Ce travail a été financé par une subvention de la National Science Foundation (numéro d&#39;attribution IOS-1031416) et a été menée en collaboration avec Nathan Miller, Logan Johnson et Edgar Spalding de l&#39;Université du Wisconsin et Brian Bockelman, Carl Lundstedt et David Swanson de la Université de Hollande Centre de Calcul du Nebraska.

Une. Image Acquisition Protocole Considérations: Ce protocole est le plus efficacement réalisée avec deux personnes, mais il est possible pour chacun de travailler seul. Le dispositif fonctionne le mieux dans ce laboratoire était pour une personne pour préparer des plaques pour la numérisation tout autre travaille sur la configuration du scanner, puis les deux travaillent ensemble pour placer les plaques dans les scanners et commencer le processus de numérisation. Il est également important de noter que les scanners de ce projet sont orientées verticalement avec les couvercles de scanner reposant sur le dos du scanner. Un support personnalisé a été fait pour tenir plats dans cette position verticale et a été apposée sur la surface à plat avec des bandes de commande 3M (figure 2). Le couvercle de document amovible qui vient avec le scanner utilisé dans ce protocole (un Epson V700) était bordée d&#39;un côté de feutre noir. Le couvercle de document a été placé contre la vitre d&#39;exposition avec un cordon élastique àmaintenir les plaques en place et de fournir un contraste d&#39;image (Figure 3). N&#39;importe quel scanner de résolution suffisante pourrait être utilisé pour la capture d&#39;image. L&#39;Epson Perfection V700 a été choisi en raison de son profil carré (le rendant facile à positionner verticalement), sa haute résolution et les options supplémentaires pour numériser à partir de la fois le lit et le couvercle et d&#39;utiliser le canal infrarouge. Ces options supplémentaires n&#39;ont pas été utilisés dans ce protocole. Une fois que les plaques ont été retirées de la chambre de croissance, il est impératif que le protocole de continuer jusqu&#39;à la fin. Préparation de la plaque Des boîtes de Pétri standard contenant 10 ml de milieu transparent et 9 graines plantées à travers le milieu de chaque plaque ont été utilisées. Procédures pour l&#39;étiquetage de la plaque, la préparation des milieux et la plantation peut être trouvé à: <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; Récupérer la première plaque de gélose et absorber la condensation collectées sur le couvercle et rebord du couvercle de la plaque de gélose avec un Kimwipe. </li><li> Appliquer Triton X-100 (un détergent) à couvercle avec un Kimwipe - être généreux. (Notez que le Triton X-100 permet d&#39;éviter l&#39;accumulation de condensation sur le couvercle de la plaque est balayée. Une application généreuse (assez pour créer un film sur la surface du couvercle) aidera à s&#39;assurer que le couvercle reste transparente tout au long du cycle de scanner .) </li><li> Envelopper la plaque avec la bande de micropores pour fixer le couvercle, et pour permettre la ventilation. </li></ol> Configuration du scanner et de l&#39;image Collection Ce protocole suppose que plus de 1 scanner est utilisé, et fournit des instructions pour démarrer plusieurs scanners à partir d&#39;un seul ordinateur. <ol start="4"><li> Créer des dossiers pour stocker des images de chaque scanner. Chaque scanner tiendra deux plaques, donc gardez cela à l&#39;esprit lors de la création de dossiers. Unpourraient choisir d&#39;utiliser les métadonnées comme des composantes du nom de fichier tels que des identifiants uniques pour chaque plaque, l&#39;âge de semis, la taille des graines, et les ID des stocks plantés. Un exemple d&#39;un nom de dossier utilisé dans la collecte de données contenant les métadonnées est &quot;1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161&quot;. </li><li> Fixer des minuteries de sortie pour le temps de perception désigné (9 h a été utilisé dans ce laboratoire). Assurez-vous de mettre de temps (une heure ou deux) pour la préparation. (Notez que les scanners doivent être branchés dans les minuteries de sortie afin de régler le temps d&#39;acquisition. Bien que le logiciel VueScan permet à un utilisateur de recueillir des images à