Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents du laboratoire pour ses contributions à l&#39;élaboration de la méthodologie exposée ici et à Alan Cochrane pour obtenir des conseils. Los Angeles est un bénéficiaire d&#39;une Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC) Bourse de doctorat et de AJM est soutenu par une bourse de carrière du Fraser, Monat et MacPherson. Ce travail est soutenu par une subvention de l&#39;IRSC (subvention n MOP-56974).

1. Préparation de la sonde <ol><li> Digest 1 ug du vecteur dans la transcription in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 avec Kpn1 enzyme à 37 ° C pendant 1 heure et utiliser le produit ADN linéarisé sur un gel d&#39;agarose. Le fragment doit être environ 2500 pb. </li><li> Couper le fragment du gel et de purifier l&#39;aide de la Roche Micro Eluer Gel Extraction Kit (tous les réactifs utilisés sont répertoriés dans le tableau 1). Effectuez l&#39;élution finale dans 30 ul de tampon d&#39;élution. Exécuter 5 ul du produit sur un gel d&#39;agarose pour vérifier la purification. </li><li> Mélanger une réaction de transcription in vitro (voir recette ci-dessous) en utilisant la Roche DIG RNA kit de marquage et incuber à 37 ° C pendant 2 heures. </li></ol> En réaction de transcription in vitro: <table border="1"><tbody><tr><td> Linéarisé ADN </td><td> 23 pl </td></tr><tr><td> 1X DIG ARN étiquetage mélange (Roche) </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 1X Tratampon nscription </td><td> 8 pl </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polymérase </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Total </td><td> 40 pl </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Ajouter 228 U de DNase I et incuber à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Arrêter la réaction par addition d&#39;EDTA pH 8,0 à une concentration finale de 20 mM. </li><li> Purifier la réaction en utilisant les colonnes de centrifugation rapide de Roche comme spécifié par le fabricant. </li><li> Purifier la sonde par précipitation avec un pH traitée au DEPC 1/10 du volume 3M NaOAc 5,2 et 2,5 volumes d&#39;éthanol glacé à 95%. Mélanger et incuber à 80 ° C pendant 30 min à une nuit. </li><li> Centrifuger la sonde pendant 15 min à 4 ° C à 15.000 x g. </li><li> Eliminer le surnageant et laver le culot dans glacée éthanol à 70%. Centrifuger de nouveau pendant 5 min à 4 ° C à 15.000 x g. </li><li> Eliminer le surnageant et sécher le culot. Reprendre le culot dans 50 ul water (DNase / RNase) contenant 10 U Invitrogen RNase OUT. </li><li> Estimer la concentration de la sonde par spectrophotométrie (ARN mesure à 260 nm), et diluer à une concentration de 5 ng / ul. Magasin en aliquots à -20 ° C pour usage à court terme, ou à -80 ° C pour stockage à long terme. Il est recommandé d&#39;effectuer des comparaisons inter dosage afin de conserver une partie aliquote de cette. </li></ol> 2. La fixation de cellules <ol><li> Il est d&#39;abord important de cellules adhérentes de semences non traitées, SUR DES lamelles de verre stériles de sorte que la confluence finale à la récolte est d&#39;environ 70-80%. Pour les cellules non adhérentes, de grandir normalement et lorsqu&#39;il est prêt à recueillir, les incuber avec des lamelles qui ont été traités avec 0,01% p / v de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, Inc) pendant 1 heure. Pour un type de 12 et plaque de culture tissulaire en polystyrène (3,8 cm 2), 150.000 cellules HeLa (par exemple) sont étalées à 24 heures avant la transfection. Les cellules non adhérentes peuvent être infectées ou transfectées comme d&#39;habitude et autorisés à adici pour lamelles de verre avant de fixation 3. </li><li> Jeter les médias et laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X préparée dans de l&#39;eau bidistillée (DPBS) pendant 1 min. Diéthylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc)-traité 1X PBS peuvent également être utilisés, mais non traitée PBS ne peut pas car il peut contenir des enzymes de RNase. </li><li> Jeter le PBS et ajouter du paraformaldéhyde à 4%, assez pour couvrir les cellules complètement. Incuber pendant 15-20 min. </li><li> Jeter le paraformaldeyhyde et laver les cellules avec 1X DPBS pendant 1 min. </li><li> Jeter les