Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Institut national du cancer, CA131967.

1. L&#39;incorporation de BrdU (repérage des bornes) <ol><li> Cellules de la plaque à environ 70% de confluence dans une culture de tissu plat 150 mm 24 h avant l&#39;addition de BrdU. </li><li> Remplacez le support avec des produits frais milieu complet contenant 20 ug / ml de BrdU (Sigma) à des moments appropriés avant la récolte. La longueur de temps sont les cellules cultivées dans des milieux avec BrdU varient selon le type cellulaire et des espèces, généralement la phase G2 dure entre 2 et 5 heures (figure 1). </li></ol> 2. Récolte chromosomique des cultures monocouches de cellules <ol><li> Retirer des milieux de culture à partir de la plaque et reçois 10 ml dans un tube de centrifugeuse de 15 ml conique. Jeter les feuilles restantes. </li><li> Rincer les cellules une fois avec 10 ml Versine [ou HBSS (Sigma)]. </li><li> Ajouter 5 ml de trypsine 0,25% dans Versine (ou HBSS) à la plaque. Incuber à la température ambiante jusqu&#39;à ce que les cellules sont détachées de la plaque. </li><li> Ajouter suspension de cellules trypsinisées dans le tube contenant 10 ml de médias de l&#39;étape 2.1. &lt;/ Li&gt; <li> Centrifuger à 400 xg pendant 10 min pour sédimenter les cellules. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml de milieu ainsi que le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules à fond par pipetage avec une pipette Pasteur. </li><li> Ajouter 3 gouttes de solution hypotonique (0,075 M de KCl (Sigma) chauffé à 37 ° C) et mélanger la suspension cellulaire avec une pipette Pasteur. Ajouter 0,5 ml de solution hypotonique et mélanger à nouveau avec une pipette Pasteur. Amener le volume de solution hypotonique à 5 ml et mélanger de nouveau. Incuber à 37 ° C pendant 20-45 min, en fonction du type cellulaire. </li><li> Centrifuger à 400 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml de milieu ainsi que le culot cellulaire. </li><li> Reprendre le culot cellulaire en effleurant doucement le tube. Les cellules osmotiquement gonflées sera fragile à ce stade, donc il faut prendre soin de ne pas perturber les membranes cytoplasmiques. </li><li> Ajouter 3 gouttes de fixateur de Carnoy (acide acétique glacial 01h03: Le méthanol); mélanger doucement par pipetage avec un pipett Pasteure. Ajouter 0,5 ml de fixateur et mélanger en pipetant doucement avec une pipette Pasteur. Amener le volume de fixateur à 5 ml et mélanger à nouveau en pipetant doucement avec une pipette Pasteur. Les cellules fixées peuvent être stockés dans l&#39;obscurité à -20 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Centrifuger et aspirer comme à l&#39;étape 2.8. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans du fixateur frais; estimer le volume de la pastille et ajouter ~ 10x le volume de fixateur de Carnoy. </li><li> Ajouter la suspension de cellules goutte à goutte sur des lames de microscope humides, glacées; maintenir la lame à un angle de 45 ° ~ et permettre la suspension de cellules à s&#39;écouler sur la surface de la lame. Posez la lame à plat sur du papier absorbant et les inondations la diapositive avec un fixateur, laisser sécher. Vérifiez diapositives de la présence d&#39;écarts mitotiques en utilisant un microscope inversé. </li></ol> 3. Traitement RNase et déshydratation de l&#39;éthanol <ol><li> Lieu 200 ul de 10 pg / ml de RNase A (Sigma) dans 2x SSC à chaque diapositive; incuber à 37 ans &amp; deg; C pendant 1 heure. </li><li> Laver les lames 3 fois avec 2x SSC, pH 7,0 à température ambiante pendant 3 min chacun. </li><li> Déshydrater les lames grâce à un mélange EtOH (Sigma) série (70%, 90% et 100%) à la température ambiante pendant 3 min chacun. </li><li> Sécher les lames d&#39;air à température ambiante. </li></ol> 4. Préparation de cocktails de sonde pour BAC + chromosomique spécifique énumération centromère Probe (CEP) ou pour les peintures chromosomiques entiers Hybridation in situ <ol><li> Pour l&#39;hybridation BAC / CEP simultanée, préparer deux cocktails sondes séparées pour les pré-hybridation. Nous avons trouvé que la pré-hybridation des sondes d&#39;alcoolémie et le SCEP séparément dans les résultats stringences différentes en moins d&#39;arrière-plan et les intensités de signaux supérieures. Nous avons également constaté que fosmides individuels peuvent également être utilisés à la place de clones BAC. La formulation cocktail décrit ci-dessous représente les volumes pour une seule diapositive. Si le traitement de plusieurs diapositives en utilisant les mêmes sondes simplement augmenter le volume appropr<html> iately. * BAC sonde d&#39;ADN cocktail: 11,5 ul de tampon d&#39;hybridation (formamide 50% (Sigma) / 2x SSC / Dextran Sulfate (Sigma)) 2 ul dH 2 O 2,5 pi BAC/Cot1 ADN dans dH 2 O (voir ci-dessous pour