Nous tenons à remercier Amanda Rychel pour l&#39;assistance à l&#39;élaboration du protocole laps de temps et Lynn Pillitteri pour construire POLAR POLAR ::-eGFP. Nous sommes également reconnaissants à ABRC pour fournir le h-rb construire. Ce protocole a été élaboré grâce à un soutien de l&#39;attribution du Japon PRESTO Science Technologie et de l&#39;Agence. La recherche sur POLAR a également été soutenu par l&#39;Université de Washington Banque Research Fund (RRF-4098) et la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP est un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), et KUT est un enquêteur HHMI-GBMF.

1. La stérilisation des semences <ol><li> Préparer la solution de stérilisation des semences: eau de javel 33%, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Placer les semences portant souhaité construction rapporteur fluorescent (s) et le génotype (s) dans 1,7 ml tube et appliquer 1 ml de solution de stérilisation. Incuber sur nutator pendant 15 min. </li><li> Dans une hotte stérile, utiliser une pipette pour éliminer la solution de stérilisation du tube, laissant derrière graines. Rincer avec 1 ml d&#39;eau stérile. Répétez quatre fois. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant deux jours ou plus. </li></ol> 2. Préparation des diapositives Chambre médias <ol><li> Mélanger 20 ml de solution 0,5% de Bacto Agar (pur agarose) dans l&#39;eau dans une fiole jaugée de 200 ml, et à micro-ondes jusqu&#39;à dissolution complète. Soyez prudent lorsque vous la solution à ébullition. </li><li> Refroidir la solution à environ 60 ° C. </li><li> Prélever 1 ml de solution d&#39;agar avec une pipette et appliquer lentement le couvercle en verre à l&#39;intérieur de la chambre de coulissement (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Système lamelle couvre-objet en allemand). Solution which est trop chaud ou appliquée trop rapidement peut faire fondre la colle ou du verre fissure. </li><li> Immédiatement ajouter un deuxième ml solution d&#39;agar. Gélose doit maintenant couvrir complètement le fond de la chambre de coulissement. Ce support minimal est suffisante pour soutenir le développement dans un cotylédon usine, qui contient des nutriments stockés, pendant quatre à cinq jours par le maintien de l&#39;humidité et permettant la diffusion de gaz. </li><li> Laisser refroidir sur une diapositive de table avec chambre à couvert. Si flacon est recouverte hermétiquement, la solution peut être sauvé et réchauffés pour une utilisation future. </li></ol> 3. Dissection semences <ol><li> Retirer le tube de semences stériles de 4 ° C de stockage. </li><li> Placez un mouchoir en papier sur la scène d&#39;un microscope à dissection et l&#39;humidifier avec de l&#39;eau. Réglez le tissu pour créer une surface lisse. Le tissu est utilisé pour stabiliser les graines pour la dissection. </li><li> Pipeter 20-30 graines du tube sur le tissu, en prenant soin de les placer dans le champ de la portée dissection de vue. </li><li> En utilisant des pinces pointues (Roboz, n ° 5 pointe biologie), Retirez soigneusement le tégument de l&#39;intérieur des semis. Téguments à la fois extérieur et intérieur doivent être enlevés. </li><li> Quand l&#39;imagerie du cotylédon, il est avantageux de retirer l&#39;hypocotyle et la radicule. Cotylédons contiennent des substances nutritives suffisantes pour développer pendant plusieurs jours en vertu du présent protocole. Si intacte, l&#39;hypocotyle se redresser et allonger considérablement, passant du stade cotylédon hors du champ de vision laps de temps. Utiliser un scalpel pour découper les cotylédons libres de l&#39;hypocotyle. </li><li> Tenir cotylédons disséqués immergés dans l&#39;eau, dans un microtube ou similaire. </li><li> Répéter 3.4 à 3.6 jusqu&#39;à ce que le nombre souhaité de cotylédons est atteinte. 15-20 dissections succès sont recommandées avant le montage. </li></ol> 4. Cotylédons de montage dans la chambre de coulissement <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un couvre-petit (18 mm 2), couper à travers les médias d&#39;agar et soulever toute la couche de base en verre jusqu&#39;à la chambre de coulissement du. </li><li> Pipeter disséqué cotylédons avec un minimum d&#39;eau à partir de maintenanttube dans la chambre de coulissement, sous la couche de gélose levée. </li><li> Abaissez doucement la gélose sur les cotylédons. Si l&#39;excès d&#39;eau est présente, la tremper loin avec un tissu, en prenant soin de ne pas déranger les cotylédons. Les échantillons doivent plus se déplacer facilement