Les auteurs tiennent à remercier le Département de biologie de l&#39;Université de Syracuse et le Dr Marilyn Kerr pour leur rôle dans l&#39;administration du cours de biologie des vertébrés comparative. Le laboratoire Albertson est financée par la subvention R21DE019223 de la National Institutes of Health / Institut national de recherche dentaire et craniofaciale, ainsi que la subvention R01AG031922 de la National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Transformation du plasmide cible d&#39;ADNc Partie I: Transformation du plasmide (Temps requis: 3 heures plus une nuit d&#39;incubation) <ol><li> Chaud SOC bouillon nutritif dans un bain de 42 ° C de l&#39;eau (500 pi par réaction) </li><li> Décongeler les cellules compétentes sur la glace </li><li> Ajouter 1 ul de plasmide à 25 uL des cellules compétentes </li><li> Placez-les sur de la glace pendant 20 minutes </li><li> Cellules de choc thermique dans 42 salle de bain ° C de l&#39;eau pendant 45 secondes </li><li> Placez immédiatement les cellules sur de la glace pendant 2 minutes </li><li> Ajouter 500 ul de 42 ° C bouillon nutritif à chaque flacon de cellules </li><li> Agiter à 37 ° C pendant 2 heures à 255 rotations par minute (rpm) </li><li> Plaque 75 ul mélange de transformation sur le milieu Luria Bertani (LB) des plaques d&#39;agar </li><li> Incuber inversé à 37 ° C pendant la nuit </li></ol> Partie II: E. Culture coli (Temps requis: 15 minutes, plus une nuit d&#39;incubation) <ol><li> Pour chaque réaction,aliquote de 3 ml de bouillon LB et 3 ul de 50 mg / ml d&#39;ampicilline dans un tube de culture </li><li> Grattez 1 colonie de bactéries de la plaque d&#39;agar et ajouter à chaque tube de culture </li><li> Agiter les tubes de culture à 37 ° C à 255 tours par minute pendant la nuit </li></ol> Partie III: Préparation du plasmide (Temps requis: 1,5 heures) <ol><li> Isoler plasmide de cultures d&#39;une nuit en utilisant le 5 Kit Premier Mini FastPlasmid (catalogue # 2300000) </li><li> Pour vérifier la présence de plasmide préparé, exécutez l&#39;ADN élué de la trousse à raison de 1% de Tris-Acétate-EDTA (TAE) Gel coloré au bromure d&#39;éthidium </li></ol> 2. In Situ DIG-ARN marqué la sonde de synthèse Partie I: La linéarisation du plasmide (Temps requis: 2,5 heures) <ol><li> Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: <table border="1"><tbody><tr><td> Préparé plasmide </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> * Restriction Enzyme </td&gt; <td> 2 ml </td></tr><tr><td> Tampon ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10X albumine bovine sérique (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) Eau </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incuber à 37 ° C pendant 2 heures * Varie avec le plasmide ** Varie avec l&#39;enzyme de restriction </li></ol> Partie II: transcription (Temps requis: 3 heures) <ol><li> Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: <table border="1"><tbody><tr><td> Le plasmide linéaire </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Tampon de transcription 10X ** </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Label Mix digoxigénine </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> * Polymérase </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> L&#39;eau DEPC </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1 heure </li><li> Ajouter 2 ul de polymerase * </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1 heure </li><li> Ajouter 2 ul de DNase </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 20 minutes * Varie avec le plasmide ** Varie en fonction de la polymérase </li></ol> Partie III: Précipitations (Temps requis: 5 minutes plus 2 heure à une nuit d&#39;incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension) <ol><li> Ajouter 4 ul de 0,2 M EDTA </li><li> Ajouter 5 ul de chlorure de lithium 4M </li><li> Ajouter 150 ul d&#39;éthanol à 100% de la glace froide </li><li> Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit </li><li> Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin </li><li> Séchez à granulés pendant 7 minutes </li><li> Remettre en suspension dans 20 ul d&#39;eau DEPC </li><li> Incuber à37 ° C pendant 5 minutes </li></ol> Partie IV: