Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation, le Fonds de dotation McKnight for Neuroscience, le Christopher et Dana Reeve Foundation et Amerisure Charitable Foundation.

<ol>
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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il ya plusieurs bonnes discussions sur la microchirurgie au laser avec des systèmes de laser différentes 3,5-11. Femtoseconde lasers IR sont le «gold standard» pour l&#39;ablation laser subcellulaire 12 et commode si associé à une installation d&#39;imagerie, mais ils sont souvent trop coûteux pour les utilisateurs individuels. Si vous avez besoin d&#39;un laser femtoseconde pour l&#39;imagerie infrarouge de votre échantillon en raison de la profondeur de l&#39;imagerie, alors vous aurez probablement besoin d&#39;une pour le laser axotomie. Tissus transparent avec les axones cible au sein de 30 à 50 um de la surface sont probablement faisable avec les lasers à impulsions bleu et vert dans les 20 UJ / impulsion fourchette cible à travers une lentille d&#39;immersion na élevé. Il n&#39;y aura plus de dommages collatéraux avec le nano et pico seconde lasers rapport avec le laser femtoseconde, d&#39;autant que la profondeur de l&#39;axone augmente cible. C. elegans est transparent et tous les axones sont à 20-30 um de la surface. Nous faisons régulièrement coupé axones moteurs qui sont dans les 5 um de la surface. Nous avons aussi facilement couper hacheons dans l&#39;anneau nerveux qui sont environ 20 um de la surface de la cuticule. Nous avons trouvé la limite pour la coupe des axones à environ 30-50 um par le diamètre d&#39;un ver adulte. Il est probable que le système d&#39;ablation laser décrit ici serait bien travailler avec de nombreuses préparations différentes qui répondent aux critères de transparence et de la profondeur des axones cible. Pourtant, il est un peu surprenant, étant donné les avantages théoriques des lasers femtoseconde IR, que 355 nano et picoseconde nm et 532 nm lasers exécuter si bien pour le laser axotomie en C. elegans 6,13. Nous ne voyons aucune différence dans la régénération des axones en réponse au laser nanoseconde avec axotomie 440 nm, 532 nm nanoseconde, et des lasers femtosecondes infrarouge. Solid state lasers UV 355 nm sont environ le même coût que la diode 532 nm pompé passivement Q-Switched laser à état solide, mais nécessitent des puissances supérieures ou optique qui passent efficacement ces longueurs d&#39;onde plus courtes. La plupart des optiques sont conçus pour bien performer avec 400 visibles -700 nm de lumière. 355 nm lasers offrirait certains avantages tels que six seuil de réduction du plasma, la taille plus petite place, et une longue passe dichroïque serait efficace à 100% directes de l&#39;ablation par laser à la cible et permettre l&#39;imagerie simultanée de la GFP sans perte de signal de l&#39;échantillon. Les lasers bleus nm 440 conserverait les avantages de travailler avec un laser de lumière visible (de bonnes performances avec des optiques standard et de sécurité). Malheureusement, le coût d&#39;un DPP Q-switched laser à état solide 440 nm est de 3 fois le coût d&#39;un laser 355nm ou 532 nm de puissance similaire à ce moment. Si nous devions concevoir un nouveau système pour C. elegans, où la profondeur des cibles est minime, nous opterions pour une lentille transparente aux UV (coût environ $ 3.000 pour une lentille d&#39;huile 1.3na 40x avec 50-70% de transmittance à 355nm) et un laser 355 nm produisant 50 à 10 UJ / impulsion à 1 -20 kHz. L&#39;ablation Axon est pensé pour être dû à la formation du plasma. Impulsions plus courtes produira seuils plasma à faible puissance et les volumes de plasma w<html> malades seront plus petits 6. L&#39;objectif est de produire le plasma et petit plus éphémère en ajustant l&#39;énergie d&#39;impulsion à la plus faible puissance. Agrandir les plasmas de longue durée va générer des bulles de cavitation que les dommages entourant les cellules. Nous avons généralement constaté que l&#39;ablation en utilisant environ 50-100 impulsions à la fréquence la plus élevée (c.