quand montage est terminé. </li><li> Placer le couvercle sur la diapositive chambre et faites glisser pour déplacer la platine du microscope. </li></ol> 5. Time Lapse d&#39;imagerie <ol><li> Mise en place inversée microscope confocal à l&#39;image du fluorophore désiré (s). LSM700 paramètres utilisés: pour la GFP, l&#39;excitation à 488 nm et la collecte avec un filtre passe-bande à 440-530 nm; d&#39;appel d&#39;offres, l&#39;excitation à 555 nm et la collecte avec un filtre passe-bande à 570-610 nm. </li><li> Inspectez spécimens naturalisés pour les dommages. Programmer les emplacements des intact, bien monté cotylédons dans le logiciel de microscope. Dans le Zen 2009: Focus sur un cotylédon avec objectif 20x et objectif déplacer au centre de la chambre de coulissement. Sous Mode d&#39;acquisition, changer Zoom à 0,5 et hauteur d&#39;axe &lt;/ Em&gt; à 48x48 pixels. Cochez la case Positions et l&#39;image de synthèse Scan ... bouton sous positions, puis augmenter le nombre de carreaux horizontaux et verticaux à 30-35. Lorsque la numérisation est terminée, cliquez sur le bouton positions sous l&#39;onglet Dimensions et réticule lieu à chaque cotylédon à observer. </li><li> Mettre en place la série z englobant l&#39;épiderme cotylédon de tous Zen samples.In 2009: Cochez la case Z-Stack. Sélectionnez chaque position dans la liste Position, puis cliquez sur le bouton Déplacer vers. Concentrez-vous sur le plan supérieur de l&#39;épiderme des cotylédons et cliquez sur le bouton Set abord sous Z-Stack. Focus sur la position la plus basse à laquelle épiderme est utilement visible et cliquez sur le bouton Set dernier. Cliquez sur le bouton situé à côté optimale, ce qui montre le meilleur z-épaisseur de coupe, à définir. Vérifiez chaque cotylédon à confirmer que ces paramètres englobent tous les échantillons, les paramètres z ne peut pas être réglé pour indivpositions idual en 2009 Zen. </li><li> Mettre en place des séries chronologiques à la résolution souhaitée et la longueur. Intervalles de 15-30 minutes pendant trois jours sont efficaces pour la dynamique des protéines dans la division cellulaire épidermique. Cet intervalle peut être modifié selon les besoins. Dans le Zen 2009: Cliquez sur la case de séries chronologiques. En vertu de séries chronologiques, Cycles mis pour le nombre d&#39;images de votre choix à l&#39;aide du curseur ou en tapant dans le champ de texte. Définition de la fréquence à 30 et utilisez le menu déroulant pour sélectionner min. </li><li> Commencez xyzt multi-position de balayage. Notez que le nombre de postes doit être limitée par les spécifications de numérisation, si le temps de cycle total est supérieur à l&#39;intervalle souhaité, les points dans le temps ne sera pas correcte. Un maximum de six positions simultanées sont possibles lorsque l&#39;imagerie GFP et RFP à 59 z tranches dans un intervalle de 30 min à l&#39;aide de notre système. Dans le Zen 2009: Taille de l&#39;image Changement de la résolution souhaitée, puis cliquez sur Démarrer expérience. </li></ol> 6. Montage vidéo <ol><li> A partir du fichier confocal données, effectuez une intensité maximale z-projection de chaque combinaison temps / position et l&#39;exportation sous forme de fichiers image dans un format sans perte comme TIFF. Les noms de fichiers doivent être dans une série par poste (par exemple, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, ne POLAR-GFP_0001_pos1) pour les logiciels pour les combiner en un film. Dans le Zen 2009: Copie Utilisation: sous-ensemble sous l&#39;onglet Traitement de diviser positions dans des fichiers séparés, puis projection d&#39;intensité maximale. Enfin, l&#39;exportation au format TIFF (fichier Export, pleine fenêtre resolution image - série). </li><li> Utilisez FIDJI 7,8 pour aligner les images successives en exécutant la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Inscription: bUnwarpJ). Changer le mode d&#39;enregistrement en Mono. Toutes les options avancés peuvent utiliser des valeurs par défaut. Pour les longues séquences laps de temps, téléchargez et installez la macro &quot;Affine + Conformément Inscription élastique image 2D», qui s&#39;appliquera bUnwarpJ à une série d&#39;images automatiquement et ouvert ynos données à l&#39;aide du fichier: Import: Séquence d&#39;images de l&#39;utiliser. Décochez MOPS sites d&#39;extraction et de course. </li><li> Utilisez FIDJI / ImageJ ou Quicktime Pro pour ouvrir la séquence d&#39;images alignées et enregistrer au format vidéo de votre choix (AVI est un bon choix). </li></ol>