Fractionnement - Effectuer seulement si la taille de la sonde est supérieure à 0,6 kb (Temps nécessaire: Varie en fonction de la taille de la sonde, généralement pas plus de 20 minutes) <ol><li> Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: <table border="1"><tbody><tr><td> Sonde ARN </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L&#39;eau DEPC </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Carbonate de sodium </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incuber dans un bain d&#39;eau à 60 ° C. Baser le temps d&#39;incubation sur l&#39;équation: Temps (min.) = (à partir ko - souhaité ko) / (0,11 x à partir ko x souhaité ko) Moyenne taille désirée = 0,6 kb </li></ol> Partie V: Précipitations final (Temps requis: 5 minnutes plus 2 heure à une nuit d&#39;incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension, 1 heure pour électrophorèse sur gel) <ol><li> Ajouter 40 ul d&#39;eau DEPC </li><li> Ajouter 8 ul d&#39;acétate de sodium </li><li> Ajouter 1,04 ul d&#39;acide acétique glacial </li><li> Ajouter 240 ul de glace froide éthanol à 100% </li><li> Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit </li><li> Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin </li><li> Séchez à granulés pendant 7 minutes </li><li> Remettre en suspension dans 20 ul d&#39;eau DEPC </li><li> Vortex pour mélanger </li><li> Pour vérifier la présence de ribosonde, exécutez la solution re-suspendu sur un gel coloré TAE 1% au bromure d&#39;éthidium </li></ol> 3. Mont toute hybridation in situ Partie I: Fixation des embryons et la protéinase K Digestion (Temps requis: Correction heures de nuit majoré de 4 le lendemain pour le stockage, 2,5 heures de stockage à la partie II) <ol><li> Recueillir mise en scène embryons de poisson zèbre et le fixer à 4% parformaldéhyde (PFA) pendant une nuit à 4 ° C </li><li> Laver embryons fixes en tampon phosphate salin contenant 0,1% de Tween-20 (PBST) 3 fois pendant 10 minutes chacun </li><li> Pour assurer que l&#39;exposition des embryons à des réactifs de laboratoire, les embryons manuellement dechorionate (si nécessaire) en utilisant une pince à pointe fine </li><li> Déshydrater embryons par lavage dans une série graduée de 25% et 50% de methanol dans du PBST pendant une heure chaque lavage, puis stocker dans le méthanol à 100% à -20 ° C </li><li> Lorsque vous êtes prêt à utiliser, réhydrater les embryons dans du PBST par un lavage à 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST pendant 10 minutes chacun. Enfin laver 2 fois pendant 10 minutes chacun dans du PBST 100%. Le calendrier exact n&#39;est pas important pour PBST / méthanol lavages </li><li> Embryons de blanchiment dans une solution de peroxyde d&#39;hydrogène à 10% dans du PBST, si nécessaire, pour éliminer les pigments noirs. Les embryons doivent incuber dans une solution de peroxyde d&#39;hydrogène pendant 10-20 minutes, en fonction de l&#39;âge de l&#39;embryon, et le bouchon du tube de centrifugeuse doit rester ouvert afin d&#39;éviter l&#39;accumulation d&#39;airpression </li><li> Recueil des embryons de 50 mg / ml protéinase K diluée à 1:5000 dans du PBST pendant 3-15 minutes, en fonction de l&#39;âge de l&#39;embryon </li><li> Re-fix embryons en PFA à 4% pendant 30 minutes, puis laver 3 fois dans du PBST pendant 5 minutes de chaque </li></ol> Partie II: L&#39;hybridation des ribosondes (Temps requis: 3 heures et nuit à l&#39;hybridation, 1,5 heure le lendemain à la partie III) <ol start="9"><li> Prehybridize embryons avec une solution de pré-hybridation (PHS) dans un four préchauffé à 70 ° C eaux bain pendant 2-3 heures </li><li> Retirer PHS, ajouter 0,5 ml de solution d&#39;hybridation et 1,5 uL précédemment synthétisés digoxigénine ribosondes étiquetés, incuber à 70 ° C pendant la nuit. La température peut varier de quelques degrés en fonction de la cible ribosonde </li><li> Le lendemain, lavez embryons à 70 ° C dans des solutions graduées de 75%, 50% et 25% PHS en 2X solution saline de citrate de sodium (SSC) pendant 10 minutes chacun, puis laver à 0,2 X SSC pendant 30 minutes à 68 ° C </li><li Wash&gt; dans le tampon acide maléique (MAB) 2 fois pour 10 minutes chacune à la température ambiante </li></ol> Partie III: