Nous remercions Mark Terasaki pour des conseils initiaux sur l&#39;aide d&#39;un microscope à deux photons pour créer des lésions tissulaires locales, Kathy Joubin des conseils sur le montage d&#39;imagerie time-lapse, et les laboratoires Sagasti et Portera-Cailliau pour les discussions. Les premières expériences ont été effectuées par l&#39;AS en tant que boursier de la Fondation à l&#39;herbe Labs de biologie marine de Woods Hole, MA. Le travail dans le laboratoire Sagasti a été soutenue par des subventions de la Fondation de Whitehall, la Fondation Klingenstein, et un prix du Burroughs Wellcome Fund carrière dans les sciences biologiques.

Partie 1: Montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie <ol><li> Préparer 1% d&#39;agarose Low Melt solution pour incorporer. Dissoudre dans de l&#39;eau DI agarose par chauffage dans un four micro-ondes, partie aliquote dans des tubes de petits et de stocker dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius. </li><li> Sélectionnez embryons à des fins d&#39;imagerie et d&#39;enlever leurs chorions en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince. Les embryons peuvent être placés dans une solution à 5% Ringer PTU à 22-24 heures après fécondation (HPF) pour inhiber la formation de pigment. Cela améliore la clarté de l&#39;imagerie et est essentielle pour la réalisation à deux photons axotomies des axones sensoriels. Si le pigment naturel est autorisé à se former, l&#39;autofluorescence obscurcit axones sur le microscope à deux photons. Solution de Ringer pour le poisson zèbre contient 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM CaCl 2, et 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,2. </li><li> Anesthetize embryons en ajoutant ~ 0,02% tricaïne à l&#39;Ringer PTU. Faire des animaux que ne sont pas sensibles au toucher avant de procéder. </li><li> Préparer la chambre de l&#39;imagerie à long terme en appliquant de la graisse à vide d&#39;un côté d&#39;un anneau de verre ou de téflon et se fixer sur une lamelle de verre. </li><li> Transfert d&#39;un embryon dans la solution 42 degrés agarose avec une pipette en verre, en prenant soin de ne pas transférer une grande partie du PTU Ringer, puis transférer l&#39;embryon avec une goutte d&#39;agarose sur une lamelle de préparation. </li><li> Position de l&#39;embryon en tant désiré que l&#39;agarose durcit. Gardez à l&#39;esprit que la chambre de l&#39;imagerie sera retourné lorsque vous avez terminé de telle sorte que la lamelle sera la surface supérieure. </li><li> Si vous avez une platine motorisée et peut emplacement des images multiples à la fois, répétez les étapes 1.4 à 1.6 pour chaque embryon. </li><li> Laisser l&#39;agarose pour complètement se solidifier, puis remplissez le ring avec 0,02% de Ringer tricaïne PTU. </li><li> Appliquer de la graisse à vide de l&#39;autre côté de l&#39;anneau (s), puis couvrir l&#39;anneau (s) avec une lame de verre. Retournez la chambre étanche (s) plus. Ces chambres peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie des microscopes droits ou inversés. </li></ol> Partie 2: Deux photons axotomie utilisant une coutume construite à deux photons microscope avec un caméléon Ti-saphir au laser <ol><li> Préparer pour l&#39;imagerie. Placez l&#39;embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec un objectif de l&#39;eau (0,8 NA) 40X. Allumez le laser. Nous avons été en mesure de visualiser et reproductible dommages neurones exprimant la GFP en utilisant les paramètres suivants. Pour visualiser les axones à une puissance non-préjudiciable, mis au laser pour une longueur d&#39;onde de 910 nanomètres (nm) et une puissance de 30 milliwatts (mW énumérées sont la quantité d&#39;énergie à l&#39;échantillon). Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie. Nous utilisons un logiciel développé dans le laboratoire scanimage Karel Svoboda 2, 3. </li><li> Appuyez sur Focus pour numériser l&#39;embryon avec le laser à deux photons, localiser l&#39;axone vous souhaitez axotomize, et de capturer une image de ce axone. Marquer la première et dernière positions Z, d&#39;acquérir l&#39;image, et faire une projection maximale de la pile Z. </li><li> Zoom 70X sur la branche de l&#39;axone vous souhaitez axotomize et arrêter le balayage. Augmenter la mW à l&#39;échantillon à la puissance de 180 MW d&#39;endommager, et d&#39;effectuer un seul balayage avec le laser. Nous faisons cela en définissant le nombre de tranches de Z à 1 et en appuyant sur &quot;Grab&quot;. Cela devrait être suffisant pour rompre l&#39;axone. Voir la discussion des méthodes pour optimiser cette procédure pour votre microscope et le but expérimental. </li><li> Zoom arrière, réduire la puissance à 30 mW et prendre une image. </li></ol> Partie 3: deux photons axotomie sur 510 microscope confocal Zeiss / à deux photons <ol><li> Placez montés sur la scène d&#39;embryon et de le mettre en mise au point avec un objectif 25X d&#39;eau ou d&#39;autres objectifs appropriés. </li><li> Allumez les deux photons (910 nm) et d&#39;argon (488 nm) lasers dans un cadre multi-piste afin qu&#39;il soit possible de basculer de l&#39;un à l&#39;autre. Bien que les deux lasers sont utilisés pour détecter la