DPBS et ajouter 0,1 M de glycine (dissous dans 1X DPBS). Incuber pendant 10 min. </li><li> Jeter la glycine et laver les cellules avec 1X DPBS pendant 1 min. </li><li> Jeter les DPBS et ajouter 0,2% de Triton-X (dissous dans 1X DPBS). Incuber pendant 5-10 min. Si la coloration pour les protéines d&#39;enveloppe nucléolaires ou nucléaire, perméabiliser avec du Triton X-100 pour pas plus de 5 min ou la localisation de la protéine deviendra diffus. </li><li> Jeter Triton X-100 et laver une fois dans1X DPBS pendant 1 min. </li><li> Pour stockage à long terme, remplacer PBS avec 70% d&#39;éthanol et conserver à 4 ° C pour un maximum de quatre mois. Sinon, laver une fois de plus avec 1X DPBS et procéder à la FISH. </li></ol> 3. L&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) <ol><li> Si les lamelles ont été stockées dans de l&#39;éthanol, l&#39;éthanol remplace avec 1X DPBS et permettre aux cellules de se réhydrater pendant 30 min. La réhydratation peut se faire du jour au lendemain si les lamelles sont conservés à 4 ° C. </li><li> Laver les lamelles avec 1X DPBS pendant 1 min. </li><li> Préparez des diapositives d&#39;incuber les lamelles sur, en prenant soin de nettoyer et de les étiqueter ainsi. </li><li> Pour une lamelle 18mm, ajouter 50 ul de solution de DNase (25 unités / lamelle, disponibles dans le commerce) à la diapositive. Ajouter la lamelle, en étant sûr de placer côte à cellule, il baisse, et il incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les lamelles avec 1X DPBS pendant 1 min. </li><li> Ajouter 50 ul mélange d&#39;hybridation (voir recette ci-dessous) par la lamelle surune diapositive et incuber le côté pile lamelle vers le bas pour 16-18 h à 42 ° C. L&#39;incubation doit être effectuée dans un bac contenant un 50% de formamide, 2X SSPE mélange (12,5 ml de formamide désionisée, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml d&#39;eau). </li></ol> Mélange d&#39;hybridation (pour une lamelle, 50 pl): <table border="1"><tbody><tr><td> Montant de stock </td><td> Matériel (à une concentration finale) </td></tr><tr><td> 25 pl </td><td> Le formamide, 50% (désionisée; n&#39;importe quelle source) </td></tr><tr><td> 5 pl (de 10 mg / ml) </td><td> ARNt, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 pi (de 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 pi (de 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 pi (5 unités) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 pi (25 ng de 5 ng / pl) </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> 5 pl </td><td> H 2 O DEPC, pour la finalevolume de 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Côté Incuber cellule lamelles dans du formamide à 50 50% ul (dilué dans du DPBS 1X) pendant 15 min à 42 ° C. </li><li> Laver les lamelles à deux reprises en 2X SSPE en incubant les cellules vers le bas côté dans 50 ul SSPE 2X (20X SSPE dilué dans 1X DPBS) pendant 5 min chacune à 42 ° C. </li><li> Laver les lamelles en 1X DPBS pendant 1 min. </li></ol> 4. Marquage en immunofluorescence <ol><li> Bloquer les lamelles en les plaçant côte cellule vers le bas dans 50 1X solution ul Roche blocage (10X solution Roche blocage dilué dans 1X DPBS) pendant 30 min. </li><li> Incuber le côté pile des lamelles vers le bas dans 50 ul de solution d&#39;anticorps primaire pendant 1 heure à 37 ° C. Anticorps anti-DIG doit être dilué selon la direction du fabricant de 1X solution de blocage. Si d&#39;autres anticorps sont utilisés pour colorer les protéines, ils peuvent être ajoutés à la bonne concentration pour autant que tous les anticorps utilisés sont tirés de spec hôte différents. </li><li> Laver les lamelles pendant 10 min dans 1X DPBS. </li><li> Incuber le côté pile des lamelles vers le bas dans 50 ul de solution d&#39;anticorps secondaire pendant 1 heure à 37 ° C. Alexa Fluor-anticorps conjugués (Invitrogen) peut être utilisé pour générer une gamme de couleurs et sont utilisés à 1:500 dans une solution de blocage, les 1X 1X DPBS. </li><li> Laver les lamelles à deux reprises pendant 10 minutes dans chacune des DPBS 1X. </li><li> Sécher le côté pile des lamelles sur papier Whatman. Soyez sûr de couvrir les lamelles pour éviter l&#39;exposition à la lumière et de blanchiment. </li><li> Une fois tout le liquide