-à 2.5kHz) donne les meilleurs résultats. Cela suggère que les dommages peuvent être progressivement intégrée sur une série d&#39;impulsions afin de mieux contrôler l&#39;étendue des dégâts. Le système d&#39;ablation laser décrite ici est très indulgent si le faisceau est aligné et élargi avec précision. Nous commençons la coupe des axones vers adultes à la puissance du laser à 10% (moyenne de 0,3 mW mesuré à 2500 Hz et environ 1 UJ / impulsion) et peut couper avec des dommages localisés limitée par la puissance de 14%. Vous pouvez observer plus grandes zones de dégâts de 15 à 39% la puissance du laser, mais seulement au-dessus 40% de puissance (environ 1 mW en moyenne mesurée à 2500 Hz) ne les vers exploser à cause de grandes bulles de cavitation et de dommages à la cuticule du ver. e_content &quot;&gt; Le Steinmeyer et al. 2010 2 papier est une excellente ressource pour construire un système d&#39;ablation laser. Leon Avery a aussi une belle description pratique d&#39;un système d&#39;ablation laser basé sur un laser à gaz N2 nm coûteux 337 et il fournit certaines pratiques très conseils (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Lorsque vous concevez votre propre système, vous devriez d&#39;abord parler avec votre représentant microscope afin de déterminer comment cibler le laser d&#39;ablation à l&#39;objectif du microscope. Votre microscope doit être monté sur une table anti-vibrations (Newport, TMI, Thor). Un haut breadboard est optimal, mais un top en acier massif peut toujours être utilisé avec positionneurs magnétiques. Un module dédié intermédiaires sur une portée verticale est agréable car tous les éléments optiques peut être laissé en place. Cependant, il peut être moins coûteux et plus commode d&#39;utiliser un port de la caméra (inversé) ou un «combinateur» attaché à un port epi-fluorescence. Vous avez besoin de connaître la taille de l&#39;ouverture arrière et la transmission (à l&#39;une<html> blation longueur d&#39;onde laser) de l&#39;objectif que vous comptez utiliser. Une fois que vous décidez sur un laser (par exemple, Crylas, TEEM, Cristal, ou CRC), vous devez contacter Thor ou de Newport pour aider à sélectionner les bons éléments d&#39;optique, matériel informatique et de sécurité. Nous avons décidé d&#39;un élargisseur de faisceau Galiléen double pour économiser l&#39;espace, mais une simple extension de Kepler est une option (F2/F1 = facteur d&#39;expansion). Un expanseur de faisceau personnalisé sera le moins cher, mais à Newport, Thor, et plusieurs des fabricants de lasers offrent une excellente qualité commerciale du faisceau extenseurs. Certains fabricants de lasers offrent également atténuateurs manuelle et à commande électronique qui peut être rentable et peu encombrant, mais pas aussi polyvalent que le polariseur de Glan-Thompson et la plaque demi-onde. Vous aurez également besoin de décider la façon de contrôler le laser. Vous pouvez concevoir un contrôleur de LabView, utilisez un générateur commerciaux TTL, ou les logiciels fournis par l&#39;entreprise au laser. Discutez des options avec le fabricant de laser spécifique. tente »&gt; Nous avons fourni une liste du matériel que nous avons utilisé seulement comme un guide général. Le système décrit ici a coûté environ $ 15 000 lorsqu&#39;elle est ajoutée à notre système d&#39;imagerie existants. Votre département Physique locales auront souvent quelqu&#39;un qui est prêt à fournir une introduction pratique à en toute sécurité travaillant avec des lasers faisceau libre. Méthodes alternatives pour l&#39;immobilisation et laps de temps d&#39;imagerie de C. elegans ont été récemment décrites. 14 Dépannage L&#39;étape la plus difficile et critique l&#39;alignement du faisceau centré étendu à l&#39;axe optique du microscope. Une fois que vous avez le faisceau centré et étendu à travers les lentilles de Galilée, vous devez travailler dur pour obtenir ce aligné à moins de 5 um de l&#39;axe optique du microscope avant d&#39;utiliser les miroirs de pilotage de l&#39;alignement final pour le centre. L&#39;utilisation excessive des miroirs de direction pour aligner le faisceau du microscope va l&#39;amener hors axe passant par le faisceauexpandeur. utilisant PRUDENCE EXTRÊME vous pouvez atténuer le faisceau laser avec le filtre ND approprié et visualiser directement le profil du faisceau laser sur une cible réfléchissante (miroir surface frontale). Vous pouvez doucement pousser le microscope avec précision le centre du faisceau dans le champ de l&#39;objectif 60X de vue (si elle ne peut pas être centré dans le haut / bas gamme dont vous avez besoin d&#39;ajuster la hauteur du rail). Le profil du faisceau peut être utilisé pour aligner avec précision l&#39;axe microscope optique pour donner un faisceau centré qu&#39;il est circulaire et «fusées» de façon symétrique. Une éruption asymétrique est une indication que l&#39;axe microscope n&#39;est pas parfaitement aligné (ou le rail n&#39;est pas de niveau). Enfin, vous devriez ajuster L3 et voir une expansion régulière et symétrique et la contraction de la poutre. Focus du microscope, précisément sur la surface cible et ensuite ajuster L3 à focaliser le faisceau laser pour la plus petite