structures vasculaires dans le myocarde ventriculaire. À ce jour, distinction moléculaire des CVE des autres populations de cellules endothéliales cardiaques n&#39;ont pas été identifiés. Toutefois, une région activatrice du gène NFATc1 a été identifié et montré un étiquetage spécifique des CVE qui ne le font passubir EMT, et aucune autre population de cellules endothéliales dans le coeur 18. En tant que modèle Cre (NFATc1 encre) est disponible, les études futures pourraient utiliser la spécificité de cette ligne afin de minimiser les risques de contamination. En plus des cellules positives pour Tie-2-GFP non-valvulaires, il existe toujours la possibilité de contamination de myocytes à l&#39;endroit où les feuillets de la valve se fixent à la région annulaire de la septal et des parois murales myocarde. En données non présentées ici, nous avons d&#39;abord commencé des études d&#39;isoler CVE des régions valvulaires disséqués en utilisant des billes d&#39;anticorps conjugué revêtues d&#39;anti-GFP et anti-CD31. Bien que cette approche a réussi à isoler les cellules endothéliales, nous avons connu l&#39;agglutination cellulaire significative de types de cellules adjacentes, non-endothéliales et donc CIV et les cellules myocardiques contaminé notre échantillon expérimental. Cela a pu être évité en utilisant une analyse FACS comme paramètres ont été définis pour isoler seulement suspension cellulaire uniques et l&#39;analyse par PCR pour détecter l&#39;expression de gènes spécifiques des myocytes est contrôlée pour cette limitation (figure 3). Bien que notre contamination peut être considéré comme un minimum, il reste une complexité expérimentale potentiel qui pourrait être évité à l&#39;avenir avec la double sélection de la GFP et des marqueurs de surface spécifiques des cellules endothéliales. En utilisant ce protocole, nous avons réussi à isoler les CVE de souris et ont donné des exemples de la façon dont cette approche peut être utilisée pour l&#39;isolation de l&#39;ARN et de la culture de cellules de populations de cellules positives et négatives GFP GFP embryonnaires et adultes. Toutefois, cette approche n&#39;est pas limitée à ces applications et peut être utilisé pour une grande variété d&#39;approches moléculaires, cellulaires et fonctionnels. En outre, le fond Tie-2-GFP peuvent être élevés avec des modèles génétiques de souris qui permettront d&#39;études comparatives des populations CVE santé et la maladie. Le développement de cette nouvelle méthodologie, pour la première fois, permettre des études cibléesl&#39;examen de la contribution des CVE dans le développement de la vanne et de l&#39;entretien et pourrait révéler des mécanismes précédemment méconnus de la maladie de la valve dépendante de l&#39;endothélium.