l&#39;étiquetage protocole) un volume de 15 ul au total * CEP sonde cocktail: 7 pi de tampon d&#39;hybridation CEP (65% Formamide/2x SSC / Dextran Sulfate) 2 ul dH 2 O D&#39;ADN de 1 ul CEP/Cot1 (acheté préalablement marqué avec Spectrum Orange/Cy3/Texas Rouge) 10 ul de volume total de * Après dénaturation et de pré-hybridation (étape 5.1) mélange BAC sonde avec le CEP sonde à un 3:2 ratio de 25 cocktails sonde ul / slide et mélanger. OU </li><li> Aliquote de 20 ul / diapositive de la sonde chromosomique Peinture entier (Cy3/Texas rouge) dans un tube. Passez à la dénaturation et de pré-hybridation étape. </li></ol>&quot;&gt; 5. Faites glisser et dénaturation de la sonde et hybridation in situ <ol><li> Dénaturer sonde cocktail (s) à 75 ° C pendant 10 min. Pré-hybridation à 37 ° C pendant 30 min pour permettre l&#39;ADN Cot1 de s&#39;hybrider à des séquences répétitives et d&#39;empêcher l&#39;hybridation subséquente de chromosomes en métaphase. </li><li> Diapositives dénaturer dans des jarres de Coplin à 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 à 72 ° C pendant 3 min. </li><li> Immédiatement déshydrater diapositives à travers une série EtOH (70%, 90% et 100%) dans des jarres de Coplin à 4 ° C pendant 3 minutes chacun. </li><li> Laisser les lames sécher à l&#39;air à température ambiante. </li><li> Préchauffer les diapositives à 45 ° C sur la lame chaude pour les 10 dernières minutes de la sonde pré-hybridzation (étape 5.1). Mélanger cocktails sonde pré-hybridés si nécessaire et ajouter 25 ul de chaque diapositive, placez doucement une lamelle sur chaque diapositive et joint le long de tous les bords avec la colle de caoutchouc. Incuber une nuit à 37 ° C dans une chambre humidifiée pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol><ol><li> Laver les lames dans des jarres de Coplin 3 fois dans 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 à 38-40 ° C pendant 3 minutes chacun. La température des lavages peut varier entre sondes. S&#39;il ya hybridation de fond élevé, vous pouvez augmenter la température des lavages. A l&#39;inverse, si le signal est faible et il n&#39;y a pas d&#39;arrière-plan, vous pouvez diminuer la température de ces lavages. </li><li> Laver les lames 1 fois dans du tampon de PN à la température ambiante pendant 3 min, puis passez à l&#39;étape de détection du BrdU. </li></ol> 7. Détection BrdU <ol><li> Bloc glisse avec un tampon PNM pendant 10 min (200 pi / diapositive) à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Égoutter les lames en les tournant sur chant sur une serviette en papier. Ajouter 100 ul d&#39;anti-BrdU-FITC (50 pg / ml Roche ou Millipore) dans un tampon PNM pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Laver les lames 3 fois dans le tampon de PN à température ambiante pendant 3 min chacun. </li><li> Drainerexcès de tampon de PN sur diapositives une à la fois en tournant sur chant sur une serviette en papier. Ajouter 20 ul DAPI / antifade montage solution (Invitrogen). Recouvrir la lame avec une serviette en papier et appuyez sur la lamelle pour forcer les bulles d&#39;air et l&#39;excès de solution de montage. Procéder à l&#39;analyse d&#39;image. </li></ol> 8. Capture d&#39;images et de quantifier l&#39;incorporation de BrdU <ol><li> Les images sont capturées avec un appareil Olympus BX61 microscope à fluorescence et Olympus Caméra CCD, objectif 100x, filtre automatique-roue et logiciels Cytovision (Applied Imaging). BrdU est capturé à l&#39;aide d&#39;un filtre FITC, les peintures chromosomiques (Texas Red, métasystèmes ou Cytocell), BAC (Cy3) et CEP (Vysis Spectrum Orange) sondes sont capturées à l&#39;aide d&#39;un Texas Red ou Cy3 filtre DAPI est capturée avec un filtre DAPI (voir Les figures 2 et 3). </li><li> Chromosomes individuels d&#39;intérêt sont identifiés avec le BAC / CEP ou sondes chromosomiques spécifiques de peinture (figures 2B et 3B). Utilisantle logiciel Cytovision, chaque chromosome d&#39;intérêt est &quot;découpé&quot; en métaphase de la propagation dans l&#39;ensemble, une ligne est tracée à travers le long de la longueur du chromosome de bras court à bras long (figures 2C et 3C). Le logiciel Cytovision est utilisé pour quantifier le profil d&#39;intensité de pixel le long de la longueur de chaque chromosome. Le logiciel calcule Cytovision la zone occupée par les pixels et quantifie l&#39;intensité des pixels représentés par les signaux de BrdU ou DAPI de chaque chromosome isolé. L&#39;intensité moyenne des pixels représentés par chaque chromosome est alors multiplié par la surface occupée par les pixels pour obtenir le nombre total de pixels (tableau 1 et figure 4). En outre, ce protocole permet la visualisation des dernières régions réplication des chromosomes. Par conséquent, le motif à bandes d&#39;incorporation de BrdU permet la détection des