est évaporé, monter les lamelles sur des lames de frais en utilisant 8 ImmunoMount ul (Thermo Scientific, Inc). Tapoter doucement le bas de la lamelle à éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Appliquer le vernis à ongles sur les bords de la lamelle pour le fixer en place. </li><li> La visualisation de l&#39;ARN et des protéines par des techniques de microscopie est également essentielle à la réussite de cette technique. Réglages sur le microscope utilisé peut aider ou entraver la visualisation de sorte qu&#39;il est essentiel que leparamètres sur le microscope être réglé correctement et être cohérent d&#39;un échantillon à l&#39;autre dans une expérience donnée. Pour les réglages détaillés microscopie, optique et des combinaisons d&#39;anticorps s&#39;il vous plaît voir les références 1,10. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;ARN viral coloration peut être vu dans la figure 2. L&#39;ARN viral pour le VIH-1 est vu à travers le cytoplasme affiché diffuse, pour la plupart, bien que petite punctae cytoplasmique ne sont pas rares. La spécificité peut être vu en comparant les cellules positives pour les cellules environnantes qui affichent aucune fluorescence. Comme mentionné dans l&#39;introduction, le VIH-1 qui manque de la protéine régulatrice Rev produit un ARN qui est retenu dans le noyau: ce peut être visualisé comme un signal lumineux dans le noyau, et un manque d&#39;ARN intensité du signal fluorescent dans le cytoplasme. Surexpression de protéines cellulaires est également capable de décaler la distribution de l&#39;ARN du VIH-1 virales. Dans la figure 2 </strong&gt;, la surexpression de protéines impliquées dans le trafic vésiculaire endosomal (par exemple, Rab7-interaction protéine lysosomale (RILP) 11 ou N-terminale supprimé RILP (RILPN) 11, et les protéines qui interfèrent avec la fonction motrice dynéine [par exemple p50/dynamitin 1, 12], interférer avec la normale l&#39;état d&#39;équilibre de localisation de l&#39;ARN génomique viral tel que déterminé par des analyses FISH expression RILP conduit à re-localisation de l&#39;ARN génomique viral à l&#39;organisation des microtubules centre (MTOC) 13;. RILPN disperse les endosomes tardifs au sein de la cytoplasme en raison de l&#39;incapacité de se lier à p150 collé du complexe dynéine moteur 14 et des blocs p50/dynamitin la sous-unité de la grande dynéine moteur et communiqués endosomes tardifs, mais aussi la génomique viral ARN-VIH-1 des protéines structurales de la périphérie de la cellule 1 (Figure 2). La manipulation de la localisation l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARN génomique viral, un facteur clé de l&#39;infectiosité desparticules virales, serait la clé de l&#39;élaboration éventuelle d&#39;agents thérapeutiques. Dans nos mains, l&#39;ARN viral apparaît dans la cellule dès 3 heures post-transfection et l&#39;infection devient 10 et facilement observable par cette technique FISH par 12 heures. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme du protocole de FISH / SI co-analyses. Les cellules sont cultivées sur des lamelles, puis fixées avec du paraformaldéhyde. Traitements de la glycine et de Triton-X sont effectuées avant que les cellules sont soit utilisés pour FISH / FI ou stockés dans l&#39;éthanol à 70% pour le stockage. Les cellules déshydratées pour le stockage sont réhydratés dans du DPBS 1X (traitée au DEPC PBS) avant de continuer vers FISH / SI. Les cellules sont traitées avec de la DNase I et laissé une nuit à s&#39;hybrider avec la sonde. Une fois terminée l&#39;hybridation, les cellules sont lavées avec du formamide, ainsi qu&#39;avec SSPE, et un 1X finales DPBS rinçage. Solution de blocage est appliqué à des cellules, suivie d&#39;une incubation avecles anticorps primaires. Après lavage, les anticorps secondaires sont appliquées. Deux derniers lavages dans 1X DPBS compléter la procédure de coloration où sur les lamelles sont séchées et montées sur des lames pour l&#39;imagerie. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs en utilisant FISH / SI co-analyses. A) du VIH-1 est transfecté dans des cellules HeLa et dans certains cas, avec des constructions qui causent la surexpression de protéines cellulaires (RILP, p50/Dynamitin et RILPΔN (une délétion amino-terminale mutant)) . FISH / SI co-analyses ont été effectuées: l&#39;ARN est identifié en vert avec soit G3BP ou LAMPE1 (rouge) de se différencier. B) le VIH-1 est exprimé dans des cellules HeLa, et recueillis à différents moments. Expression de l&#39;ARN viral est suivi en vert tandis que la protéine cellulaire, hnRNP A1, est coloré en rouge. Taille barres sont 10 um. Images modifiées à partir de références (1 chiffres sélectionnez à partir du panneau A; RILP, p50/Dynamitin, et RILP DELTAN)et 17 (partie B).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