plusieurs reprises, il ne permet pas à l&#39;utilisateur d&#39;indiquer le nombre d&#39;images à recueillir ou combien de temps pour recueillir des images pour .) </li><li> Tourner sur le premier scanner et attendre environ 10 secondes pour le scanner de passer par ses initiales échauffement. </li><li> Ouvrez le programme VueScan fois. Version VueScan 9.0.20 a été utilisé dans ce protocole (voir le tableau des matériaux), bien que les versions plus récentes peuvent être utilisés avec peu de modification. Assurez-vous que le bouton «Plus» a été appuyé sur le panneau inférieur de l&#39;interface utilisateur afin d&#39;afficher les options de menu décrites ci-dessous. </li><li> Définissez la répétition automatique: zone de liste déroulante à aucun sous l&#39;onglet d&#39;entrée et sous l&#39;onglet culture indiquée zone de prévisualisation: Maximum (Figure 4). Appuyez sur &quot;Aperçu&quot;. </li><li> Créer une zone de culture qui engloberait la région d&#39;intérêt en utilisant la souris pour cliquer et faire glisser à travers la région d&#39;intérêt sur l&#39;image d&#39;aperçu. Les paramètres peuvent être modifiés pour la région d&#39;intérêt dans l&#39;onglet des cultures. Les réglages typiques utilisés pour la boîte de culture étaient: décalage x 0,675; décalage y 1.924 en, si cela a été ajustée pour capturer la zone de semis pour chaque scanner. La taille de la boîte de culture utilisé était 7.246 en large par 1,1 en haut (figure 5). </li><li> Pour déplacer la zone de recadrage, maintenez la touche Maj enfoncée tout en faisant glisser avec la souris. Assurez-vous que la boîte de culture contient tous les plants à analyser ainsi que toutes les métadonnées souhaitée pouvant figurer sur une étiquette (Figure 5). </li><li> Sous l&#39;onglet de la culture, de définir la zone Aperçu: à la boîte de cultures et de la presse de l&#39;Aperçu. </li><li> Allez à l&#39;onglet Sortie et sélectionnez le fichier correct pour le scanner (figure 5). </li><li> Répétez les étapes 1.7 à 1.12 sur tous les scanners pour un ordinateur. Choisissez l&#39;option «oui» lorsqu&#39;on lui a demandé s&#39;il convient d&#39;ouvrir plus d&#39;une instance de VueScan. </li><li> Aller à travers chaque onglet et vérifiez que les paramètres sont corrects. (Notez que toutes les spécifications peuvent être modifiés pour répondre aux besoins d&#39;un laboratoire individuel y compris la couleur de l&#39;image, résolution, etc. Cependant, les paramètres utilisés dans ce protocole peuvent être appliqués directement à la particular balayage matériel d&#39;un laboratoire donné en raison de l&#39;interface commune du logiciel VueScan. Reportez-vous à la liste des spécifications ci-joint pour voir les paramètres utilisés dans ce projet, avec la version 9.0.20 VueScan). </li><li> Sous l&#39;onglet Entrée choisir continu dans la répétition automatique: champ, ou choisir un intervalle plus long entre les images si désiré. L&#39;intervalle de temps est la longueur de temps le scanner s&#39;arrête après l&#39;enregistrement de la dernière image et la perception de l&#39;image suivante début. En mode continu, 3-4 min résolution peut être obtenue à 4800 dpi. </li><li> Répéter les étapes 01.14 à 01.15 pour le reste des scanners reliés à un ordinateur unique. </li><li> Placer les boîtes préparées dans les scanners correctes avec des semis orientées horizontalement (ne pas gravistimulate). </li><li> En placer un noir, feutre fond contre les plaques afin qu&#39;ils ne tombent pas de plexiglas modèle. Répétez l&#39;opération pour tous balayagepartenaires. (Remarque: Dans ce projet, des morceaux de feutre noir ont été jointes au document couvre fourni avec l&#39;équipement pour éviter l&#39;éblouissement et à offrir un contraste contre le tissu racinaire La couleur de fond spécifique utilisé dépendra de la couleur du tissu imagé.). </li><li> Vous avez une personne tourner les plaques à 90 ° (plaques ont été tournés dans le sens antihoraire dans ce protocole) et immédiatement remplacer le fond de feutre. </li><li> L&#39;autre personne doit être debout à l&#39;ordinateur afin qu&#39;ils puissent appuyer immédiatement sur ​​le bouton «Scan». </li><li> Fixez le fond du scanner avec un cordon élastique (figure 3). Vous