Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Préparation des instruments et solutions de travail <ol><li> Préparer la solution de l&#39;eau des poissons. Préparez une solution en dissolvant 2 g de sel de mer de l&#39;océan instantanée &#39;dans 50 ml d&#39;eau distillée. Ajouter 1,5 ml de stocker l&#39;eau de poissons à 1 L d&#39;eau distillée pour préparer prêt à utiliser de l&#39;eau de poisson (60 pg / ml sels de mer de concentration finale). Autoclave le prêt à utiliser l&#39;eau du poisson avant l&#39;utilisation. Cette solution est utilisée en tant que support d&#39;embryon de poisson zèbre. </li><li> Préparer la méthylcellulose pour le montage de l&#39;embryon. Dissoudre 1,5 g de méthylcellulose dans 50 ml d&#39;eau stérile de poisson. Faciliter la dissolution à l&#39;aide d&#39;un aimant sur une plaque d&#39;agitation. La dissolution complète de la poudre peut nécessiter plusieurs heures. Vérifiez la solution pour plus de clarté et aliquote en petits tubes. Conserver à -20 ° C pendant des mois et dégeler aliquotes à usage. Centrifuger la méthylcellulose à 950 g pendant 5 min avant de l&#39;utiliser. Éviter les cycles de gel-dégel de aliquotes. </li><li> Préparer 50 ml de tricaine / acétate d&#39;éthyle-3 benzoate msel éthanesulfonate (solution mère) en dissolvant 200 mg de tricaine dans 100 ml d&#39;eau et ajuster le pH à 7,0 à l&#39;aide de Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservez ce stock à 4 ° C pendant au plus 30 jours. ATTENTION: tricaine est toxique. Utilisez conformément aux lignes directrices de traitement appropriées. </li><li> Induisant un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre <ol><li> Préparer une solution oxydante pour générique stress oxydatif induction: Faire 50 ml de solution d&#39;oxydant par addition de H 2 O 2 stock solution (de peroxyde d&#39;hydrogène; 100 mM) à l&#39;eau du poisson. Utilisation de H 2 O 2 à une concentration finale comprise entre 2 mM et 100 pM. Préparer cette solution juste avant l&#39;utilisation. La solution oxydante peut être appliqué à la fois toute la montagne ROS-détection et unicellulaires méthodes ROS-détection. Ne rangez pas cette solution. ATTENTION: H 2 O 2 est dangereux, et nocif par inhalation et par ingestion. Contact avec une matière combustible peut provoquer un incendie. Manipuler sous une hotte de laboratoire et porter pers appropriéeséquipement de protection onal. </li><li> Préparer une solution oxydante pour mitochondries dérivés stress oxydatif induction: Faire une solution mère d&#39;oxydant (5 mM) en dissolvant 3,9 mg de la roténone dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à la température ambiante dans l&#39;obscurité. <ol><li> Dissoudre la roténone solution stock à 10 ml d&#39;eau de poissons pour faire une solution prête à utiliser. Utiliser la roténone à une concentration comprise entre 5 à 50 uM. Ne pas utiliser la roténone à des concentrations supérieures à 100 um. À des concentrations appropriées, cette solution oxydante peut être appliquée à la fois à l&#39;ensemble de montage ROS-détection et monocellulaires méthodes de détection des ROS. ATTENTION: La roténone est toxique et dangereux. Manipuler selon les conseils de prudence appropriés. </li></ol></li><li> Induire un stress oxydatif par le gène knock-down: knock-down de l&#39;expression du gène nrf2a dans embryons de poisson zèbre par micro-injection morpholino comme indiqué précédemment par Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Provoquer oxidAtive stress après des lésions tissulaires: générer une marge de blessure à la nageoire caudale des embryons de poisson zèbre à 72 HPF comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour cellule unique méthode ROS-détection: <ol><li> Solution pour la détection de ROS général: Dissoudre la sonde moléculaire ROS-sensible générique dans HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). Cette solution doit être préparée peu avant utilisation. </li><li> Solution pour la détection spécifique de ROS induite par les mitochondries: Peu de temps avant l&#39;utilisation, dissoudre une sonde mitochondriale de ROS-sensible avec du DMSO faire une solution mère de 5 mM. Dissoudre solution mère dans du HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). REMARQUE: Évitez la lumière et l&#39;oxygène exposition de solutions de travail ROS-détection et leurs solutions mères respectives. Protéger le tube de la lumière à l&#39;aideune feuille d&#39;aluminium. Ne pas entreposer ou sondes réutilisation dissous dans du HBSS. Conserver les solutions mères à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires et DMSO sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour la méthode de montage ROS-détection: Dissoudre la solution sonde boursier ROS-sensible générique (stabilisé dans le DMSO) dans HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-5 M). Evitez la lumière et de l&#39;exposition à l&#39;oxygène. Protéger le tube de la lumière. Préparer cette solution avant de l&#39;utiliser. Ne pas stocker ou réutiliser cette solution. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li><li> Ajoutez 25 ml de solution d&#39;arrêt par addition de 10 ml de sérum bovin fœtal à 15 ml de PBS 1x. Conserver la solution stérile. Conserver cette solution à 4 ° C. Cette solution n&#39;est nécessaire que pour une seule cellule - méthode de détection ROS. </li><li> Régler l&#39;incubateur de l&#39;air de poisson zèbre à 28 ans &amp;# 176; C. </li><li> Régler la centrifugeuse à 4 ° C pour le procédé de détection de ROS cellulaire unique. </li></ol> 2. L&#39;accouplement des poissons adultes et la sélection des embryons de poissons zèbres <ol><li> Mise en place adulte paire poisson zèbre traverse selon des protocoles standard 40. Sélectionnez la ligne transgénique approprié en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. </li><li> Ramassez les œufs et les placer dans un plat de 90 mm avec le milieu de l&#39;eau du poisson / de l&#39;embryon. Conserver les œufs à 28 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons vont se développer et croître jusqu&#39;au stade désiré de développement (par exemple, 48 HPF, 72 HPF; HPF: heures après la fécondation). </li><li> Écran pour le développement des embryons. Exclure tous les œufs non fécondés ou d&#39;embryons sous-développés. </li><li> Anesthésier embryons en ajoutant 1 ml de tricaïne (solution mère) dans 50 ml d&#39;eau de poissons. </li><li> Sélectionnez Tg embryons fluorescentes sous une loupe binoculaire. </li></ol> 3. Traitement des embryons avec l&#39;agent oxydant <ol><li> Utilisez au moins 30 embryons entre 48 hpf et 72 HPF par des conditions différentes. Laver embryons fois à l&#39;eau du poisson frais pour éliminer tricaine. </li><li> Diviser embryons fluorescentes en trois plats. Ne pas placer plus de 30 embryons / plat. </li><li> Retirer la solution de lavage et ajouter 10 ml de la solution d&#39;oxydant ou de 10 ml d&#39;eau du poisson comme solution de contrôle. </li><li> Incuber les embryons pour 10 min à 1 h à 28 ° C. La période d&#39;incubation dépend du niveau de stress oxydatif d&#39;être induite dans des tissus spécifiques. De courtes périodes sont les meilleurs que les cellules touchées par le stress oxydatif subissent progressivement la mort cellulaire. </li><li> embryons de transfert dans un nouveau plat contenant HBSS et embryons de lavage en remuant. Pré-HBSS chaud à 28 ° C. </li></ol> 4. Méthode de détection Mont ROS entier <ol><li> Recueillir des embryons après traitement oxydant et mettre pas plus de 10 embryons dans un petit tube. Rincer avec de l&#39;HBSS autant que possible. Protéger le tube de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de détection pour ROSchaque tube. </li><li> Incuber les embryons dans l&#39;obscurité pendant 15 min à 28 ° C pour éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Pendant la durée d&#39;incubation préparer une lame de verre pour l&#39;analyse de l&#39;embryon entier. Mettez 300 pi de méthylcellulose sur une &quot;dépression&quot; lame de verre et l&#39;étaler sur la surface du verre avec une pointe de pipette. Éviter les bulles tout en libérant la méthylcellulose. </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation, retirer immédiatement la solution ROS-détection et laver deux fois avec 2 ml de HBSS. Laver les embryons en renversant le tube plusieurs fois. Ne pas pipeter ou vortex. </li><li> embryons en une pipette Pasteur en verre de Aspirer. embryons de position près de l&#39;ouverture de la pipette et en douceur les éjectent dans la méthylcellulose. Orienter les embryons de manière appropriée avec un fil de nylon fin. </li><li> Comparer la fluorescence des embryons de contrôle avec des embryons traités. Alternativement, fixer les paramètres de la loupe binoculaire ou microscope confocal fluorescence de sorte que tous les embryons sont imagées par la mêmeparamètres d&#39;imagerie. </li></ol> 5. Single Cell méthode ROS-détection <ol><li> Commencez à l&#39;étape: 3.5. Assurez-vous d&#39;avoir au moins 35 embryons pour chaque condition. </li><li> Transfert d&#39;embryons dans un nouveau plat. Enlever l&#39;eau des poissons autant que possible. Ajouter 10 ml de PBS glacé 1x et 400 pi de inhibiteurs de la protéase cocktail. Dechorionate manuellement embryons avec une pince et retirer le sac du jaune d&#39;oeuf avec une aiguille fine. Remarque: la suppression jaune sac assure échantillons propres pour l&#39;analyse FACS suivant. Cette étape peut être évité selon l&#39;instrument FACS. </li><li> Transfert de-vitellins embryons dans une plaque de 24 puits à puits multiples (15 embryons / puits) et supprimer toute l&#39;eau du poisson. </li><li> Ajouter 300 ul de HBSS, 30 pl de la collagénase P, 50 ul de trypsine-EDTA dans chaque puits. </li><li> Homogénéiser embryons par un léger pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette serré (1000 pi). </li><li> Incuber à 28 ° C pendant 20 min et l&#39;homogénéiser les échantillons par pipetage toutes les 5 min. </li><li> Vérifiez DISR tissuuption en observant une aliquote de homogénat au microscope composé. Faciliter la suspension de cellules individuelles par pipetage. Ne pas incuber les embryons pendant plus de 30 min. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 200 ul de solution d&#39;arrêt. Mélanger à la pipette doucement. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube pré-réfrigérés avec fond étanche. Gardez le tube sur la glace et éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 250 g à 4 ° C. </li><li> Retirez la phase supérieure et les cellules re-suspension avec de la glace froide HBSS par pipetage. </li><li> Compter les cellules et assurez-vous que vous avez le même nombre de cellules dans l&#39;ensemble de vos échantillons. Ne pas utiliser moins de 2 x 10 6 cellules. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 250 xg à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et suspendre le culot avec 1 ml de glace réfrigéré HBSS contenant la sonde ROS-sensible. </li><li> Incuber le tube à la température ambiante pendant 3 minutes dans l&#39;obscurité. Varier la durée d&#39;incubation en fonction du niveau de stress oxydatif et à til sensibilité de la sonde. </li><li> Transférer les cellules dans un tube FACS. Garder les tubes sur la glace et éviter l&#39;exposition de lumière avant l&#39;analyse FACS. </li><li> Trier les cellules avec un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Longueurs d&#39;onde réglée conformément à fluorescence Tg de tissu (par exemple, la GFP) et les spectres d&#39;excitation / émission de la sonde moléculaire utilisée pour la détection ROS (par exemple, les sondes ROS-sensibles mitochondriales spécifiques, sondes ROS-sensibles génériques). </li><li> Pour chaque condition, mesurer tous les échantillons dans la même séance expérimentale en appliquant les mêmes paramètres FACS. Calculer le pourcentage de cellules fluorescentes comme la moyenne des différentes répétitions biologiques. Analyser au moins deux répétitions pour chaque condition. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Étapes critiques La procédure de détection d&#39;un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L&#39;ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d&#39;évaluer in vivo ROS-...

Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d&#39;un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d&#39;oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l&#39;état redox cellulaire. Les réactions d&#39;oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d&#39;électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l&#39;oxydation de molécules (à savoir les réactions d&#39;oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d&#39;électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l&#39;ADN, des protéines carboxylation, et l&#39;oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire 1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques 2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires 3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d&#39;Alzheimer et la maladie de Parkinson 5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques 6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif 8. Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l&#39;oxygène (ROS, les espèces réactives de l&#39;oxygène) ou de l&#39;azote (RNS; espèces réactives de l&#39;azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l&#39;anion superoxyde (OH.) (O 2 -), et le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2). Le principal RNS est l&#39;oxyde nitreux (NO).. Une série d&#39;espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres 9. Par exemple, l&#39;anion superoxyde réagit avec l&#39;oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO -), tandis que H 2 O 2 avec la réaction Fe 2 + génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l&#39;état redox physiologiques 10. Pour maintenir les cellules de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction sont équipées d&#39;une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l&#39;anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d&#39;espèces pro-oxydantes, y compris H 2 O 2, OH et OONO -. 11. Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d&#39;une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives 12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l&#39;état redox cellulaire vers stress oxydatif 14. Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d&#39;origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l&#39;hôte et la réparation des plaies 15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium 18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l&#39;activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l&#39;ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l&#39;ADN 20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l&#39;inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal 21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes 22,23. Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d&#39;un grand intérêt de réaliser des études d&#39;oxydo-réduction dans les modèles animaux 24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif 26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d&#39;embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l&#39;imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes 27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques 28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques 32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d&#39;un promoteur choisi, en offrant la possibilité d&#39;identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu&#39;elles comprennent. Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l&#39;effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif 33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre 36,37, il n&#39;y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d&#39;embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d&#39;imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Des niveaux élevés d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l&#39;état redox cellulaire vers l&#39;état de stress oxydatif. Cette situation provoque l&#39;oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l&#39;embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un &quot;embryon toute méthode ROS-détection&quot; pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un &quot;unicellulaire ROS méthode de détection &quot;pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l&#39;efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.

En appliquant la méthode décrite ici, nous pouvons facilement mesurer et détecter le stress oxydatif (et niveaux de ROS) dans les tissus embryonnaires de poisson zèbre. Après avoir traversé le poisson zèbre adulte, les oeufs sont recueillis et ont permis de développer à 28 ° C à 72 heures après la fécondation (HPF). Pour induire un stress oxydatif, nous proposons deux approches différentes: 1) le traitement des embryons avec de fortes réactifs pro-oxydants ou 2) la promotion de la formation de ROS après ...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K vues.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Vidéo: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mesurer le stress oxydatif Résistance<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En 96 plaques de microtitration bien

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...