FISH / SI co-analyses est une méthode fiable de visualiser l&#39;ARN viral dans les cellules qui a été affiné 9,15,16. Au cours de plusieurs années, nous avons développé une méthode raffinée de la coloration de l&#39;ARN. Cette technique peut être utilisée sur un large éventail de types de cellules à condition que la sonde est spécifique à l&#39;ARN cible 17. Par marquage de la sonde avec DIG, nous sommes capables de visualiser des ARN par coloration simple. Lorsque la coloration de l&#39;ARN et des protéines d&#39;autres sont combinés, FISH / SI co-analyses deviennent un outil puissant d&#39;observer des structures cellulaires et protéine / ARN de localisation. La spécificité de la détection de l&#39;ARN est assez élevé. Ceci est illustré dans la figure 2. Dans certains de l&#39;œuvre originale qui mettait l&#39;accent sur ​​la génomique de localisation d&#39;ARN viral, POISSON établi que le manque de Rev piégé l&#39;ARN viral dans le noyau 18. Depuis cela, abondante de nouvelles informations sur la localisation génomique virale ARN a été obtenu en utilisant la technique décrites ici. Par protéines cellulaires surexprimant, les populations-et spécifiques pas tous de l&#39;ARN viral peut être forcé à se localiser au niveau de différentes régions de la cellule. Surexpression RILP, qui ressemble le phénotype obtenu lorsque hnRNP A2 est appauvri par des siRNA par le VIH-1-cellules exprimant 13, provoque l&#39;ARN de manière visible s&#39;accumulent à la MTOC. L&#39;ARN viral génomique peut être poussé à la périphérie de la cellule en désactivant la protéine moteur moins-end, la dynéine: la surexpression p50/Dynamitin ou démontable des chaînes lourdes de dynéine 1 résultats dans la libération de l&#39;ARN génomique viral à partir des domaines intracellulaires de la périphérie cellulaire ( Figure 2). Un mutant de RILP, RILPΔN, qui ne se lie plus le moteur dynéine, disperse les endosomes (marqués par LAMPE1) dans le cytoplasme, car ils ne sont plus activement localisés à des domaines juxtanucléaire. Ces résultats soulignent la notion d&#39;une population en plastique du VIH-1 ARN génomique et en particulier, que les différents bassins du VIH-1 génomiqueARN existent avec des rôles parfois identifiables dans le cycle de réplication virale. Ces mêmes notions ont déjà été identifiés pour la protéine codée par cet ARNm, Gag 19. Il ya des limites à l&#39;utilisation de FISH / SI co-analyses qui sont relatifs au choix d&#39;anticorps et de disponibilité. L&#39;optimisation de la meilleure combinaison d&#39;anticorps primaires et secondaires, et leurs concentrations, prendra du temps pour optimiser (voir le tableau 1 &amp; 2). Anticorps faites à partir d&#39;hybridomes ou produites par les grandes entreprises peuvent avoir des concentrations qui varient de 1:2 à n&#39;importe 1:2000, mais assurez-vous de suivre les directives fournies par le fabricant pour obtenir les meilleurs résultats. L&#39;hôte dans lequel l&#39;anticorps est produit doivent également être pris en considération. Moutons de mélange avec des anticorps de chèvre doit également être évitée dans les anticorps primaires et secondaires, il en résulte combinaison en arrière-plan haute en raison de contre-reconnaissance des espèces (données non présentées). Pour Alexa Fluor-secondaanticorps ry, la concentration peut être utilisé à 1:500 pour presque tous les anticorps dans l&#39;ensemble. L&#39;autre inconvénient de FISH / SI co-analyses tel que décrit dans le présent rapport est-il capte les ARN à son emplacement à l&#39;état stationnaire, après que les cellules ont été fixées et perméabilisées avec du paraformaldéhyde et de détergent (figure 1). Toutefois, l&#39;ARN