avez une personne de tenir le fond en place tandis que l&#39;autre positionne le cordon élastique. (Remarque: Immédiatement après gravistimulation (rotation des plateaux de 90 °) et le placement de l&#39;arrière-plan de feutre, «Scan» doit être enfoncé). </li><li> Répétez les étapes 1.17 à 1.21 pour le reste des scanners sur un seul ordier. </li><li> Répétez les étapes 01.06 à 01.22 pour la prochaine série de scanners cas échéant. </li><li> Ne laissez pas les scanners que plusieurs images ont été recueillies pour s&#39;assurer qu&#39;ils économisent correctement. </li><li> Il est idéal pour garder les scanners dans une zone qui sera exempt de perturbations pour le temps de cycle désigné. Il est également prudent de prendre en compte les conditions environnementales dans la zone de balayage pour assurer des réponses phénotypiques idéales. </li><li> Lorsque la collecte des données est terminée, appuyez sur le bouton vert d&#39;abandon sur chaque fenêtre VueScan qui coïncide avec chaque scanner. </li><li> Fermer tous les programmes sur l&#39;ordinateur. </li><li> Redémarrez l&#39;ordinateur et fermez tous les scanners avant de commencer un autre cycle de collecte d&#39;image. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Observation phénotypique précise est cruciale pour comprendre les manifestations de la fonction des gènes dans un organisme. Une façon d&#39;acquérir de l&#39;information phénotypique est grâce à la capture de données d&#39;image à haute résolution. La plate-forme scanner développé a permis la collecte de nombreuses images (200 images / période de balayage) à haute résolution (4800 dpi) sur un certain nombre d&#39;heures. En outre, cette plate-forme est facilement adapté à une variété d&#39;environnements de laboratoire et de la classe en raison de la flexibilité du logiciel VueScan à exécuter des milliers de différents scanners utilisant une interface commune 18. La méthode présentée ici comble un vide en haut débit de capture d&#39;image qui s&#39;étend de grandes installations de phénotypage à grande échelle et des systèmes automatisés réalisables dans un seul laboratoire. Les plates-formes à haut débit actuellement disponibles ont tendance à utiliser le matériel d&#39;imagerie spécialisée, y compris les caméras montés sur des supports robotisés, de capturer des images à haute résolution de primarily-dessus des tissus végétaux au sol (par exemple Centre de technologie végétale intégrative et la ScanAlyzer HTS par LemnaTec) 20,21. Systèmes d&#39;imagerie spécialisés à l&#39;aide de rayons X et IRM technologies ont également été développés à l&#39;image ci-dessous tissus au sol avec une résolution remarquable à mesure qu&#39;ils grandissent dans l&#39;environnement du sol (par exemple Centre de technologie végétale intégrative) 11,22,23. Ce développement de la technologie plus spécialisée est généralement au coût de débit, ce qui rend les études phénotypiques dynamiques plus difficile. Surtout, les besoins en matière de coûts et d&#39;infrastructures pour ces plates-formes haut de gamme en font la plupart du temps impossible la mise en œuvre dans les petits laboratoires. Plates-formes ont également été développés qui utilisent la technologie de capture d&#39;image plus standard et sont bien adaptés à la mesure des réponses dynamiques tels que la réponse de la racine à un stimulus de gravité. Par exemple, les caméras CCD ont été utilisés pour capturer les réponses individuelles des semis à la lumière et de la gravité à hauterésolution spatiale et temporelle 1,8,12. D&#39;autres systèmes ont été développés permettant la mesure de la pointe de la racine orientation des racines multiples à partir d&#39;une seule image (par exemple RootTipMulti par la iPlant Collaboratif) 17,24. Dans le premier cas, le débit est relativement faible, étant donné que seulement une plantule est imagé par chaque caméra à la fois, alors que dans ce dernier cas, le débit est plus élevé, mais généralement au détriment de la résolution. La procédure décrite dans ce document présente une plate-forme pour capturer des images haute résolution en haut débit avec des équipements et des logiciels qui sont facilement disponibles et relativement abordable. En utilisant