Nous remercions Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello et Karl Spuhler pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Vassar College Undergraduate Summer Research Institute (URSI), Lucy Maynard Fonds recherche sur le saumon et la NASA prix # NX09AU90A, la National Science Foundation Center pour l&#39;excellence de la recherche en science et technologie (NSF-CREST) ​​# 0630388 prix et la NSF # 1058385 prix.

1. C. Préparation elegans pour l&#39;analyse vidéo <ol><li> Déplacez 10-20 nématodes adultes gravides à de nouvelles NGM agar-remplis de boîtes de Pétri à l&#39;aide d&#39;une fine sélection aplati fil de platine. Les boîtes de Pétri remplies de gélose NGM contiennent une petite tache circulaire de E. coli (souche de croissance limitée, OP50, donne les meilleurs résultats) pour les nématodes à manger. Permettre aux nématodes à pondre pendant 3-5 heures, puis retirez les adultes, établissant ainsi une petite culture de développement synchronisé de 50-150 nématodes. Permettre aux nématodes de se développer à l&#39;âge adulte par l&#39;incubation des boîtes de Pétri à 20 ° C pendant 4-5 jours. Ces méthodes de culture sont basés sur les procédures établies (Stiernagle 2006) 5. </li><li> Le jour de l&#39;analyse vidéo, rincer une assiette de nématodes adultes jeunes avec 1 ml d&#39;eau désionisée, eau distillée, recueillant ainsi les vers 50-150 de la culture synchronisée. Une solution tampon PBS comme M9 ou peuvent également être utilisés. Utilisez une microcentrifugeuse pour faire tourner le wORM à la partie inférieure du tube, ou les laisser se déposer par gravité pendant environ 15 min. Retirez la majorité de l&#39;eau dans le tube et le remplacer par 1 ml d&#39;eau désionisée, de l&#39;eau distillée pour laver les bactéries adhérentes des nématodes. </li><li> Transfert des nématodes dans de l&#39;eau ou un tampon pour une cuve en quartz à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Il est important de travailler avec un petit nombre, environ 5-10 nématodes au total à un moment ou encore moins pour qu&#39;on nématode à la fois est susceptible d&#39;être illuminé par le laser. Si le nombre de nématodes sur les plaques de culture est trop importante, la dilution des vers dans l&#39;eau ou dans un tampon jusqu&#39;à une densité souhaitée est atteinte. Il est également possible de choisir différents nématodes à une goutte d&#39;eau ou un tampon sur une plaque de gélose fraîche de les laver et de transférer vers individuelles dans la cuvette. Dans notre étude, nous avons utilisé 1 mm, 2 mm et 5 tailles de cuve mm d&#39;examiner les effets des contraintes physiques sur le comportement natatoire. </li></ol> 2. Configuration optique pour la analysi Vidéos <ol><li> Effectuez la configuration comme indiqué dans la figure 1 en utilisant un 543 nm (vert) Hélium-Néon (HeNe) laser, deux miroirs en aluminium avant de la surface, un porte-cuvette, un écran de projection, et une caméra haute vitesse (Casio High Speed ​​Exilim) capables de filmer à ~ 240 fps. Les deux miroirs sont utilisés pour diriger le faisceau laser à travers la cuvette. Différentes tailles de cuves peuvent être utilisées en fonction de la nature de l&#39;étude. A titre d&#39;exemple, nous avons utilisé des cuvettes qui sont de 5 mm d&#39;épaisseur pour montrer les effets des contraintes spatiales sur les fréquences de natation. Le faisceau laser doit satisfaire aux exigences de suréchantillonnage;. Ie, l&#39;organisme doit gêner plus d&#39;un tiers du faisceau laser. Pour C. elegans, le faisceau laser doit être d&#39;environ 2 mm de diamètre quand il coopère avec un nématode. Le faisceau laser ne doit pas être supérieure à 5 mm de diamètre depuis le diagramme de diffraction sera difficile à localiser. La distance entre l&#39;organisme de diffraction à l&#39;écran doit être beaucoup plus grande quel&#39;organisme lui-même. </li><li> Parafilm lieu au-dessus de la cuvette et de l&#39;inverser pour mélanger les nématodes dans la colonne d&#39;eau. Placer la cuve dans un support de cuvette de sorte que les vers sont initialement dans la partie supérieure de la cuve. À l&#39;aide des miroirs, diriger le faisceau laser à travers le centre de la cuvette. Parce que les nématodes sont plus denses que l&#39;eau, ils tombent lentement jusqu&#39;au fond de la cuvette, tandis que dans le même temps à l&#39;intérieur de la piscine de colonne d&#39;eau. </li><li> Sur l&#39;écran de projection, la couleur de la tache correspondant au faisceau laser émis noir pour réduire la dispersion en tant que faisceau transmis satisfait l&#39;écran de projection (figure 2). Alternativement mis une ouverture dans l&#39;écran de projection pour permettre au faisceau transmis de passer à travers l&#39;écran. Éliminer ou réduire la diffusion du faisceau transmis gardera la matrice CCD de la caméra de saturation due à faisceau transmis. </li><li> Pour capturer une mesure de la taille du