Anti-digoxigénine (DIG-α) d&#39;incubation d&#39;anticorps (Temps requis: 3 heures et nuit à bloquer, 2,5 heures le lendemain de la partie IV) <ol start="13"><li> Transfert d&#39;embryons à une plaque à 12 puits </li><li> Pré-bloc embryons dans une solution de blocage 1-2 ml pendant au moins 3 heures à température ambiante </li><li> Simultanément, avant de bloquer la préparation d&#39;anticorps par un deuxième volume de solution de blocage et de dilution de l&#39;anticorps anti-digoxigénine 1:2000 dans cette solution </li><li> Retirer pré-bloc et ajouter 1-2 ml pré-bloqué α-DIG solution, incuber une nuit à 4 ° C </li><li> Le lendemain, lavez les embryons in MAB. Laissez les embryons en incubation dans du MAB pour 5 premières minutes, puis effectuez les modifications de tampon et incuber pendant deux 10 minutes, une de 30 minutes et un intervalle de 60 minutes. Le calendrier exact n&#39;est pas nécessaire </li><li> Laver 3 fois les embryons pendant 5 minutes chaque in phosphatase alcaline (AP) tampon </li></ol> Partie IV: La coloration et le traitement final (Temps requis: 1 heure à une nuit pour la coloration, selon la ribosonde utilisé, 4 heures à début de lavages glycérol, 6-10 heures par cycle de lavage, le glycérol peut être stockée dans de la glycérine) <ol start="19"><li> Ajouter 1-2 ml de solution de coloration des embryons, enveloppez-le dans du papier plaque, et vérifier la coloration à intervalles réguliers (environ toutes les 20 minutes) jusqu&#39;à ce que la coloration est suffisante </li><li> Laver embryons avec du PBST 2 fois pendant 5 minutes chacun pour arrêter la réaction de coloration </li><li> Déshydrater embryons en utilisant 10 lavages minute 25% (1 heure) et 50% (2 fois) méthanol dans du PBST, puis dans le méthanol à 100%, pour enlever les taches de fond </li><li> Laissez embryons à incuber dans du méthanol à 100% pendant au moins 2 heures à la température ambiante </li><li> Réhydrater en utilisant PBST 10 lavages minute 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST, puis lavez à 100% PBST 2 fois </li><li> Transfert électronique teintémbryos à une solution de glycérol à 80% dans du PBST, en utilisant une série graduée de lavages, et conserver à 4 ° C. </li></ol> Recettes: <ul><li> Plaques de gélose LB-10 gélose LB + 250 g ml d&#39;eau distillée, autoclave, lorsqu&#39;elles sont froides au toucher ajouter 250 ul d&#39;ampicilline, versez 15-20 ml de solution chaude dans chaque boîte de Pétri, gélose permettent de solidifier </li><li> Bouillon LB-12.5 bouillon LB + 200 g ml d&#39;eau distillée, autoclave, laisser refroidir avant de l&#39;utiliser </li><li> 1% TAE gel d&#39;agarose 0,4 g, 40 ml TAE 1X, 2 ul de bromure d&#39;éthidium; charge 7 pl plasmide (plasmide de transformation de la cible d&#39;ADNc) ou 3 et 4 ribosonde ul ul d&#39;eau DEPC (En synthèse DIG marqué in situ d&#39;ARN Probe) + 1 colorant de charge pL, 5 pl échelle d&#39;ADN </li><li> Préhybridation solution-50% de formamide, 5X SSC, 9.2mm acide citrique, 1% de Tween-20 </li><li> Hybridation solution de pré-hybridation solution plus 500 pg / ml d&#39;ARNt et 50 pg / ml d&#39;héparine </li><li> MAB-100 mM d&#39;acide maléique, 150 mM NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% de Tween-20, le pH à 70.5 </li><li> Blocking Solution-3 pièces MAB, 1 pièce 10% de réactif Boehringer blocage dans MAB, 1 partie de la chaleur désactivé agneau sérum </li><li> Tampon AP-60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% de Tween-20 </li><li> Coloration Solution-5-Bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) et Nitro bleu de tétrazolium (NBT) en tampon AP </li></ul> 4. Les résultats représentatifs Quand elle est réalisée correctement, la réaction entre le NBT, CBPI, et la phosphatase alcaline se former un précipité violet qui doit figurer sur l&#39;embryon de poisson zèbre comme une tache pourpre. Ribosondes doit être préalablement synthétisé à partir de l&#39;ADNc correspondant au gène d&#39;intérêt. Par conséquent, on peut conclure toute tache représente visualiser les zones du poisson zèbre dans lequel le gène d&#39;intérêt a été transcrit à ce stade de développement particulier. Pour les besoins de ce cours, ribosondes ont été synthétisés à partir de aldh1a2 (anciennement raldh2; Begemannet al, 2001;. Figure 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figure 2); Deltac (Oates et al, 2005);. MyoD1 (Weinberg et al, 1996);. SHHA (Krauss et al,. 