tache. Vous devriez maintenant constater que le faisceau laser est à 5 um du centre où imagé via LSCM ou CCD système et l&#39;endroit d&#39;ablation est dans1um de concentration Z. Si vous trouvez que vous &quot;sauter&quot; vers ou constamment générer de grandes bulles de cavitation à couper axones votre problème est plus probable l&#39;alignement amende de l&#39;ablation laser. Assurez-vous que le minimum (&lt;500nm) tache d&#39;ablation est localisée à la mise au point Z (ajuster la convergence avec lentille L3) et à l&#39;endroit XY fiduciaires (ajuster avec miroir cinématiquement montés dernière). Cibler les axones près de la surface, il faudra moins de puissance de laser. De même, les petits animaux (L1 et L2), il faudra moins de puissance laser pour axotomie rapport à cibler les axones même chez les adultes. Si votre axones de type sauvage ne se régénèrent pas ou l&#39;eau de Javel axones vous devriez essayer de réduire la puissance d&#39;imagerie laser ou en diminuant le taux d&#39;échantillonnage. Si vos vers meurent ou deviennent maladives essayez de réduire le Agarose pour cent dans les étapes 1%. Assurez-vous que vous ne bougez pas la lamelle, après les vers de montage comme ce sera souvent provoquent leur mort lors de l&#39;utilisation élevée parpourcentage d&#39;agarose et des microsphères. Si vos vers éclater ou meurent lors d&#39;une session time-lapse, il est dû à: 1. Pourcentage d&#39;agarose est trop élevé. 2. Dommages aux cuticules par ablation laser. 3. Mouvement de la lamelle après le montage. Si des dommages à la cuticule est en faute qu&#39;elle affectera seulement les vers montés qui ont été ciblés avec le laser d&#39;ablation. Si votre ver se déplace trop pendant une session time-lapse essayez d&#39;augmenter le pourcentage d&#39;agarose dans les étapes de 0,5%. Axones sains dans les vers sains sont toujours «actif» et d&#39;afficher un niveau homogène de la fluorescence. Si vous voyez une diminution soudaine de la fluorescence ou de l&#39;activité du ver est mourant ou mort. Plusieurs axones perlées ou fragmentées sont un signe certain d&#39;un ver mourant ou mort. Si vous avez du mal à garder votre axones se concentrer lors de la session laps de temps ensemble il peut y avoir plusieurs problèmes différents. Premièrement, vérifiez votre dérive scène par l&#39;imagerie d&#39;un échantillon inerte sur une lame de verre de plus de 10 hrs. Une dérive quelques microns peuvent être dus à l&#39;instabilité thermique, mais supérieure à 5 um est probablement dû à des problèmes mécaniques avec votre microscope. Problèmes avec le montage sont plus communs. Laissez vos vers montés s&#39;équilibrer avec votre platine de microscope pendant 30 minutes avant de commencer votre laps de temps. Vérifiez que votre sceau vaseline n&#39;ont pas développé de fuites au cours de votre session laps de temps.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 535 nm laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, et CRC offrent également des lasers comparables) </td></tr><tr><td> Toutes les optiques et le matériel </td><td></td><td></td><td> (Thor offre optiques comparables et matériel) </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 de diamètre </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique d&#39;ordre zéro Plate Wavel, Retardation vague ½, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Stade de rotation, une &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Polarisant calcite, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Polarisant mont </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;entretoise pour une« post diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;de hauteur, une« après Diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork, 1 message &quot;de diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Décharge de faisceau </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscope Objectif Monture </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Laser Nd: YAG miroir, 25,4 mm de diamètre, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 pouces de diamètre, trou de passage de montage </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Haute précision de réglage à vis Bouton, voyages 12.7mm, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adaptateur fileté, ¼ -20 masculins, 8-32 femelles </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Clamp pour 1,5 cm de diamètre tige </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Transporteur ferroviaire pour le X26, carré longueur 40mm </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) de longueur </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plate-forme