régions activement réplication des chromosomes, et les différences dans le calendrier de réplication entre les chromosertains paires sont considérées comme des différences dans ce modèle de bandes (figures 2 et 3). Enfin, ces différences dans les modes de liaison peuvent être comparées à des cartes connues de synchronisation de réplication pour chaque chromosome 6,7, ce qui permet une estimation de la différence de temps de réplication entre les chromosomes homologues ou des bras chromosomiques 4. Par exemple, le chromosome 6 les deux sur la figure 3A afficher une différence dans des bandes de motif&gt; 2 heures par rapport à la normale de synchronisation de réplication du chromosome 6 4. En outre, une procédure similaire à celle décrite ici a été utilisée avec succès pour l&#39;étude de la chronologie de réplication asynchrone entre les chromosomes X actifs et inactifs 8,9. Les chromosomes X actifs et inactifs ont été identifiés en utilisant des peintures du chromosome X. Les images ont été acquises à l&#39;aide du logiciel Quips mFISH (Vysis) et le nombre de pixels occupés par les chromosomes X et le nombre de pixels occupés par fluorescence labeled BrdU ont ensuite été calculées à l&#39;aide NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Nick Traduction ADN de BAC pour le marquage fluorescent (Vysis) <ol><li> Ajouter le mélange refroidi sonde suivante pour un tube de centrifugeuse: 70 pi (4 pg d&#39;ADN) dans dH 2 O 10 pl 0.2 mM dUTP-orange ou vert 20 pl 0.1 mM dTTP 20 ul de tampon 10x Traduction Nick 40 ul de dNTP NT (moins dTTP) 40 ul enzyme Traduction nick Volume de 200 ul totale Incuber à 16 ° CO / N. Arrêter la réaction par chauffage à 70 ° C pendant 10 min. Refroidir sur glace pendant 5 min. </li><li> Précipiter l&#39;ADN avec de l&#39;éthanol en ajoutant ce qui suit au mélange de sonde: Solution 200 ul de sonde 48 ul de NaOAc 3 M 160 ul Cot1DNA (.25 g / ul) 1200 EtOH ul 100% </li><li> Conserver à -80 ° C pendant 10 min pour O / N. </li><li> I Spinn froide à 12.000 xg pendant 20 min. Décanter EtOH. Laver 1 fois avec de l&#39;EtOH 70%. Faites tourner comme avant. Décanter EtOH. Sécher à l&#39;air jusqu&#39;à ce que s&#39;évapore EtOH. Remettre en suspension dans 40 ul dH 2 O pour une concentration finale de 100 ng / pl d&#39;ADN de BAC. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La préparation des étalements de chromosomes est une étape cruciale pour la réussite de la réplication de synchronisation essai décrit ici. L&#39;inclusion d&#39;une étape de prétraitement colcémide avant le traitement hypotonique peut aider à la fréquence et la propagation des cellules mitotiques. En général, nous exposer les cellules à colcemdi pendant 1-3 heures avant la récolte, et l&#39;utilisation colcémide à une concentration finale de 10 ug / ml. Toutefois, l&#39;inclusion d&#39;une étape de pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nick Translation Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varie </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;hybridation INS / PCM </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;hybridation CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Chromosome paints </td><td> Métasystèmes Groupe </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscope à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Système logiciel microscope d&#39;imagerie </td><td> Applied Imaging </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Appareil photo numérique </td><td> Olympe </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EN RECETTES hybridation in situ Solutions Formamide 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamide * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH à 7,0 avec HCl (Sigma) * Il est important d&#39;utiliser le formamide qui a été stocké à -20 ° C. Stockage prolongé température ambiante va générer l&#39;acide formique et le pH wmal-être trop bas. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH à 7,0 avec HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g de citrate de sodium (Sigma) dH 2 O en volume PN tampon [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Préparer une solution à 0,1 M de phosphate de sodium chacun (Filtre stériliser et stocker en aliquots ml 500). 0,1 M de NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O en volume 0,1 M de NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O en volume. PN: Ajuster le pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 à pH 8,0 avec 0,1 M NaH 2 P0 4. Stériliser par filtration et ajouter 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Non lait écrémé en poudre (Sigma) 25 ml de tampon PN (recette ci-dessus) Mélanger pendant 15-20 min en remuant constamment. Faites tourner 2 fois à 400 xg pendant 10 min. Utiliser le surnageant, et assurez-vous de ne pas déranger les protéines du lait précipités. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Réplication de l&#39;ADN des mammifères initie à plusieurs endroits le long des chromosomes à différents moments au cours de la phase S, la suite d&#39;un programme de réplication temporelle. La spécification de la synchronisation de réplication est considéré comme un processus dynamique régulée par des signaux spécifiques de tissus et de développement qui répondent aux modifications épigénétiques. Cependant, les mécanismes de régulation où et quand réplication de l&#39;ADN initie le long des chromosomes reste mal comprise. Chromosomes homologues généralement se répliquer de manière synchrone, mais il ya des exceptions notables à cette règle. Par exemple, dans les cellules de mammifères femelles l&#39;un des deux chromosomes X devient une réplication tardive par le biais d&#39;un processus appelé inactivation du chromosome X 1. Avec ce retard dans le calendrier de réplication, estimé à 2-3 h, la majorité des gènes transcriptionnellement silencieux deviennent le seul chromosome X. En outre, un discret agissant en cis lieu, connu comme le centre inactivation du chromosome X, réglemente ce processus inactivation du chromosome X, y compris èmee induction de la réplication temps différé sur le chromosome X inactif entier. En outre, certains réarrangements chromosomiques trouvés dans les cellules cancéreuses et les cellules exposées à des rayonnements ionisants afficher un retard important dans le calendrier de la réplication&gt; 3 heures qui affecte le chromosome entier 2,3. Des travaux récents de notre laboratoire indiquent que la perturbation de discret agissant en cis autosomique résultat loci dans un phénotype extrêmement réplication tardive qui affecte l&#39;ensemble du chromosome 4. Études &#39;ingénierie chromosomique »supplémentaires indiquent que les réarrangements chromosomiques affectant certains nombre de résultats différents chromosomes anormal dans ce moment-phénotype de réplication, ce qui suggère que tous les chromosomes de mammifères contiennent discrets agissant en cis locus qui contrôlent le calendrier de réplication des chromosomes individuels 5. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;analyse quantitative de la synchronisation de réplication chromosomique associée à hybridation fluorescente in situ. Cetteméthode permet une comparaison directe de la synchronisation de la réplication entre chromosomes homologues au sein de la même cellule, et a été adapté à partir de 6. En outre, cette méthode permet l&#39;identification sans ambiguïté des réarrangements chromosomiques qui sont en corrélation avec l&#39;évolution du calendrier de réplication qui influent sur le chromosome entier. Cette méthode présente des avantages par rapport élaboré récemment débit micro-array haut ou le séquençage protocoles qui ne peuvent distinguer entre les allèles homologues présents sur réorganisées et non réorganisées-chromosomes. En outre, parce que la méthode décrite ici évalue cellules individuelles, il peut détecter des changements dans le calendrier sur la réplication des chromosomes réarrangements chromosomiques qui sont présents dans seulement une fraction des cellules dans une population.

Un exemple de l&#39;analyse de la synchronisation de réplication du chromosome 6 humain est montré dans la figure 2. Des cellules contenant une délétion du gène ASAR6 4, situé à 6q16.1, ont été exposés à BrdU pendant 5 heures, la récolte des cellules mitotiques et traitées de FISH avec une sonde de peinture chromosomique 6 (Vysis) et pour l&#39;incorporation de BrdU. Notez qu&#39;il ya une différence significative dans le modèle de BrdU bandes entre le deux 6, ce qui correspond...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Procédé pour l&#39;analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l&#39;incorporation de BrdU en combinaison avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) afin d&#39;évaluer le calendrier de réplication des chromosomes de mammifères. Cette technique permet la comparaison directe des chromosomes réarrangés et non réarrangé dans la même cellule.

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

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Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K vues.  Oregon Health & Science University. Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec fluorescent In situ Hybridation (FISH) afin d'évaluer le calendrier de réplication des chromosomes de mammifères. Cette technique permet la comparaison directe des chromosomes réarrangés et non réarrangé dans la même cellule.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Hybridation in situ pour la localisation précise des transcriptions dans les plantes

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...