dans les cellules vivantes d&#39;imagerie a été obtenu grâce à une variété de moyens 20-22, la plupart du temps en utilisant des variations de génomes ARN viral qui sont marqués par des protéines fluorescentes comme la GFP. Cependant, des moyens supplémentaires afin d&#39;identifier la localisation d&#39;ARN dans les cellules vivantes continuent de faire surface. Ces nouvelles méthodes impliquent des ARN de marquage à l&#39;aide d&#39;épinards 23, 24, SNAP ou mTrip 2. Ces techniques souffrent également de quelques inconvénients, y compris l&#39;obligation de perméabiliser les cellules avant d&#39;ajouter que substrats ou un fragment doit être conçu pour marquer l&#39;ARNm dans le but de détecter l&#39;ARNm par microscopie. En effet, le progrès le grandntage des analyses FISH décrites dans le présent rapport réside dans le fait que le natif d&#39;ARN n&#39;est pas altérée conduisant à des résultats les plus pertinents physiologiquement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles 18mm </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Pour 4%: Dissoudre 20g dans 500mL 1XDPBS à 60 ° C avec 5 gouttes de NaOH. le pH à 7,2 au large de la chaleur et conserver à -20 ° C. Ne pas dépasser 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluer Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG ARN étiquetage Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transcription ARN polymérase de T7 </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Colonnes Spin rapides </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Le formamide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> ARNt </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps fluorescent Enhancer Set pour la détection DIG # 4 (solution de blocage) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticorps secondaires </td><td> Invitrogen </td><td> Voir le tableau 2 </td><td></td></tr><tr><td> Four à hybridation </td><td> Boekel Sciscientifique </td><td> Modèle 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaques </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Identification des réactifs spécifiques et des équipements <table border="1"><tbody><tr><td> Espèce de anticorps anti-DIG (dilution, le nombre catalogue de la société,) </td><td> Couleurs </td><td> Alexa Fluor utilisé (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Souris (1:500; Sigma, B7405) </td><td> vert </td><td> Alexa Fluor 488 d&#39;âne anti-souris (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rouge </td><td> Alexa Fluor 594 d&#39;âne anti-souris (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> bleu </td><td> Alexa Fluor 647 d&#39;âne anti-souris (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> vert </td><td> Alexa Fluor 488 d&#39;âne anti-mouton (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rouge </td><td> Alexa Fluor 594 d&#39;âne anti-mouton (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> bleu </td><td> Alexa Fluor 647 d&#39;âne anti-mouton (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Combinaisons Tableau 2. D&#39;anticorps secondaires et anti-DIG répertorié avec les numéros de catalogue et les concentrations.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Les virus qui infectent les cellules de susciter des modifications spécifiques à des fonctions cellulaires normales qui servent à détourner l&#39;énergie et des ressources pour la réplication virale. De nombreux aspects de la fonction des cellules d&#39;accueil sont réquisitionnés par des virus, habituellement par l&#39;expression de produits de gènes viraux que les protéines de la cellule hôte et de recruter de machineries. En outre, les virus organites ingénieur membranaires spécifiques ou étiquette sur au vésicules mobiles et des protéines à moteur à cibler les régions de la cellule (cours de l&#39;infection de novo, virus coopter protéines moteur moléculaires pour cibler le noyau; plus tard, pendant l&#39;assemblage du virus, ils se détournent cellulaire mécanismes qui aideront à l&#39;assemblage des virus). Moins on entend sur la façon dont les virus, en particulier ceux dont les génomes ARN, de coordonner le trafic intracellulaire de protéines et de composants d&#39;ARN et de la façon dont ils obtenir