GFP, l&#39;émission de deux photons est visualisé en rouge, et l&#39;émission laser à l&#39;argon avec du vert pour différencier les deux. </li><li> Utilisez le laser Argon pour identifier un axone de blesser. Sous Z paramètres marquer la première et la dernière optique. Prenez une image confocale et de créer une projection maximale de la pile Z. </li><li> Choisissez la région de l&#39;axone d&#39;être blessés et apporter cette région dans le foyer. Eteignez le laser Argon et tournez sur le laser à deux photons. Balayage de l&#39;échantillon avec les deux photons à une intensité laser de transmission ~ 9% de s&#39;assurer que l&#39;axone est encore en discussion. </li><li> Cliquez sur le bouton «stop» afin que l&#39;outil de recadrage sera disponible. Utiliser des cultures de zoomer sur la zone d&#39;intérêt. Habituellement on fait un zoom 70X à ~ (zoom peut être vérifiée dans le &quot;mode&quot; onglet). Sous l&#39;onglet &quot;Channels&quot; changer l&#39;intensité des deux photons de la transmission ~ 9% à la transmission de 15-20%. </li><li> Pour rompre un axone activer le «XY rapide&quot; enfoncée pendant environ 1 seconde et puis appuyez sur le bouton d&#39;arrêt pour éviter d&#39;endommager l&#39;excès. L&#39;axone doit être considéré comme des débris dispersés si la procédure a fonctionné. </li><li> Afin de s&#39;assurer que l&#39;axonea été endommagé revenir au laser Argon à 488 nm, prendre une autre image confocale, et de créer une projection maximale. </li></ol> Partie 4: confocale imagerie time-lapse sur Zeiss LSM 510 <ol><li> Préparer pour l&#39;imagerie. Si vous utilisez une platine chauffante, assurez-vous de l&#39;activer au moins 30 minutes avant la mise en place de votre time-lapse movie. Placez l&#39;embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec l&#39;objectif d&#39;air désirée. Nous utilisons un 20X, 0,5 objective NA. Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie Zeiss LSM 510. Allumez les lasers appropriés et mettre en place la configuration souhaitée. Nous allons maintenant décrire un protocole détaillé pour l&#39;imagerie à long terme avec Zeiss LSM logiciel Time Multi. Ces méthodes peuvent être adaptées pour une utilisation sur votre microscope avec votre propre logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Définir la position et la configuration de votre premier embryon dans la fenêtre de temps Multi. Ouvrez le scanner, le stade, et les fenêtres de temps multiples. Activer balayage rapide sur la fenêtre de numérisation. Déplacer la scène à la position XY désiré. Marquer la première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Si vous êtes seulement un embryon d&#39;imagerie, cliquez sur le &quot;Lieu Unique&quot; onglet dans la fenêtre de temps Multi. Cliquez sur &quot;Remplacer XYZ&quot; puis sur &quot;Enregistrer configuration&quot;. Convenir lorsqu&#39;on lui a demandé d&#39;écraser la configuration précédente. Passez à l&#39;étape 4.4. Si vous avez une scène mécanisée, vous pouvez configurer de multiples endroits à des embryons de plusieurs images. Dans ce cas, vous devez sélectionner le «Multiple Locations onglet&quot; avant de définir les XYZ et de configuration de votre premier emplacement. Aussi, assurez-vous que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations&quot; onglet situé sur un emplacement 1, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit LOC 1, avant de cliquer sur enregistrer la configuration. </li><li> Définir la position et la configuration de votre embryons restants dans la fenêtre de temps Multi. Localisez votre embryon suivante, puis appuyez balayage rapide, de déplacer la scène dans la position souhaitée XY, et marquer votre première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Cliquez sur &quot;Remplacer XYZ». Vérifiez que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations&quot; onglet situé sur un emplacement 2, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit Loc 2, puis cliquez sur &quot;Sauvegarder la configuration&quot;. Convenir lorsqu&#39;on lui a demandé d&#39;écraser la configuration précédente. Répétez ce processus pour les embryons restants. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;acquisition d&#39;images dans la fenêtre multi Loc. Choisissez l&#39;option GR-GL dans la «Liste des Blocs&quot; section, puis entrez le nombre désiré de répétitions du groupe. C&#39;est le nombre de fois que le confocale va acquérir une image à chaque endroit. Entrez le délai d&#39;attente désirée dans la section Paramètres. C&#39;est la quantité de temps depuis le début d&#39;une répétition d&#39;imagerie pour le début de la prochaine répétition. Sélectionnez &quot;ZStackXY&quot; dans la section de configuration. Entrez votre nom de fichier de base dans la section du bas. Cliquez sur &quot;DB Image Sélectionner&quot; et choisissez votre mdb. Cliquez sur le bouton &quot;Options&quot;. Sélectionnez votre dossier mdb d&#39;enregistrer des fichiers temp. Cochez la case &quot;garder l&#39;image finale ouverte&quot;, &quot;enregistrer l&#39;image finale», et «milieu de la pile z&quot;. Sélectionnez attendre intervalle. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre des options. Cliquez sur &quot;Start Time&quot;. Laisser la fenêtre ouverte pour l&#39;heure multi durée de l&#39;imagerie. </li><li> Analysez vos données. Lorsque l&#39;imagerie time-lapse est terminée, le logiciel Time multi compilera tous vos fichiers temporaires dans un dossier récapitulatif pour chaque emplacement. Si vous voulez arrêter le film avant qu&#39;il ne soit terminé, veillez à appuyer sur «Terminer» au lieu de &quot;Stop&quot;, de sorte qu&#39;un fichier de synthèse sera créé. Les fichiers temporaires et fichiers résumé doit être automatiquement enregistré dans le dossier désigné mdb. Dans le menu du logiciel LSM, cliquez sur &quot;View 3D&quot;, puis &quot;projection&quot;. Avec votre dossier de synthèse sélectionnée dans le menu déroulant, cliquez sur &quot;Appliquer&quot;. Cela va générer des projections maximum de la pile Z pour chaque image confocale. Sur le menu du logiciel LSM, cliquez sur &quot;Fichier&quot;, puis &quot;Exporter&quot;. Enregistrer les projections maximales comme une série de fichiers TIF. Vous pouvez alors créer un film de la série de fichiers tif en utilisant ImageJ ou QuickTime Pro. Les axones dans les images LSM peut être tracé en trois dimensions en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image (par exemple à partir NeuroLucida MicroBrightfield) pour générer des informations quantitatives détaillées sur la morphologie des axones. </li></ol> Partie 5: Les résultats représentatifs Une expérience réussie se traduira par une représentation exacte de la dynamique cellulaires de récupération axone d&#39;une blessure. Votre embryons seront en bonne santé après l&#39;imagerie, sans la dégénérescence visible et un battement de coeur solide. Le axotomie devrait entraîner des dommages précis, ne coupant la branche définie de l&#39;axone. Il devrait y avoir aucune blessure aux axones environnante et la mort cellulaire minime. Nous croyons que nous voyons la mort d&#39;une seule cellule épidermique directement sur le site de axotomie dans ~ 50% des expériences. Si vous observez plus de dégâts, vous devriez optimiser vos deux photons du protocole tel que décrit dans la discussion.

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Nous avons utilisé les méthodes décrites avec précision axotomize périphériques axones sensoriels et d&#39;observer directement la régénération chez l&#39;embryon de poisson zèbre vivant. À long terme time-lapse imagerie confocale chez le poisson zèbre peut être utilisé pour observer les nombreux processus développementaux in vivo. La procédure axotomie deux photons décrit peut être modifié pour de nombreuses différentes objectifs expérimentaux. Nous avons utilisé la même procédure gén?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Le poisson zèbre ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement en imagerie time-lapse de l&#39;embryon vivant transparente. Nous décrivons ici une méthode pour monter embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie et de démontrer comment automatiser la capture de time-lapse images à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Nous décrivons également une méthode pour créer contrôlée, des dommages précis pour chaque branche d&#39;axones sensoriels périphériques chez le poisson zèbre en utilisant la puissance centrée sur un laser femtoseconde monté sur un microscope à deux photons. Les paramètres pour la réussite à deux photons axotomie doit être optimisé pour chaque microscope. Nous allons démontrer à deux photons axotomie la fois sur une mesure construite à deux photons microscope et d&#39;un Zeiss 510 / confocale à deux photons pour fournir deux exemples. Zebrafish trijumeau neurones sensoriels peuvent être visualisées dans une ligne de transgéniques exprimant la GFP conduit par un promoteur neurone sensoriel spécifique 1. Nous avons adapté ce modèle de poisson zèbre trijumeau d&#39;observer directement la régénération des axones sensoriels dans la vie des embryons de poisson zèbre. Les embryons sont anesthésiés avec tricaïne et positionnée dans une goutte d&#39;agarose comme il se solidifie. Immobilisé embryons sont scellés dans une chambre remplie d&#39;imagerie phénylthiourée (PTU) de Ringer. Nous avons constaté que les embryons peuvent être continuellement imagée dans ces chambres pour les 12-48 heures. Une seule image confocale est alors capturé afin de déterminer l&#39;endroit désiré de axotomie. La région d&#39;intérêt est située sur le microscope à deux photons par imagerie par les axones sensoriels sous faible, non dommageable pouvoir. Après un zoom avant sur le site désiré de axotomie, la puissance est augmentée et un seul balayage de cette région définie est suffisante pour rompre l&#39;axone. Plusieurs emplacement imagerie time-lapse est alors mis en place sur un microscope confocal d&#39;observer directement la récupération d&#39;une blessure axonale.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie, l&#39;imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vues.  University of California, Los Angeles. Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Vidéo: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l&#39;aide Time-lapse de microscopie confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...