motif de diffraction, tracer une ligne deenviron 5 cm sur l&#39;écran de projection à côté de la trace du faisceau laser transmis sans interférer avec l&#39;image de la lumière diffractée. </li><li> Lancez l&#39;enregistrement sur l&#39;appareil photo lorsque la lumière ambiante est de telle sorte que la ligne de 5 cm est sur la même séquence que les images de diffraction. Désactiver l&#39;éclairage de la pièce. Images de diffraction enregistrement sur l&#39;écran avec la caméra que les vers traversent le faisceau laser. </li></ol> 3. Vidéo Préparation des données <ol><li> Installer le programme d&#39;analyse vidéo (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) sur l&#39;ordinateur. Importez la vidéo dans le programme d&#39;analyse vidéo </li><li> Réglez l&#39;origine pour coïncider avec le point laser transmis. Définition de l&#39;échelle en utilisant la ligne de 5 cm sur l&#39;écran de projection. </li><li> Suivre le déplacement angulaire de l&#39;image de diffraction formée par chaque nématode utilisant le logiciel d&#39;analyse vidéo (Figure 3) </li><li> Pour trouver l&#39;angulationdéplacement r en prenant la arctan (y / x), copie et coller des données dans un tableur (Excel) et ajouter 180 ° ou π pour tous les angles négatifs pour produire un graphique continu (figure. 4). </li></ol> 4. Acquisition de données en temps réel pour l&#39;observation instantanée des fréquences Piscine <ol><li> En utilisant la même configuration que pour l&#39;analyse vidéo, placez une photodiode (DET10A de THORLABS) avec une petite zone (~ 1 mm 2) décentré dans le diagramme de diffraction juste en face de l&#39;écran de projection. </li><li> Branchez la photodiode à l&#39;oscilloscope numérique (PicoScope faite par Pico Technology) qui se connecte à l&#39;ordinateur via le port USB. Respectez les schémas raclée sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Enregistrer acquis des ensembles de données en format ASCII ou texte. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Importez les données acquises à l&#39;aide de la photodiode vidéo ou dans un programme d&#39;analyse de données capable de formes d&#39;onde raccord à l&#39;aide du chi-carré minimisation. Le programme utilisé ici est l&#39;origine ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Ajuster une courbe sinusoïdale pour déterminer la fréquence raclée (figures 4 et 5). </li><li> Fréquences moyennes de natation différents échantillons et de déterminer la variance. Pour cette étude, les données ont été analysées statistiquement en utilisant une analyse de variance à un facteur suivie par le test de Bonferroni des comparaisons multiples. Une valeur de p &lt;0,05 était considérée comme statistiquement significative. </li></ol> 6. Motifs de diffraction modèle en utilisant Mathematica comme un exemple Remarque: les modèles de diffraction peut être modélisée à l&#39;aide de nombreux outils de calcul. Cette procédure sera différente pour différents outils informatiques tels que MatLab, Excel, etc origine <ol><li> Créer l&#39;image: Prenez des photos de nématodes sur une lame de microscope à l&#39;aide d&#39;un microscope traditionnel. </li><li> Binariser l&#39;image: Importer &quot;Worm&quot; de l&#39;image ver into Mathematica en faisant glisser l&#39;image dans Mathematica. Convertissez l&#39;image en une image noir et blanc (binariser). Ceci peut être réalisé avec le «binariser &#39;ordre dans Mathematica: BlackandWhiteImage = binariser [Worm]. L&#39;image peut alors être considérée comme une image en noir et blanc. Vous pouvez également utiliser la commande &#39;EdgeDetect&#39; pour créer un BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], où les deux nombres de fuite de contrôler la grosseur des bords qui en résultent. </li><li> Convertir l&#39;image en une matrice de zéros et de uns: Ceci peut être réalisé avec le «ImageData &#39;ordre dans Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Matrice de transformée de Fourier: Utilisez la commande &quot;Fourier dans Mathematica à transformée de Fourier de la matrice en utilisant les FourierParameters indiquées: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Place module de la matrice pour obtenir la matrice de diffraction et d&#39;améliorer le contraste d&#39;image: Square de l&#39;absoluvaleur de la matrice et afficher l&#39;image résultante, qui est la figure de diffraction correspondant à l&#39;image originale. Vous pouvez également utiliser le &#39;Journal&#39; de fonction à l&#39;échelle du contraste de l&#39;image: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Redimensionner l&#39;image pour une visualisation facile: Crop le diagramme de diffraction centrale et redimensionner comme vous le souhaitez: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Comparer les spectres de diffraction modélisés avec des motifs de diffraction obtenus à partir des vers de natation librement. (Figure 6) </li></ol>