La vanne mature est composé de trois couches stratifiées de la matrice extracellulaire spécialisée (ECM) intercalées avec des cellules interstitielles de soupape (CIE) et encapsulé par une couche unique de cellules endotheliales de la valve cardiaque (CVE) 1. Le rôle de la MEC est de fournir toutes les propriétés biomécaniques nécessaires pour résister à des changements constants de force de hémodynamique au cours du cycle cardiaque. Changement de l&#39;ECM de soupape dans la soupape d&#39;adulte est étroitement régulée par CIE qui sont en grande partie de repos et des fibroblastes comme en l&#39;absence de maladie. En plus de la population VIC, des cellules endotheliales de la valve cardiaque (CVE) forment un endothelium continu sur la surface des valvules 2. Bien que l&#39;importance de l&#39;ECM et CIE pour la structure et la fonction de clapet ont été décrits par nous et les autres, le rôle de CVE est moins bien connue. Cependant, cette population relativement petite de la cellule est essentielle pour la formation de l&#39;embryon dans la soupape et est décrit comme étant des dysfonctionnements dans la vannemaladie. Coeur formation de soupape dans l&#39;embryon commence quand un sous-ensemble de cellules endotheliales dans les régions de canal et la sortie des voies auriculo-ventriculaires endotheliales subissent une transformation mésenchymateuse (EMT) et des renflements de forme connue en tant que coussins endocardiques 1,3. Les cellules mésenchymateuses nouvellement transformées au sein de ces structures se différencient ensuite en CIV et forment les vannes matures. Une fois EMT est terminée, les cellules endothéliales qui entourent les coussins, appelés CVE, forment une couche de cellules endothéliales continu qui protège la vanne mûr contre les blessures. En outre, CVE sentent l&#39;environnement hémodynamique et ont été montrés à moléculaire communiquer avec CIV sous-jacents à réguler l&#39;homéostasie 1,3 ECM. Dans valvules, la monocouche CVE est perturbé en association avec des changements anormaux dans l&#39;organisation de l&#39;ECM et de la biomécanique modifiés 4,5. En outre, des études dans des modèles de souris suggèrent que le dysfonctionnement CVE est la cause sous-jacente de la vanne dalad ie 1,6-9. Comme CVE jouent un rôle important dans le développement de la vanne, la maintenance et la maladie, il est important que nous définissons pleinement leurs phénotypes temporelles afin de faire progresser le domaine et comprendre les mécanismes de la maladie. Les travaux antérieurs de plusieurs laboratoires a réussi à isoler CVE de porcins et ovins modèles 10-12. En raison de la grande taille de ces vannes, à travers isolations pistonnage et / ou digestion enzymatique, suivi d&#39;un nombre de différentes méthodes d&#39;isolement, y compris la séparation des cellules par billes magnétiques et l&#39;expansion clonale cellule unique a été efficace pour générer des populations pures de 11 à 13. Cependant, ces modèles peuvent être restrictives en raison de l&#39;annotation incomplète des porcins et d&#39;ovins génomes limitant la disponibilité des outils moléculaires, en plus des coûts élevés. Par conséquent expérimentation de porc et CVE ovins après l&#39;isolement peut être restrictive. Des modèles de souris sont préférables en raison des nombreuses possibilités de manipula génétiquetion et les outils moléculaires dans l&#39;embryon et de l&#39;adulte, mais à ce jour, aucun isolat CVE dans de petits modèles animaux ont été rapportés. Cela est probablement dû à la difficulté de travailler avec des échantillons de tissu de petites qui comprennent une population de cellules qui n&#39;ont pas actuellement minorité identité unique de marqueurs spécifiques VEC, empêchant de ce fait des procédés d&#39;isolation à base d&#39;anticorps. Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode pour l&#39;isolement direct de CVE murins à des stades embryonnaires et adultes. Ce protocole prend avantage de souris Tie-2-GFP, qui expriment la GFP dans tous les types de cellules endotheliales et ont été largement utilisés pour étudier les populations de cellules endotheliales 14. Toutefois, la nouveauté de la présente étude est que ces souris, pour la première fois, ont été utilisées pour isoler les cellules endothéliales de soupapes. Par dissection soigneuse du tissu valvulaire et une série de neuf digestions enzymatiques suivies par tri FACS, CVE peuvent être isolés et utilisés pour diverses techniques expérimentalescompris l&#39;extraction d&#39;ARN et de la culture, directement après le tri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Les cellules Tie-2-GFP co-localisent avec des marqueurs de cellules endothéliales dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes. Afin de confirmer la spécificité de l&#39;expression de Tie2-GFP dans les CVE de souris embryonnaires et adultes, l&#39;immunofluorescence a été réalisée pour déterminer la co-localisation avec le marqueur des cellules endothéliales, CD31 dans des coupes de tissus préparés à partir de E14.5 et de 3 mois adulte Tie2-GFP souris utilisant des méthodes antérieurement publiés par notre laboratoire 16. Comme le montre la Figure 1, CVE co-expriment la GFP (Figure 1 A, B, E, F) et CD31 (Figure 1 C, D, E, F) à la fois des adultes (figure 1 B, D, F) et embryonnaire ( Figure 1 A, C, E) étapes, donc de valider notre modèle pour l&#39;isolement CVE ultérieure. Analyse FACS identifié populations de cellules GFP-positives et GFP-négatif distinctes dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes isolés à partir de souris Tie-2-GFP. Sauvage type souris C57 / BL6 ont été utilisés pour définir les paramètres de la GFP et environ 2% de cellules