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figure 3) et myl7 (anciennement cmlc2;. Yelon et al, 1999) ADNc. La coloration a été prévu sur la ligne médiane et dans les structures anatomiques, y compris les somites, bourgeon caudal, myotome, le cerveau et le cœur. Ace/fgf8a mutants étaient censés avoir des défauts dans la plupart de ces structures. La coloration a été facilement visualisées avec un microscope standard dissection. Autres sources contiennent plus d&#39;informations sur le dépannage et SOUHAITEZ des techniques similaires à celles décrites ici (Clark, 2003; D&#39;Costa et al, 2009;. Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. A emb poisson zèbreryo 24 heures après la fécondation, ce qui a été hybridée avec ribosondes spécifiques pour aldh1a2. Le marquage spécifique peut être vu dans les yeux, rhombencéphale, pectorale nageoire bourgeon primordia, et somites. Est antérieure à la partie supérieure, postérieure est au fond. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un embryon de poisson zèbre à l&#39;étape 13 somites de développement qui a été hybridé avec une sonde spécifique pour fgf8a. La coloration spécifique est vu dans le télencéphale, diencéphale dorsal, le mésencéphale-rhombencéphale limite, somites, et bourgeon caudal. Ventrale est à gauche, dorsale est à droite. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figure 3" /> La figure 3. A 22 heures après la fertilisation embryon de poisson zèbre qui a été hybridé avec une sonde ribonucléique spécifique pour pax2a, un marqueur solide utile pour la visualisation du système nerveux. Le marquage spécifique peut être seen dans la fissure choroïde, le mésencéphale-rhombencéphale limite, vésicule otique, et les neurones de la moelle épinière. Vue dorsale d&#39;avant à gauche.

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WISH a été utilisé dans un cours de laboratoire biologie comparative des vertébrés afin d&#39;aider les élèves à comprendre le rôle de la génétique dans le développement anatomique grâce à la visualisation des profils d&#39;expression génique connus. Pour la première partie du cours, les élèves ont exécuté des dissections sur les organismes représentant plusieurs taxons différents chordés, ce qui leur permet amplement de temps pour étudier, comprendre, comparer, et l&#39;anatomie des vertébrés contraste. En guise d&#39;introduction à la deuxième partie du cours, les étudiants ont donné une conférence formelle décrivant développement du poisson zèbre et l&#39;anatomie. Les méthodes et les résultats attendus de l&#39;expérience WISH ont également été discutées. Les élèves ont ensuite eu le poisson-zèbre en direct à somitogenèse et prim-6 stades de développement, et à 2 et 5 jours après la fécondation (dpf) d&#39;examiner à la loupe binoculaire. Il s&#39;agissait de donner aux étudiants une meilleure compréhension de ce embryons de poisson zèbre ressemble et les types de changements morphologiques qui se produisent over l&#39;ontogenèse. Lors de la séance de laboratoire suivant, les élèves ont reçu embryons de poisson zèbre dans lequel WISH avaient déjà été effectuées. On leur a demandé d&#39;étudier et de décrire les profils d&#39;expression génique pour chaque gène d&#39;intérêt (ribosonde utilisé). Embryons utilisés pour WISH ont été obtenues à partir de croisements entre les membres d&#39;une lignée hétérozygote ace/fgf8a. Sur la base de l&#39;hérédité mendélienne, 25% des embryons issus des croisements ace/fgf8a devaient être des mutants homozygotes et à présenter des défauts dans la plupart des structures anatomiques ont porté sur ce cours. Selon les rapports publiés et les observations non publiées dans le laboratoire Albertson, des défauts dans le cerveau et le coeur en boucle incorrecte étaient attendus, ainsi que les défauts dans les somites (Brand et al, 1996;. Albertson et Yelick, 2005; observations personnelles). Les étudiants ont été invités à examiner tous les échantillons, de type sauvage (animaux hétérozygotes sont