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	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons développé une nouvelle approche pour la mesure en temps réel des mouvements et des comportements locomoteurs simples dans les organismes microscopiques comme les nématodes qui ne nécessitent pas l&#39;utilisation de microscopes. 8 Cette approche méthodologique pourrait également être utilisé pour l&#39;étude de nombreux organismes microscopiques comme les protistes. Cette méthode est uniquement limitée par la longueur d&#39;onde de la lumière utilisée. L&#39;organisme ne doit pas être inférieure à la longueur d&#39;onde de la lumière. En plus de l&#39;économie de coûts et la portabilité de l&#39;équipement nécessaire, un avantage clé de cette approche est la possibilité de mesurer le comportement en temps réel et en trois dimensions, sans les contraintes étroites de plans images sous un microscope. Il est également possible avec cette technique pour examiner les influences des forces gravitationnelles ou de nombreuses autres conditions sur les comportements qui ne peuvent être étudiés en utilisant un microscope approches. 9 Ainsi, nous pouvons parvenir à une meilleure compréhension du micro-organisme naturel compor locomoteurviors libérés depuis les confins de gouttelettes lames de microscope ou spécialisés chambres microfluidiques (Park et al, 2008). 10 L&#39;absence d&#39;une information de phase dans un diagramme de diffraction ne permet pas la récupération directe de l&#39;image correspondant à l&#39;objet de diffraction depuis le diagramme de diffraction en champ lointain est proportionnelle au carré de la valeur absolue de la transformée de Fourier. Nous sommes donc le calcul des diagrammes de diffraction à partir d&#39;images ver de sorte qu&#39;ils peuvent être jumelés avec les diagrammes de diffraction des nématodes librement natation (figure 6). Cette méthode a donné des résultats vraiment pour nager librement C. elegans et peut être appliqué à toutes les espèces microscopiques que les manœuvres dans un environnement optiquement transparent comme de l&#39;eau ou de différentes solutions ioniques. Microscopes classiques ne permettent études avec une profondeur focale de l&#39;ordre du micromètre. 11 C&#39;est en raison de la faibleprofondeur de champ quand focalisation de la lumière: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> où le nombre f N est une relation réciproque avec le cercle de confusion (c) de sorte qu&#39;une longueur focale courte est associée à un grand c. 12,13 Bien que cette méthode de diffraction n&#39;est certainement pas un remplacement pour la microscopie conventionnelle, il est capable de fournir rapidement des résultats quantitatifs ainsi que les espèces peuvent même être manipulés en temps réel à faible coût. Les diagrammes de diffraction peut être obtenu avec un pointeur laser. Les diagrammes de diffraction peut être filmé avec une résolution réduite de temps en utilisant un appareil photo numérique ordinaire. Pendant que l&#39;utilisateur ne peut pas avoir un microscope ou une photodiode facilement disponibles, des éléments essentiels de cette expérience comme la mesure des fréquences de fracas et de l&#39;évaluation des diagrammes de diffraction peut être complété à très faible coût.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Laser HeNe 543 nm </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Un laser dans le visible avec moins de 5 mW peut être utilisé. </td></tr><tr><td> 2 à l&#39;avant en aluminium Miroirs de surface </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim caméra </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quartz Cuvette </td><td> Les cellules Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernier </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Wolfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Des sols et des organismes aquatiques microscopiques vivent et se comportent dans un complexe environnement tridimensionnel. La plupart des études sur le comportement organisme microscopique, en revanche, ont été réalisées en utilisant un microscope approches, qui limitent le mouvement et le comportement d&#39;un étroit champ focal de près de deux dimensions. 1, nous présentons une nouvelle approche analytique qui fournit en temps réel une analyse des nageant librement C. elegans dans une cuvette sans dépendance à l&#39;égard microscope basé sur l&#39;équipement. Cette approche consiste à suivre la périodicité temporelle des spectres de diffraction générés par diriger la lumière laser à travers la cuvette. Nous mesurons fréquences d&#39;oscillation des nématodes librement natation. L&#39;analyse des spectres de diffraction en champ lointain révèle des indices sur les formes d&#39;onde des nématodes. La diffraction est le processus de pliage lumière autour d&#39;un objet. Dans ce cas, la lumière est diffractée par les organismes. Les ondes lumineuses interfèrent et peuvent former des annoncesmodèle iffraction. Un champ lointain, ou de Fraunhofer, le motif de diffraction est formé si la distance écran-objet est beaucoup plus grande que l&#39;objet de diffraction. Dans ce cas, le diagramme de diffraction peut être calculé (modélisé) en utilisant une transformée de Fourier 2. C. elegans sont libres de vie des nématodes vivant dans le sol qui naviguent dans les trois dimensions. Ils se déplacent à la fois sur une matrice solide comme le sol ou agar-agar dans un motif sinusoïdal locomoteur appelé l&#39;exploration et à l&#39;état liquide dans un schéma différent appelé la natation. 3 Les rôles joués par les informations sensorielles fournies par mécano, chimiosensorielle, et les cellules thermosensory qui régissent les changements plastiques dans locomoteur les modèles et les interrupteurs dans les habitudes commencent à peine à être élucidé. 4 Nous décrivons une approche optique pour la mesure de la locomotion des nématodes dans les trois dimensions ne nécessitant pas un microscope et va nous permettre de commencer à explorer les complexités de la locomotion des nématodes en co différentenditions.