à un seul clapet de souris Tie-2-GFP montrent un enrichissement significatif dans les cellules GFP-positives par analyse FACS dans les deux échantillons embryonnaires et adultes (Figure 2). Basé sur des études de co-localisation de la figure 1, ces cellules sont comme des CVE et donnent un rendement moyen de 61 800 cellules totales (échantillons varient de 39,000-77,000 cellules / échantillon) dans des échantillons d&#39;adultes (n = 3), et 8928 cellules (8,015- 11 000 cellules / litière) d&#39;une portée d&#39;embryons E14.5. L&#39;analyse par PCR confirme enrichissement de marqueurs de cellules endothéliales dans les cellules GFP-positives et des marqueurs des cellules interstitielles de soupape dans les cellules GFP-négatifs isolés à partir de souris Tie-2-GFP. Gene analyse de l&#39;expression des populations de cellules positives et négatives GFP par qPCR FACS suivants montrent des profils moléculaires distincts. Par rapport à la GFP populations de cellules isolées à partir d&#39;embryons négatif Tie-2-GFP et adults, les cellules positives à la GFP sont enrichies pour l&#39;expression de marqueurs de cellules endothéliales CD31 et vWF, (figure 3). En outre, l&#39;expression des marqueurs de myocytes (Myh6, Myh7) dans ces populations de cellules est très faible, ce qui démontre une contamination minimale de cellules non-endothéliales. En revanche, les cellules GFP négatives isolées à partir de souris adultes Tie-2-GFP et les embryons de E14.5 sont enrichies pour vanne cellules interstitielles (VIC), marqueurs de cellules positives α-sma et Periostin (POSTN) relatives à la GFP. L&#39;enrichissement de ces marqueurs est plus élevée dans les cellules GFP isolées à partir d&#39;échantillons négatifs E14.5 chez les adultes due au phénotype quiescent de CIE adultes et par conséquent une faible expression des marqueurs activés. des cellules GFP-positives isolées à partir de souris adultes Tie2-GFP peuvent être cultivées in vitro. La capacité de la culture cellules GFP positifs et négatifs GFP isolées à partir des échantillons d&#39;adultes a été examinée de based sur la morphologie des cellules et la coloration immunohistochimique. En utilisant les protocoles précédemment décrits par 17 nous nous montrons dans la figure 4 que les cellules positives à la GFP apparaissent tour à morphologie (figure 4A) et de co-exprimer la GFP avec le marqueur de cellules endotheliales CD31 après deux semaines en culture (Figure 4C). En revanche, les cellules non-endothéliales sont négatifs pour la GFP, en affichant une morphologie analogue à mésenchymateuses (figure 4B) et d&#39;exprimer le marqueur VIC α-SMA au bout de neuf jours (Figure 4D). <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Figure 1: des cellules Tie-2-GFP-positives co-localisent avec CD31 dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes. Immunofluorescence pour afficher association de (Tie2-) expression de la GFP (A, B) avec le marqueur de cellules endotheliales, CD31 (C, D) dans les septal folioles de la valve mitrale à E14.5 (A, C, E) et adulte (B, D, F) étapes. La région de la vanne est mise en évidence dans A, C, E. (E, F) des images fusionnées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: CVE Tie-2-GFP-positives peuvent être identifiés par FACS. Comparativement aux témoins C57 / BL6 appariés selon l&#39;âge (A, C), vannes isolées à partir d&#39;embryons Tie-2-GFP (B) et les adultes (D) contiennent une GFP distincte population de cellules positives, comme indiqué dans le vert. événements GFP-négatives, en rouge ont été collectées en tant que témoin. Les chiffres entre (B) et (D) indiquent la moyenne% de la GFP-pcellules ositive du nombre total d&#39;événements triés par FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3: les cellules GFP-positives sont enrichies pour des marqueurs de cellules endothéliales alors que les cellules GFP-négatives expriment des gènes associés à des cellules interstitielles de soupape. Représentatif qPCR de marqueurs de cellules endothéliales (CD31, facteur de von Willebrand (vWF)) et adultes (Myh6) et fœtales ( Myh7) des marqueurs de myocytes dans les cellules GFP-positives isolées à partir de régions valvulaires du E14.5 (A) et adulte (B) de souris Tie-2-GFP. Remarque enrichissement de marqueurs de cellules endothéliales et de très faibles niveaux de gènes associés à des myocytes. (C, D) Plier changes dans l&#39;expression des marqueurs des cellules interstitielles de valve α-sma et Postn dans les cellules GFP-négatif isolés à partir de E14.5 (C) et adulte (D) souris Tie-2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 cellules Tie-2-GFP-positives maintenir l&#39;expression des marqueurs des cellules endothéliales in vitro. FACS suite, GFP positive (A, C) et négatif (B, D) des populations de cellules de souris adultes ont été cultivées jusqu&#39;à confluence et soumis à éliminer l&#39;imagerie de contraste (A, B) et immunomarquage fluorescent (C, D). des cellules GFP-positives expriment CD31 (en rouge) (C) après10 jours de culture. En revanche, l&#39;expression de GFP n&#39;a pas été détecté dans la population de cellules négatives, une coloration positive pour laquelle α-SMA, un marqueur de la CIE activés (D).

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Recherche

Biologie

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolement de cellules valvulaires primaires humaines pour la modélisation in vitro de maladies

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolement des cellules endothéliales des capillaires lymphatiques dermiques murins

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Pleins feux sur l’auteur : Isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...