Les auteurs tiennent à remercier M. Richard Zink et Todd Wiernicki pour la formation méthodologique et des conseils de dosage. Nous remercions également Jean-Paul Spence pour lecture attentive et suggestions d&#39;ordre rédactionnel. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé 060 397 MH, Fondation Brain and Behavior Research, et Eli Lilly and Company à travers le Programme de bourses de recherche Lilly (LRAP).

Une. Expansion et la cryoconservation de cellules test Prêt <ol><li> Culture des cellules CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) les cellules d&#39;une cellule plat 15 cm 2 de culture dans le milieu F12 de Ham additionné de 1,0 uM de L-glutamine, 800 pg / pl G418, 300 pg / hygromycine ul, 100 u / pl pénicilline, 100 pg / pl de la streptomycine, et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes à 90-95%. Laver les cellules avec 10 pi de tampon phosphate salin (PBS), et récolter les cellules par addition de 3 ul de tampon de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Remettre les cellules en utilisant 12 pi de milieu de culture et compter les cellules en utilisant l&#39;exclusion au bleu trypan. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ul de milieu de congélation (10% de diméthyl sulfoxyde, de 90% FBS). Diluer la suspension de cellules pour obtenir la concentration cellulaire désirée (par exemple de 1 à 20 x 10 6 cellules / ul). </li><li> Aliquote de 1,0 ul de solution de cellules de chaque tube cryogénique. Incuber les tubes cryogéniques dans un récipient de congélation de cellules à -80 ° C pendant une nuit. Transférer les tubes cryogéniques à un N 2 liquide réservoir pour le stockage à long terme. </li></ol> 2. Placage cellules Prêt dosage (et Option n º transfection) <ol><li> Décongeler rapidement un tube cryogénique congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °. Une fois que les cellules sont décongelées, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ul contenant 9 ul d&#39;Opti-MEM, et mélanger en inversant le tube 3 à 5 fois. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ul d&#39;Opti-MEM. </li><li> Compter les cellules en utilisant l&#39;exclusion au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire et de diluer les cellules viables comme nécessaire (par ex. 3 x 10 5 cellules / ul de concentration) dansOpti-MEM. Planche 10 pl / puits de cellules dans une culture de tissu traitée plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Faire des dilutions en série de l&#39;AMPc dans Opti-MEM pour générer une courbe standard pour estimer la production d&#39;AMPc par les cellules (selon recommandations du fabricant - voir la section 7). Ajouter 10 ul / puits de standards d&#39;AMPc à la plaque. Remarque: une courbe standard unique peut être préparé sur une plaque séparée ou puits vides sur l&#39;une des plaques de dosage. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 1 heure. </li></ol> 3. Inverser siRNA Option de transfection * Cette section est facultative et pertinente à la figure 3. <ol><li> Préparer une solution de siRNA dans RNase ddH 2 O (par exemple 0,4 pmol / ul). Ajouter 5 ul à des puits individuels de plaque de 384 puits, et centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante. </li><li> Diluer Lipofectamine 2000 à Opti-MEM par un facteur de 0,006 (par exemple, ajouter 6 pi de Lipofectamine 2000 à 1000 pi d&#39;Opti-MEM), et mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Incuber la solution Lipofectamine 2000/Opti-MEM pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 5 ul de la solution diluée Lipofectamine 2000/Opti-MEM à des puits individuels de plaques à 384 puits contenant déjà des siRNA. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante. </li><li> Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante. </li><li> cellules prêtes d&#39;essai de plaque comme décrit ci-dessus (Section 2). Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante. </li><li> Retour plaque d&#39;essai à incubateur humidifié à 37 ° C (5% de CO 2) pour 48-96 h déterminée pour le gène ciblé abattre (voir la discussion). </li></ol> 4. Petit criblage de molécules <ol><li> Diluer le médicament d&#39;intérêt (inhibiteurs par exemple. Petites molécules) dans OptiMEM-6x les concentrations finales désirées. Des dilutions en série peuvent être effectuées à l&#39;aide de pipettes à main ou une station de traitement des liquides. </li><li> Ajouter 2,5 pl / puits de composé d&#39;essai ou du tampon contenant un véhicule (par exemple DMSO) à côté des puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante (incubation est facultative). </li></ol> 5. Traitement agoniste persistante <ol><li> Préparer un 600 nM (c.. 6 fois la concentration finale souhaitée de 100 nM) solution de quinpirole dans Opti-MEM. </li><li> Ajouter 2,5 pl / puits de la solution de quinpirole 600 nM sur le côté du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 2 heures. </li></ol> 6. La stimulation de l&#39;accumulation d&#39;AMPc <ol><li> Au cours de l&#39;incubation de 2 h, préparer les stimulatisur la solution dans Opti-MEM. La solution de stimulation se compose de 40 uM de forskoline, 2 uM de 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), et 4 uM spiperone (toutes les concentrations de l&#39;étape 6 sont 4x la concentration finale souhaitée). </li><li> Ajouter 5 ul / puits de la solution de stimulation sur le côté du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li></ol> 7. Trempe et estimation de l&#39;accumulation d&#39;AMPc <ol><li> La production d&#39;AMPc par les cellules est mesurée en utilisant la trousse cAMP dynamique 2 selon les instructions du fabricant. Brièvement, reconstituer anti-AMPc-cryptate et AMPc-d2 dans de l&#39;eau distillée. Congeler aliquotes à -20 ° C pour le stockage à court terme. </li><li> Diluer une partie aliquote d&#39;anticorps anti-AMPc-cryptate et une partie aliquote de l&#39;AMPc-D2 séparément dans le tampon de lyse, selon les instructions du fabricant pour rendre les solutions de travail. </li><li> Ajj 10 pl / puits de la solution de travail anti-AMPc-cryptate et 10 pl / puits de la solution de travail cAMP-d2 à la plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Lire la plaque dans un lecteur de plaque à fluorescence (réglage de l&#39;échelle automatique de la sensibilité) en utilisant une excitation de 337 nm, et de mesurer les émissions à 620 nm et 665 nm par instructions du fabricant. </li><li> Appliquer l&#39;analyse de quotient pour évaluer l&#39;AMPc courbe standard par les instructions du fabricant. En utilisant les valeurs obtenues, extrapoler l&#39;accumulation d&#39;AMPc estimé dans les puits de test en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans un effort pour faciliter les études de sensibilisation hétérologue, nous avons largement modifié notre méthode précédente réalisation d&#39;un rationalisé &quot;mélange et de lire&quot; format qui est modifiable à criblage à haut débit et le mécanisme de l&#39;examen de l&#39;action. Les principales modifications apportées à notre protocole peuvent être résumées comme suit: 1) l&#39;utilisation de cellules congelées comme réactifs &quot;de dosage prêt&quot;; 2) la miniaturisation de l&#39;anal...

Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l&#39;activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance 1. En plus de l&#39;activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l&#39;activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés 2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont associés à la douleur, les troubles neuropsychiatriques et neurologiques, et comprennent μ / κ des opioïdes, D 2/4 de la dopamine, 5HT 1A, et M 2/4 2 récepteurs muscariniques. En plus des découvertes du Dr Nirenberg, un grand nombre de preuves existe reliant sensibilisation de signalisation AC à l&#39;activation du récepteur opioïde chronique à la fois <em&gt; in vitro et in vivo 3-7. Sensibilisation des AC a également été associée à une variété de maladies impliquant les récepteurs dopaminergiques D 2 et telles que la schizophrénie y compris la maladie de Parkinson (pour une revue voir référence 2). Malgré l&#39;importance potentielle de la sensibilisation, le mécanisme (s) précis associé avec / activation persistante Gai o-récepteur couplé qui conduit à une réactivité accrue AC reste en grande partie inconnue. Ces études fournissent la justification de l&#39;examen des mécanismes de sensibilisation de l&#39;adénylyl cyclase comme une cible neurobiologique importante. De même, la pertinence physiologique de signalisation AC 8 et l&#39;importance que les isoformes de CA individuels détiennent dans cette réponse adaptative devraient aussi être reconnus 2,9,10. Dans le cadre de notre recherche, les caractéristiques générales associées à la sensibilisation hétérologue des isoformes recombinantes de AC parallèle les caractéristiques described pour étudier les isoformes endogènes de l&#39;AC. Plus précisément, des recherches antérieures ont montré que l&#39;activation de Gai / o protéines et les sous-unités de la suite de presse / réarrangement sont des conditions importantes pour récepteur induite par la sensibilisation de toutes les isoformes AC. En outre, plusieurs études suggèrent que la signalisation de protéines kinases et des sous-unités Gßy sont impliqués dans la sensibilisation 2,11-13. CA individuels présentent également des motifs uniques et distincts de sensibilisation 12. Par exemple, l&#39;exposition persistante des récepteurs D 2 agonistes est associée à une sensibilisation de AC1 et AC8 de Ca2 + stimulation / calmoduline 14,15, tandis que l&#39;AC3 étroitement liée n&#39;est pas sensibilisé 2. AC2, AC4, et AC7 sont étroitement liés, cependant, que l&#39;activité de la PKC-AC2 stimulée est robuste sensibilisés après une exposition prolongée de D 2 récepteurs agonistes 7,14,16,17. En outre, AC5 et AC6 montrent un degré marqué de hetersensibilisation ologous à gaz et stimulée par la forskoline accumulation d&#39;AMPc suite à l&#39;activation de récepteurs D 2 14,18-20, mais semblent différer dans leur exigence de la sous-unité Gßy AC interactions 21. Bien que la plupart des études de sensibilisation AC ont utilisé des lignées de cellules modèles (par exemple des cellules HEK293 exprimant les isoformes individuelles AC), il apparaît que ces résultats traduisent par des modèles de cellules neuronales natives 4,22. Plus récemment, les effets des inhibiteurs sélectifs des isoformes de petites molécules identifiées AC dans les cellules HEK293 exprimant isoformes AC peuvent également être convertis en études comportementales in vivo 23. L&#39;absence d&#39;un mécanisme moléculaire identifié pour la sensibilisation hétérologue reflète probablement la complexité de la réponse adaptative aussi bien que les propriétés uniques de la régulation individuelle des isoformes AC 12. Démêler une telle complexité est encore compliquée par l&#39;utilisation de la méthodologie lourde tchapeau a limité chercheurs universitaires d&#39;employer des approches impartiales. Par exemple, nos études mécanistiques précédentes impliquaient l&#39;utilisation de modèles cellulaires cultivées en continu en utilisant 24 - et 48-bien le format de culture tissulaire 15. Les cellules cultivées ont été généralement cultivées pendant 48 h et ensuite soumis à un traitement médicamenteux agoniste (2-18 h), suivie par une série de lavages et d&#39;incubations de cellules (figure 1). Protocoles d&#39;accumulation d&#39;AMPc spécifique AC-isoformes ont ensuite été utilisée suivie par la mesure de l&#39;accumulation d&#39;AMPc en utilisant une laborieuse et longue [3 H] AMPc méthodologie 15,24 liaison. La durée de bout en bout pour chaque dosage généralement nécessaire d&#39;un total de quatre à cinq jours à partir de la cellule de placage à l&#39;analyse de données (figure 1). L&#39;application de nouvelles technologies et l&#39;automatisation a conduit à des améliorations marquées pour les études de sensibilisation dans le milieu industriel et centre de HTS. Par exemple, un groupe de travail avec le Centre national pour Chemical génomique a rapporté deux jours une HTS procédure de dosage pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de récepteur opioïde μ sensibilisation induite en format 1536 puits 25. Le présent article décrit nos efforts pour développer un test HTS pour les études de sensibilisation hétérologue utilisant des technologies qui sont disponibles à la plupart des institutions de recherche universitaires. Cette stratégie a été accompli en incorporant l&#39;utilisation de cellules congelées à partir des modèles de cellules exprimant de manière hétérologue au récepteur de la dopamine D 2, en combinaison avec les isoformes de l&#39;adénylyl cyclase ou de recombinaison endogènes individuels (CHO-D 2L ou HEK-AC6 / D 2 L). Pour améliorer notre rendement, nous avons repensé notre test de sensibilisation de 48 puits (environ&gt; 20 étapes sur 4-5 jours) pour un cinq-étape, le dosage de jour en format 384 puits qui était essentiellement &quot;mélanger et lire&quot;. Le nouveau format utilise un temps homogène fluorescence disponible dans le commerce résolu (HTRF) d&#39;essai pour mesurer l&#39;AMPc accumulation dans des cellules intactes avec un lecteur multi-plaque de mode. Le dosage est robuste et se prêtent à criblage de petites molécules, et peut être efficacement appliqué pour cribler des inhibiteurs de la sensibilisation hétérologue. En outre, nous fournissons des données qui permet l&#39;utilisation de ce test avec la transfection inverse de siRNA pour une large criblage d&#39;une banque de siRNA ciblés ou de génomes avec seulement une modification mineure à l&#39;approche générale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