<html> A titre d&#39;exemple, nous avons étudié C. elegans dans une cuvette en quartz de 1 cm de large, 5 mm d&#39;épaisseur et 4 cm de hauteur de cuve. L&#39;échantillonnage d&#39;une vis sans fin unique en utilisant une analyse vidéo, la fréquence moyenne obtenue à partir de natation analyse vidéo dans une cuvette de 5 mm d&#39;épaisseur est d&#39;environ 2,5 Hz (figure 4). De même, l&#39;échantillonnage d&#39;un seul ver en utilisant la méthode d&#39;acquisition de données en temps réel, on obtient une fréquence de natation d&#39;environ 2,7 Hz (figure 5), en utilisant l&#39;oscilloscope numérique (PicoScope). Cette procédure peut être répétée pour de nombreux vers. Une étude détaillée de vers libre de natation révélé une fréquence moyenne de nage de 2,37 Hz dans une cuvette de 5 mm. 6 Comme prévu, la fréquence de la natation est plus élevée que celle d&#39;un ver qui rampe (~ 0,8 Hz). 3 À l&#39;aide de cette méthode de diffraction, la fréquences natation moyenne d&#39;un C. elegans, qui se limite à une lame de microscope, s&#39;est avérée correspondre à la valeur précédemment publié de 2 Hz. 1,7 ve_content &quot;&gt; En suivant les procédures 3.) puis 6.) permet la modélisation de la natation diagrammes de diffraction à l&#39;aide d&#39;images obtenues à vis sans fin avec un microscope conventionnel. Les diagrammes de diffraction modélisés sont utilisés pour simuler un cycle de natation de C. elegans ( Figure 6). Un modèle de réussite consiste physiquement réalisables modèles successifs de natation qui correspondent aux fréquences de natation. Le ver doit être dans le même état ​​à la fin d&#39;un cycle de natation comme il était au commencement d&#39;un cycle de natation. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Figure 1. Un laser HeNe vert a été utilisé pour créer un diagramme de diffraction dynamique à l&#39;aide en direct C. elegans. Ce diagramme de diffraction a été filmé à 240 fps. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Figure 2. Dra<html> l&#39;aile d&#39;un point noir augmente l&#39;absorption du faisceau transmis. Saturation de la caméra grâce à la lumière diffusée est réduite et le motif de diffraction est visible. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Figure 3. Capture d&#39;écran du logiciel d&#39;analyse vidéo (Logger Pro) avec un diagramme de diffraction ver qui est suivie. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> La figure 4. Données vidéo correspondant au cycle de bain d&#39;un nématode dans une cuvette de 5 mm. L&#39;ajustement de la courbe révèle une fréquence de nage de 2,5 Hz ~. &quot;/&gt; Figure 5. Données en temps réel correspondant au cycle de bain d&#39;un nématode dans une cuvette de 5 mm. L&#39;ajustement de la courbe révèle une fréquence de nage de 2,7 Hz ~. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Figure 6. La rangée du haut représente les spectres de diffraction réelles et est adaptée aux schémas de diffraction modélisés dans la rangée du bas. Les diagrammes de diffraction ont été produits modélisés en utilisant des vers sur une lame de microscope (rangée du milieu).