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O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette technique time-lapse confocale permet des études longitudinales sur l&#39;expression des protéines marquées par fluorescence et la localisation dans des cellules individuelles de l&#39;épiderme cotylédon Arabidopsis, qui dans le cas de la polaire et d&#39;autres protéines changent dynamiquement est essentielle à une bonne compréhension de leur fonction. Auparavant, soutenue laps de temps d&#39;imagerie a été utilisée pour examiner l&#39;infection fongique racine d&#39;Arabidopsis ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Une chambre de tiroir </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Ou deux chambre (155 379) </td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 logiciels </td></tr><tr><td> 20x objectif </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plan-Apochromat </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Benz (National) </td><td> 431TBL </td><td> S&#39;allume ci-dessous </td></tr><tr><td> N ° 5 forceps, la biologie de pointe </td><td> Roboz instruments chirurgicaux </td><td> RS-4978 </td><td> Pointes très finessont essentiels </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Imagerie in vivo de la dynamique du comportement cellulaire dans une séquence de développement peut être un outil puissant pour comprendre les mécanismes de structuration des tissus. Au cours du développement animal, la prolifération cellulaire et les événements clés de structuration se produire très rapidement. Par exemple, dans Caenorhabditis elegans toutes les divisions cellulaires nécessaires au plan de corps de la larve sont terminés dans les six heures après la fécondation, avec sept cycles mitotiques 1; les mitoses seize ou plus de l&#39;embryogenèse chez la drosophile se produire en moins de 24 heures 2. En revanche, les divisions cellulaires au cours du développement des plantes est lente, typiquement de l&#39;ordre d&#39;une journée 3,4,5. Cela impose un défi unique et un besoin à long terme imagerie en temps réel pour documenter les comportements dynamiques de la division cellulaire et la différenciation des événements pendant l&#39;organogenèse végétale. Épiderme Arabidopsis est un excellent modèle pour la signalisation de l&#39;enquête, le devenir cellulaire et le développement des plantes. Dans le cotylédon, ce tissu est constitué de cellules d&#39;air et résistant à l&#39;eau des chaussées entrecoupés de stomates uniformément répartie, soupapes qui s&#39;ouvrent et se ferment pour contrôler les échanges gazeux et la perte d&#39;eau. Un espacement correct de ces stomates est essentielle à leur fonction et leur développement suit une séquence de division asymétrique et les étapes de différenciation des cellules pour produire de l&#39;épiderme organisé (Fig. 1). Ce protocole permet l&#39;observation des cellules et des protéines de l&#39;épiderme pendant plusieurs jours de développement. Ce laps de temps permet une documentation précise des cellules souches divisions et la différenciation des cellules épidermiques, y compris les stomates et des cellules épidermiques de la chaussée. Protéines fluorescentes peuvent être fusionnés à des protéines d&#39;intérêt pour évaluer leur dynamique au cours de la division cellulaire et les processus de différenciation. Cette technique nous permet de comprendre la localisation d&#39;une protéine nouvelle, POLAR 6, pendant la phase de prolifération des cellules de la lignée des stomates en eépiderme cotylédon e Arabidopsis, où il est exprimé dans les cellules précédant les événements de la division asymétrique et se déplace vers une zone caractéristique du cortex cellulaire se produit peu de temps avant la division. Les images peuvent être enregistrées et vidéo simplifié facilement produit en utilisant un logiciel du domaine public de visualiser la localisation des protéines dynamique et types cellulaires comme ils changent au fil du temps.

<html> Un ensemble de points dans le temps informatifs recueillies par cette méthode est illustré à la figure 3. Les membranes cellulaires sont étiquetés avec DP (h-rb) et la GFP est fusionnée à la protéine POLAR sous son promoteur natif (POLAR POLAR ::-GFP) 6 A l&#39;échelle de temps de 30 minutes, nous voyons des divisions cellulaires, ainsi que les changements dans la localisation des protéines qui les ont précédés. Divisions cellulaires asymétriques sous la forme lig...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Nous décrivons un protocole utilisant des lames de chambre et des médias pour immobiliser cotylédons des plantes pour l&#39;imagerie confocale de l&#39;épiderme pendant plusieurs jours de développement, la documentation différenciation des stomates. Protéines fluorophore-marqués peuvent être suivis de manière dynamique par l&#39;expression et la localisation subcellulaire, accroître la compréhension de leurs rôles possibles lors de la division cellulaire et la différenciation de type.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K vues.  University of Washington. Nous décrivons un protocole utilisant des lames de chambre et des médias pour immobiliser cotylédons des plantes pour l'imagerie confocale de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement, la documentation différenciation des stomates. Protéines fluorophore-marqués peuvent être suivis de manière dynamique par l'expression et la localisation subcellulaire, accroître la compréhension de leurs rôles possibles lors de la division cellulaire et l...

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l&#39;aide Time-lapse de microscopie confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Utilisation de scanners à plat pour collecter haute résolution temps-caduque Images de la réponse gravitropique Arabidopsis racine

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, une méthode pour monter la larve de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...