indiscernables des frères et sœurs de type sauvageaux premiers stades de développement) et des mutants homozygotes pour chaque profil d&#39;expression génique présenté. Ils ont ensuite été invités à rédiger des rapports de laboratoire décrivent leurs résultats, et en fonction de leur connaissance de l&#39;anatomie et de la génétique, comment l&#39;expression des gènes défectueux peuvent avoir précipité malformations anatomiques. Les élèves semblaient recevoir cet exercice de laboratoire avec enthousiasme et curiosité. La plupart n&#39;avaient jamais utilisé SOUHAITEZ avant et ont été très intéressés par cette partie du cours. Les élèves ont trouvé les différents modes d&#39;expression des gènes dans les embryons de poisson zèbre intrigants, certaines tendances décrites même la coloration visualisé en les associant avec de grands dessins et symboles, comme un visage souriant. Les rapports de laboratoire ont montré résultant des étudiants avaient une compréhension générale du protocole WISH et l&#39;expression de gènes spécifiques dans des structures anatomiques. Les étudiants ont également besoin de comprendre les fonctions spécifiques des gènes étudiés en utilisant le souhaitez durant le laboratoire (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;. Geetha-Loganathan et al, 2008b).. Il est évident cependant que certains élèves avaient des connaissances de base limitée des voies de signalisation et de gènes d&#39;intérêt. Plus d&#39;informations sur ces concepts dans le SOUHAITEZ cours d&#39;introduction peut être une addition bienvenue à l&#39;utilisation de WISH dans les futurs cours de biologie comparée des vertébrés. Depuis le protocole prend généralement quatre jours consécutifs, selon le calendrier du cours, les étudiants ne peuvent être en mesure d&#39;effectuer une partie de l&#39;expérience en classe et l&#39;instructeur doit être responsable pour le reste. Dans notre classe de biologie comparée des vertébrés, les élèves de la réaction de coloration en laboratoire, tandis que l&#39;Assistant d&#39;enseignement effectué toutes les étapes précédentes. Si il est préférable de demander aux élèves de réaliser SOUHAITEZ en classe, le protocole peut être divisé en sous-unités qui peuvent être effectuées sur l&#39;artlusieurs séances de laboratoire, selon le calendrier de la classe. Si ce n&#39;est pas possible pour les étudiants d&#39;effectuer l&#39;ensemble du protocole, comme il était ici en raison de la réunion de laboratoire seulement une fois par semaine, les élèves peuvent ajouter la solution de coloration au début de la classe et, en fonction de la ribosonde utilisé, le marquage complet moins d&#39;une heure. Le temps qu&#39;il faut pour que la tache de mettre au point varie considérablement d&#39;un ribosonde et une variété de conditions expérimentales, et doit être déterminée avant la classe. Notamment, si les élèves ne sera développer la tache dans le laboratoire, les instructeurs sera responsable de toutes les étapes précédentes, ce qui nécessitera beaucoup de temps et d&#39;efforts à l&#39;extérieur de la classe. Si vous le souhaitez, une alternative plus courte à WISH pourrait être immunohistochimie, en utilisant des étiquettes d&#39;anticorps de visualiser la localisation des protéines, mais à cette époque, le poisson zèbre anticorps spécifiques pour les gènes du développement ne sont pas facilement disponibles. Une autre option serait d&#39;effectuer WISH sur les espèces de vertébrés différentes d&#39;une demander aux élèves de comparer les profils d&#39;expression des mêmes gènes dans des organismes différents (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Organismes modèles émergents, 2008; organismes modèles émergents, 2010). L&#39;objectif primordial de l&#39;aide SOUHAITEZ dans un cours de biologie des vertébrés comparatif était de montrer aux élèves comment techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour étudier le développement anatomique. Il a également donné l&#39;occasion aux élèves de réfléchir sur la manière dont l&#39;expression du gène altéré peut conduire non seulement à des malformations du développement, mais aussi à des changements évolutifs. Formalisé comme la biologie du développement évolutionnaire (souvent dénommé «évo-dévo»), ce domaine en plein essor de l&#39;étude vise à relier le génotype et le phénotype par le développement, et d&#39;élucider les bases mécanistiques potentiels du changement évolutif. Avec la montée de ce domaine, plus écologistes, des biologistes et des physiologistes organismiques, ont recours à des techniques moléculaires dans leurs recherches. Noussoutiennent que l&#39;utilisation de WISH dans un cours de biologie des vertébrés comparative aidera à garder le programme à jour avec les avancées technologiques et conceptuels de la recherche et de faciliter un meilleur alignement horizontal du haut cours de biologie de niveau en combinant sous-champs biologiques. En outre, cette approche intégrative offrira aux étudiants la possibilité d&#39;apprendre un assortiment de techniques de recherche biologiques dans un cours, conduisant à une formation plus diversifiée et la promotion de l&#39;avenir de la recherche scientifique interdisciplinaire.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> 5 Prime Kit Mini rapide plasmide (100 preps) </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 2300000 </td><td></td><tr><td> One Shot TOP10 chimiquement compétentes E. coli avec SOC moyen </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> C404003 </td><td></td><tr><td> Agar LB </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP1425-500 </td><td></td><tr><td> Bouillon LB </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP1426-500 </td><td></td><tr><td> Sel de sodium de l&#39;ampicilline </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP1760-5 </td><td></td><tr><td> Isopropanol </td><td></td><td> Acros </td&gt; <td> 42383-0010 </td><td></td><tr><td> Boîte de Pétri 100 x 20 mm non traitée </td><td></td><td> Produits de laboratoire ventes </td><td> 430591 </td><td></td><tr><td> 14 Tube Culture ml, Haut snap </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 1495911B </td><td></td><tr><td> Enzymes de restriction et Buffers &amp; 10xBSA </td><td></td><td> New England Bio Labs </td><td> varie </td><td></td><tr><td> Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) 25 ml </td><td></td><td> Sigma </td><td> D5758-25 ml </td><td></td><tr><td> Sodium acétate trihydraté USP / FCC 500g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> s608500 </td><td></td><tr><td> Gal 200 proof alcool éthylique </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 04-355-451 </td><td></td><tr><td> Tris-Acétate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp13321 </td><td></td><tr><td> Agarose Low TEE 100 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP160-100 </td><td></td><tr><td> D&#39;éthidiumBromure de 10 ml </td><td></td><td> Sigma </td><td> 45-E1510 </td><td></td><tr><td> Gel Saccharose Saccharose Chargement Dye 40% </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP655-1 </td><td></td><tr><td> 1 kb d&#39;ADN complet Ladder Échelle </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP2582200 </td><td></td><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td></td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td><tr><td> T3 RNA Polymerase </td><td></td><td> Roche </td><td> 1031163 </td><td></td><tr><td> T7 RNA Polymerase </td><td></td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td><tr><td> SP6 ARN polymérase </td><td></td><td> Roche </td><td> 810274 </td><td></td><tr><td> Protecteur inhibiteur de RNase </td><td></td><td> Roche </td><td> 3335399001 </td><td></td><tr><td> DNase I, RNAse 10.000 unités </td><td></td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td><tr><td> Réactif EDTA biologie moléculaire </td><td></td><td> Sigma </td><td> e5134-500G </td><td></td><tr><td> 100 g de chlorure de lithium </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> L121100 </td><td></td><tr><td> Carbonate de sodium 1 kg </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP357-1 </td><td></td><tr><td> Bicarbonate de sodium, 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BP328-500 </td><td></td><tr><td> Acide acétique glacial ACS 500 ml </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> a38500 </td><td></td><tr><td> Paraformaldéhyde R 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> o4042500 </td><td></td><tr><td> PBS Phosphate Buffer Saline 10X </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp3991 </td><td></td><tr><td> Entre 20 500 ml </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp337500 </td><td></td><tr><td> Méthanol 5 L </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> A4124 </td><td></td><tr><td> Protéinase K à 50 mg </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp170050 </td><td></td><tr><td> Formamide 1 L </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> F841 </td><td></td><tr><td> 20x SSC 1 L </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp13251 </td><td></td><tr><td> Acide citrique anhydre ACS 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> a940500 </td><td></td><tr><td> L&#39;acide ribonucléique de transfert de type V </td><td></td><td> Sigma </td><td> r7876-2.5KU </td><td></td><tr><td> L&#39;héparine sel de sodium 50 mg </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp252450 </td><td></td><tr><td> L&#39;acide maléique R 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> o3417500 </td><td></td><tr><td> Chlorure de sodium 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> s271500 </td><td></td><tr><td> Hydroxyde de sodium 500 g </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> s318500 </td><td></td><tr><td> Blocage réactif </td><td></td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td><tr><td> Agneau Sérum 500 ml </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td><td></td><tr><td> Anti DIG AP fragments </td><td></td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td><tr><td> 2M solution Tris 500 ml </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> bp1759500 </td><td></td><tr><td> 500 g Chlorure de magnésium </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> m33500 </td><td></td><tr><td> BCIP 3 ml </td><td></td><td> Roche </td><td> 11383221001 </td><td></td><tr><td> NBT 3 ml </td><td></td><td> Roche </td><td> 11383213001 </td><td></td><tr><td> Glycérol 99% 2,5 L </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> AC158920025 </td><td></td><tr><td> Plaque 12 puits PS ST w / couvercle </td><td></td><td> VWR </td><td> 62406-165 </td><td></td><tr><td> Tube 15 ml bouchon à vis 50/rack 500/cs </td><td></td><td> Produits de laboratoire ventes </td><td> L262861 </td><td></td><tr><td> Tube 50 ml bouchon à vis 25/rack 500/cs </td><td></td><td> Produits de laboratoire ventes </td><td> L262890 </td><td></td><tr><td> 1,6 ml microtube </td><td></td><td> LABORATOIRE Ventes Produits </td><td> L234401 </td><td></td><tr><td> 2 Parafilm 2 &quot;x 250 pi </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> s37441 </td><td></td><tr><td> Transfert Pipet 7 ml </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 1020-2520 </td><td></td><tr><td> Astuce de 0,1 à 10 ul Pipet, en vrac </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 1111-3000 </td><td></td><tr><td> 1-200 pointe de la pipette ul, en vrac </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 1111-0006 </td><td></td><tr><td> 101-1000 pointe de la pipette ul, en vrac </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 1111-2021 </td><td></td><tr><td> Papier d&#39;aluminium </td><td></td><td> Épicerie </td><td></td><td></td></tbody></table></div><div><ul><li> Autoclave </li><li> Micro-centrifugeuse </li><li> 37 ° C incubateur (avec agitateur) </li><li> 4 ° C micro-centrifugeuse </li><li> Bain d&#39;eau </li><li> Vortex </li><li> Appareil d&#39;électrophorèse sur gel </li><li> -20 ° Ccongélateur </li><li> Congélateur à -80 ° C </li><li> Rocker / agitateur </li><li> 4 ° C réfrigérateur </li><li> Microscope à dissection (de préférence avec un écran d&#39;apprentissage ou un appareil photo) </li></ul></div>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Mount toute hybridation in situ (WISH) est une technique courante dans les laboratoires de biologie moléculaire utilisées pour étudier l&#39;expression des gènes par la localisation des transcrits d&#39;ARNm spécifiques dans spécimen de montage ensemble. Cette technique (adapté de Albertson et Yelick, 2005) a été utilisé dans une salle de classe de premier cycle supérieure comparée des vertébrés