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Organismes microscopiques comme le nématode nage libre<em&gt; C. elegans</em&gt;, De vivre et de se comporter dans un complexe environnement tridimensionnel. Nous rapportons une nouvelle approche qui fournit une analyse des<em&gt; C. elegans</em&gt; En utilisant des diagrammes de diffraction. Cette approche consiste à suivre la périodicité temporelle des spectres de diffraction générés par diriger la lumière laser à travers une cuvette.

Étude quantitative de la Locomotion librement Piscine Micro-organismes utilisant la diffraction laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

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11.4K vues.  Vassar College. Organismes microscopiques comme le nématode nage libre C. elegans, De vivre et de se comporter dans un complexe environnement tridimensionnel. Nous rapportons une nouvelle approche qui fournit une analyse des C. elegans En utilisant des diagrammes de diffraction. Cette approche consiste à suivre la périodicité temporelle des spectres de diffraction générés par diriger la lumière laser à travers une cuvette.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Amélioration de la visualisation et l&#39;analyse quantitative des effets des drogues utilisant des cellules Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Recherche

Bio-ingénierie

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Électrotaxie microfluidique à base d&#39;analyse quantitative à la demande de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Double Emulsion génération utilisant un flux focus périphérique (PDMS) Co-axial

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo évaluation quantitative de la structure du myocarde, Fonction, perfusion et la viabilité utilisant la tomographie cardiaque Micro-calculées

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Un protocole efficace et reproductible pour Distraction ostéogénèse dans un modèle de Rat conduisant à un fémur régénéré fonctionnel

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Double imageur photoacoustique à balayage Raster pour visualisation vasculaire

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...