cette configuration, 1080 réponses individuelles profondes peuvent être collectées chaque semaine dans un seul laboratoire équipé d&#39;une banque de six scanners. En 15 mois de collecte une moyenne de 864 réponses individuelles par semaine, un total de 41 625 plants ont été numérisés pour une étude de la génomique. Environ 15% des collections individuelles a échoué en raison d&#39;une erreur de configuration, les réseaéchec rk ou dysfonctionnement de l&#39;équipement. Un autre réponses 22% ont échoué en raison de l&#39;absence de germination ou la croissance des racines insuffisante pour provoquer une réponse de croissance. L&#39;ensemble de données final est constitué de 27 475 réponses individuelles de semis à un stimulus de gravité de 163 lignées recombinantes ainsi que 99 lignes isogéniques. Les données ont été recueillies dans un seul laboratoire, ce qui en fait une approche très haut débit. Même étant donné que le matériel utilisé pour l&#39;acquisition est relativement peu coûteux, il a fonctionné de manière fiable depuis plus de deux ans, même avec un usage intensif. Bien que ce protocole a été très utile pour les objectifs de recherche de ce groupe, certaines limitations existent toujours. Parce que du débit d&#39;environ 50 Go de données d&#39;image non compressées par jour, il était évident qu&#39;une grande quantité d&#39;espace est nécessaire pour des images de la maison, sauf si les systèmes de compression efficaces pourraient être développés. Le problème de stockage a été temporairement résolu par l&#39;achat de disques durs externes pour chaque ordinateur. En outre, les deux 1Dispositifs de stockage de réseaux associés 0 de la tuberculose ont été achetés. Plus tard, les algorithmes de compression ont été développés, comme décrit ci-dessus, ce qui peut aider à réduire la taille des données d&#39;un maximum de 60% ​​(figure 8). Il est important de noter que la vitesse à laquelle les données peuvent être enregistrées dans un dispositif de stockage associé au réseau est dépendante de la vitesse de la connexion de réseau. systèmes de compression ont également été limitée en raison de la volonté d&#39;empêcher la perte de données d&#39;image. Autres limitations spécifiques à un système d&#39;imagerie par balayage électronique sont également envisagées. Par exemple, dans une approche fondée scanner plants sont exposés à la lumière de haute intensité dans les plages blanches et potentiellement infrarouges pendant chaque balayage. Cela affecte probablement la croissance des semis, mais les semis peuvent encore être observées à subir des réponses solides à un stimulus de gravité (figure 7). Une amélioration future pourrait impliquer que seuls ces scanners LED infrarouges sont actifs programmation. Une zone en développemen actift est la création d&#39;algorithmes d&#39;analyse adaptée à la résolution et le débit de ces données d&#39;image. Le grand ensemble de données généré à l&#39;aide de cette méthode basée scanner a été idéal pour le développement d&#39;outils robustes pour phénotypage à haut débit d&#39;images de semis. L&#39;algorithme de compression utilisé sur ces images montrées à la figure 7 prend en charge l&#39;affirmation selon laquelle ils se prêtent à des applications d&#39;analyse d&#39;images. En outre, les images générées peuvent être analysées par l&#39;algorithme précédemment publiées, RootTrace 17,24, s&#39;ils sont recueillis à une résolution plus faible (moins de 1 200 points par pouce), et les semis individuels sont segmentés à partir de l&#39;image en utilisant l&#39;algorithme de compression décrit ci-dessus avant l&#39;analyse. données sur la croissance des racines pourraient être extraites des images réduites à 1200 dpi tandis que les données d&#39;angle de pointe pourraient être extraites des images réduites à 900 dpi (observation non publiée). La procédure décrite dans le présent document s&#39;inscrit dans sa propre niche dans le monde de root imagerie en ce qu&#39;il est à haut débit et haute résolution tout en restant relativement abordable. Un avantage supplémentaire de cette approche est qu&#39;il peut facilement être personnalisé pour répondre aux besoins d&#39;imagerie d&#39;un groupe de recherche particulier.