de laboratoire de biologie à l&#39;Université de Syracuse. Les deux premiers tiers du parcours laboratoire biologie comparative des vertébrés a donné aux étudiants l&#39;occasion d&#39;étudier l&#39;embryologie et anatomie de plusieurs organismes représentant divers taxons chordés principalement par des dissections traditionnels et l&#39;utilisation de modèles. La dernière partie du cours impliquait une approche novatrice de l&#39;enseignement anatomie grâce à l&#39;observation du développement des vertébrés en utilisant des techniques moléculaires dans lesquels WISH a été effectuée sur des embryons de poisson zèbre. Un facteur de croissance de 8 fibroblastes hétérozygote une ligne (fgf8a) mutant, as, a été utilisé. En raison de Mendelia<html> héritage n, as croisements produit de type sauvage, hétérozygote, et les mutants homozygotes ace/fgf8a dans un rapport 1:2:1. Sondes d&#39;ARN avec des profils d&#39;expression connus de la ligne médiane et dans le développement de structures anatomiques tels que le cœur, les somites, bourgeon caudal, myotome et le cerveau ont été utilisés. WISH a été réalisée en utilisant le poisson zèbre au somite 13 et prim-6 étapes, avec des étudiants effectuant la réaction de coloration en classe. L&#39;étude des embryons de poisson zèbre à des stades différents de développement a donné aux étudiants la possibilité d&#39;observer la façon dont ces structures anatomiques changé au cours ontogenèse. En outre, certains mutants ace/fgf8a affiché en boucle cardiaque irrégulier et les défauts de somite et le développement du cerveau. Les étudiants de ce laboratoire ont observé le développement normal des divers organes et systèmes utilisant à la fois l&#39;anatomie externe ainsi que l&#39;expression des gènes. Ils ont également identifié et décrit les embryons présentant développement anatomique et une mauvaise expression des gènes (c.-à-mutants putatifs). ontenu &quot;&gt; Pour les instructeurs dans les établissements qui ne possèdent déjà le matériel nécessaire ou lorsque des fonds pour le laboratoire et l&#39;innovation curriculaires sont limitées, le coût financier des réactifs et l&#39;appareillage peut être un facteur à considérer, comme le temps et les efforts nécessaires à la partie de l&#39;instructeur, indépendamment du réglage. Néanmoins, nous soutenons que l&#39;utilisation de WISH dans ce type d&#39;environnement de laboratoire de classe peut fournir un lien important entre la génétique du développement et de l&#39;anatomie. Comme la technologie progresse et la capacité à étudier le développement organismique au niveau moléculaire devient plus facile, moins cher et de plus en plus populaire, de nombreux biologistes évolutionnistes, les écologistes, physiologistes et se tournent vers des stratégies de recherche dans le domaine de la biologie moléculaire. Utilisation SOUHAITEZ dans une classe laboratoire de biologie comparative des vertébrés est un exemple de comment les molécules et l&#39;anatomie peuvent converger dans un seul cours. Cela donne supérieures des étudiants de niveau collégial la possibilité de pratiquer modernes res biologiquesearch techniques, conduisant à une formation plus diversifiée et la promotion de l&#39;avenir de la recherche scientifique interdisciplinaire.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Mount ensemble<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (WISH) a été utilisé dans un cours de premier cycle supérieure comparée des vertébrés Biologie, en plus de vertébrés dissections. Cela a donné aux étudiants la possibilité d&#39;étudier l&#39;expression des gènes ainsi que l&#39;anatomie macroscopique, qui relie l&#39;étude de la biologie moléculaire et organismique au sein d&#39;un cours.

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K vues.  Syracuse University. Mount ensemble In situ (WISH) a été utilisé dans un cours de premier cycle supérieure comparée des vertébrés Biologie, en plus de vertébrés dissections. Cela a donné aux étudiants la possibilité d'étudier l'expression des gènes ainsi que l'anatomie macroscopique, qui relie l'étude de la biologie moléculaire et organismique au sein d'un cours.

Vidéo: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...