Sensibilisation de l&#39;adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l&#39;activité AC, alors que l&#39;activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l&#39;AC et l&#39;augmentation des niveaux d&#39;AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l&#39;activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D 2 et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l&#39;AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l&#39;AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l&#39;AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l&#39;AC, le développement et la validation d&#39;un dosage de l&#39;AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d&#39;une méthodologie complexe pour mesurer l&#39;accumulation d&#39;AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d&#39;un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L&#39;utilisation de deux modèles cellulaires D 2 de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D 2L et HEK-AC6 / D 2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (&gt; 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l&#39;essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d&#39;une banque de siRNA ciblés.

Partie I. Le développement d&#39;un test de sensibilisation bien hétérologue 384 pour identifier des inhibiteurs de petites molécules en utilisant un modèle de cellule disponible dans le commerce. Pour étudier la sensibilisation hétérologue dans un modèle cellulaire, nous avons fait un certain nombre d&#39;améliorations qui nous ont permis de rationaliser le test dans un format «mélanger et lire&quot;. Plusieurs modifications principales sont exposées ci-dessous...

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Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l&#39;adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d&#39;un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K vues.  Purdue University.  Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA. ...

Vidéo: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Recherche

Bio-ingénierie

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband détecteur optique des ultrasons pour les applications d&#39;imagerie médicale

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabrication de mécanique accordable et bioactifs Métal échafaudages pour des applications biomédicales

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

Capsules à base de plantes Extraction de microencapsulation pour Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Applications pour les panneaux d'éclairage Microplate-Compatible open Source

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.