Collecte de données phénotypiques haute résolution est utile dans les études visant à comprendre l&#39;interaction entre la génétique et l&#39;environnement dans la médiation de la fonction organismal 1,2. Les études de cette nature sont aussi intrinsèquement grande échelle, ce qui rend plus nécessaire que les méthodes employées pour mesurer les phénotypes dans ce contexte être riches en débit de 3,4. Dans l&#39;établissement de méthodes de recherche phénomique échelle, compromis entre le débit et la résolution entrent en jeu. Les méthodes qui sont plus élevés en débit ont également tendance à être plus faible dans la résolution, ce qui rend plus difficile la détection de petits effets de la génétique ou de l&#39;environnement 5. Alternativement, les méthodes qui mesurent plus attentivement un phénotype souhaité ont également tendance à être plus faible dans le débit, ce qui rend difficile de sonder les effets génétiques et environnementaux au sens large. En outre, les méthodes manuelles pour les phénotypes de quantifier, y compris l&#39;inspection visuelle, peuvent être sujettes à des variations en raison des différences par l&#39;hommeception 6. Les technologies d&#39;imagerie peuvent fournir une passerelle utile entre le débit et la résolution pour obtenir des observations phénotypiques 7-9. En général, une image est relativement facile à saisir, ce qui facilite le débit, et lorsqu&#39;ils sont pris avec une résolution suffisante, les phénotypes peuvent être détectés subtiles 1,2,7. Les technologies d&#39;imagerie ont tendance à être modifiables pour s&#39;adapter à un système ou d&#39;un processus d&#39;intérêt et sont généralement évolutive 10-12. Pour cette raison, les technologies d&#39;imagerie sont idéales pour le développement des études à grande échelle de la fonction organismal. La réponse de la racine primaire à un stimulus de la gravité est un processus physiologique complexe qui se produit dans un organe morphologiquement simple. La réponse implique l&#39;activation des voies qui se propagent à travers l&#39;organe de racine et sa progression est déterminée par des facteurs génétiques et environnementaux, y compris les facteurs génétiques influencées par l&#39;environnement 12-14 signalisation </sup&gt;. La réponse de la racine primaire à un stimulus de gravité a été étudié au moins depuis Darwin, mais il ya beaucoup à apprendre sur la façon dont il fonctionne, en particulier dans les événements de signalisation précoces et dans les facteurs de médiation réponse plasticité 12,14,15. Acquérir une compréhension détaillée de la dynamique de cette réponse est important de trouver des façons d&#39;améliorer la capacité des plants à devenir établi avec succès dans un environnement donné 16. En outre, la forme de la racine, il est prête pour les applications de traitement d&#39;image 8,12,17. Dans l&#39;ensemble, la racine réponse gravitropique est un système idéal pour le développement de la technologie d&#39;imagerie à haut débit dans le but de mener des études de génomique niveau de la fonction organismal. Dans ce rapport, un haut débit, la méthode à haute résolution pour la capture d&#39;image de la réponse de gravitropique racine en utilisant peu coûteux, les scanners à plat disponibles dans le commerce est présenté. La vue d&#39;ensemble de laprotocole est représentée sur la figure 1. Les semis plantés sur des plaques de gélose ont été positionnés sur les scanners à plat orientées verticalement équipés de supports personnalisés en plexiglas de la plaque. Les images ont été recueillies toutes les quelques minutes à 4800 dpi et sauvegardés sur un disque local ou un serveur de données. Métadonnées associées à chaque série d&#39;image sont stockées sur une base de données et les images stockées sont traitées. L&#39;approche utilise le logiciel VueScan pour la capture d&#39;image. VueScan peut être utilisé pour exécuter plus de 2100 scanners différents sur Windows, Mac ou Linux (voir le tableau des matériaux). Une résolution du scanner de 4800 dpi a été utilisé dans cette application pour correspondre à la résolution obtenue dans des études antérieures utilisant des caméras CCD fixes 1,8,12. La flexibilité