de tige pour tige 1,5 cm de diamètre </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-lentille concave, diamètre 12,7 mm, 25mm-EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 0,5 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 1,0 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microsphères 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> Questions EEO </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomie suivie par microscopie time-lapse est un test sensible des phénotypes régénération des axones dans C. elegans 1. La principale difficulté de ce dosage est le coût perçu ($ 25-100K) et de l&#39;expertise technique nécessaire pour mettre en œuvre un système d&#39;ablation laser 2,3. Toutefois, les lasers à impulsions à l&#39;état solide des coûts modestes (&lt;$ 10K) peut fournir une performance robuste pour l&#39;ablation au laser dans des préparations transparentes où les axones cibles sont «proches» de la surface du tissu. Construction et de l&#39;alignement d&#39;un système qui peut être accompli en une journée. Le chemin optique fournie par la lumière du condenseur concentré à l&#39;ablation laser fournit un guide d&#39;alignement commode. Un module intermédiaire avec toutes les optiques retiré peut être dédié à l&#39;ablation laser et assure qu&#39;aucun des éléments optiques doivent être déplacés lors d&#39;une séance d&#39;ablation laser. Un dichroïque dans le module intermédiaire permet l&#39;imagerie simultanée et l&#39;ablation laser. Centrer le faisceau laser to le faisceau sortant de la lentille de condenseur de microscope concentré guides de l&#39;alignement initial du système. Une variété de lentilles sont utilisés pour conditionner et d&#39;élargir le faisceau laser pour remplir l&#39;ouverture arrière de la lentille de l&#39;objectif choisi. L&#39;alignement final et les essais sont effectués avec une cible de surface miroir glisser façade en verre. Puissance du laser est ajustée pour donner une place de taille minimale d&#39;ablation (&lt;1um). Le spot d&#39;ablation est centré par des ajustements précis du miroir dernière cinématiquement montée en réticule fixe dans la fenêtre d&#39;imagerie. Laser de puissance pour axotomie sera d&#39;environ 10 fois plus élevée que celle nécessaire pour la tache d&#39;ablation minimale sur la diapositive cible (cela peut varier avec la cible que vous utilisez). Les vers peuvent être immobilisés pour le laser axotomie et imagerie time-lapse en montant sur ​​des patins d&#39;agarose (ou en microfluidique chambres 4). Coussinets Agarose sont facilement faites avec 10% d&#39;agarose dans une solution saline équilibrée fondu dans un four micro-ondes. Une goutte d&#39;agarose fondu est placé sur une lame de verre et aplatie avec un autrelame de verre dans un pavé d&#39;environ 200 um d&#39;épaisseur (une seule couche de ruban de temps sur des lames adjacentes est utilisé comme une entretoise). Un &quot;Sharpie&quot; bouchon est utilisé pour découper un bloc de diamètre uniforme circulaire de 13mm. Anesthésique (1UL Muscimol 20mm) et des microsphères (Chris Fang-yen communication personnelle) (1UL 2,65% polystyrène 0,1 um dans l&#39;eau) sont ajoutés au centre du pavé suivie par 3-5 vers orienté de sorte qu&#39;ils sont couchés sur leurs côtés gauche. Une lamelle de verre est appliquée et ensuite la vaseline est utilisé pour sceller la lamelle et d&#39;empêcher l&#39;évaporation de l&#39;échantillon.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Sur la régénération axonale. Une haute qualité, mais peu coûteux, le système d&#39;ablation laser peut facilement être ajouté à la plupart des microscopes. Laps de temps d&#39;imagerie plus de 15 heures nécessite une immobilisation attention du ver.

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.3K vues.  University of Utah. Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations dans C. elegans Sur la régénération axonale. Une haute qualité, mais peu coûteux, le système d'ablation laser peut facilement être ajouté à la plupart des microscopes. Laps de temps d'imagerie plus de 15 heures nécessite une immobilisation attention du ver.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Un système expérimental pour étudier mécanotransduction dans les cellules des poumons du foetus

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Étude quantitative de la Locomotion librement Piscine Micro-organismes utilisant la diffraction laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Double imageur photoacoustique à balayage Raster pour visualisation vasculaire

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...