l&#39;assemblage des particules infectieuses à des loci spécifiques dans la cellule. L&#39;étude de la localisation d&#39;ARN a commencé dans les travaux antérieurs. Développer em eucaryotes inférieursbryos et les cellules neuronales fourni d&#39;importantes informations biologiques, et a également souligné l&#39;importance de la localisation d&#39;ARN dans la programmation des cascades d&#39;expression des gènes. L&#39;étude dans d&#39;autres organismes et des systèmes cellulaires a donné des informations importantes similaire. Les virus sont des parasites obligatoires et doivent utiliser leurs cellules hôtes pour se répliquer. Ainsi, il est essentiel de comprendre comment les virus à ARN diriger leurs génomes ARN du noyau, à travers le pore nucléaire, à travers le cytoplasme et sur ​​l&#39;un de ses destinations finales, dans les particules virales descendance 1. POISSON sert comme un outil utile pour identifier les changements dans l&#39;état d&#39;équilibre de localisation de l&#39;ARN viral. Lorsqu&#39;il est combiné avec l&#39;immunofluorescence (IF) analyse 22, FISH / SI co-analyses fourniront des renseignements sur la co-localisation des protéines avec l&#39;ARN viral 3. Cette analyse fournit donc un bon point de départ pour tester les interactions ARN-protéine par des techniques biochimiques ou biophysiques d&#39;autresessais 4,5, étant donné que la co-localisation par lui-même n&#39;est pas assez de preuves pour être certain d&#39;une interaction. En étudiant la localisation d&#39;ARN viral en utilisant une méthode de ce genre, des informations abondantes a été acquise sur les deux événements viraux et cellulaires de trafic d&#39;ARN 6. Par exemple, le VIH-1 produit des ARN dans le noyau des cellules infectées, mais l&#39;ARN est seulement traduit dans le cytoplasme. Quand on protéine clé virale est manquant (Rev) 7, POISSON de l&#39;ARN viral a révélé que le bloc à la réplication virale est due à la rétention des VIH-1 ARN génomique dans le noyau 8. Ici, nous présentons la méthode pour l&#39;analyse visuelle des ARN génomique viral in situ. La méthode permet l&#39;utilisation d&#39;une sonde marquée ARN. Cette sonde est conçue pour être complémentaire de l&#39;ARN génomique viral. Au cours de la synthèse in vitro de la sonde ARN antisens, le ribonucléotide qui est modifié avec de la digoxigénine (DIG) est inclus dans un essai in vitro transcription réactionnel. Une fois la sonde s&#39;est hybridée à l&#39;ARNm cible dans les cellules, les étapes ultérieures de l&#39;étiquetage d&#39;anticorps (figure 1) permettra de connaître la localisation de l&#39;ARNm ainsi que des protéines d&#39;intérêt lors de l&#39;exécution FISH / SI.

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Une fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH) a été développée pour détecter visuellement ARN génomique viral en utilisant la microscopie à fluorescence. Une sonde est faite avec une spécificité de l&#39;ARN viral qui peut ensuite être identifiés en utilisant une combinaison de l&#39;hybridation et des techniques d&#39;immunofluorescence. Cette technique offre l&#39;avantage d&#39;identifier la localisation de l&#39;ARN viral ou ADN à l&#39;état stationnaire, fournissant des informations sur le contrôle des événements intracellulaires trafic de virus.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K vues.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. Une fluorescence In situ (FISH) a été développée pour détecter visuellement ARN génomique viral en utilisant la microscopie à fluorescence. Une sonde est faite avec une spécificité de l'ARN viral qui peut ensuite être identifiés en utilisant une combinaison de l'hybridation et des techniques d'immunofluorescence. Cette technique offre l'avantage d'identifier la localisation de l'ARN viral ou ADN à l'état s...

Vidéo: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Recherche

Biologie

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Fluorescent rapide<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d&#39;immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La détection des protéines liant l&#39;ARN par<em&gt; In vitro</em&gt; ARN Pull-down en adipocytes Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...