du logiciel VueScan avec l&#39;interface commune qu&#39;il utilise pour n&#39;importe quel scanner il fonctionne permet aux utilisateurs d&#39;adopter facilement pratiquement n&#39;importe quel matériel de numérisation de la résolution suffisante pour le protocole présenté dans cet article. Le débit de courant permet la collecte d&#39;216 réponses individuelles par jour. La technologie est adaptable et évolutif pour une utilisation dans des établissements allant des écoles secondaires aux universités de recherche. En outre, les images recueillies sont d&#39;une qualité suffisante pour les applications d&#39;analyse d&#39;image.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

Les efforts de recherche en biologie exigent de plus en plus recours à des méthodes qui permettent la collecte de gros volumes de données à haute résolution. Un défi laboratoires peuvent faire face est le développement et la réalisation de ces méthodes. Observation des phénotypes dans un processus d&#39;intérêt est un objectif typique des laboratoires de recherche qui étudient la fonction des gènes et ce qui est souvent atteint par la capture d&#39;image. Un procédé particulier qui se prête à l&#39;observation à l&#39;aide des approches d&#39;imagerie est la croissance d&#39;une racine de correction des semis qui ont été déplacés à partir de l&#39;alignement avec le vecteur de gravité. plates-formes d&#39;imagerie utilisées pour mesurer la réponse de gravitropique racine peuvent être coûteux, relativement faible en débit et / ou de main-d&#39;œuvre. Ces questions ont été abordées par le développement d&#39;une méthode de capture d&#39;image à haut débit en utilisant peu coûteux, mais de haute résolution, les scanners à plat. En utilisant cette méthode, les images peuvent être capturées toutes les quelques minutes à 4800 dpi. La configuration actuelle permet la collecte de 216 r individuelleesponses par jour. Les données d&#39;image recueillies sont de grand qualité pour les applications d&#39;analyse d&#39;image.

Images représentatives Cette approche permet la production rapide de haute résolution série de temps d&#39;Arabidopsis croissance des semis. Images première et la dernière d&#39;un cycle de scanner sont présentés dans les figures 7A et 7B. Figures 7C et 7D montrent des résultats optimaux à partir de la moitié d&#39;une image complète du scanner. Certaines questions qui peuvent affecter la qualité d&#39;image sont présentés dans les figures 7A et 7B. Ces questions comprennent la variation de la germination, la variation de la trajectoire de croissance des semis au début de la course, et l&#39;accumulation de condensation lors de la numérisation. La condensation peut en grande partie être résolu en augmentant la quantité de Triton X-100 appliqué sur la face intérieure du couvercle de plaque. D&#39;autres facteurs qui pourraient faire obstacle à la collecte de l&#39;image précis sont une mauvaise configuration de la boîte de culture par rapport à la position de la plaque et de positionnement des plaques telles qu&#39;elles sont biaisées par rapport à la zone de recadrage. Analyse de l&#39;image Application: compression d&#39;image Une fois une séquence temporelle d&#39;images de scanner a été obtenue, il doit être stocké en toute sécurité d&#39;une manière accessible de réseau pour faciliter l&#39;analyse de l&#39;image. Les fichiers d&#39;image associés à une course de scanner individuel occupent une quantité importante de l&#39;espace disque dur. Un seul fichier TIFF recueillies à 4800 dpi est d&#39;environ 220 Mo et une piste de scanner typique génère 200 fichiers image. Par conséquent, environ 44 Go d&#39;espace disque dur est requise pour l&#39;exécution. Pour réduire les coûts de stockage et de transmission de réseau associés à l&#39;analyse de l&#39;image, il est souhaitable de réduire la quantité d&#39;espace nécessaire pour les données d&#39;image du magasin tout en minimisant en même temps la perte de données. Analyse en aval impliquera l&#39;identification de chaque plant dans des fichiers images suivants associés à un essai expérimental. Par conséquent, la segmentation les semis simples à partir de l&#39;image du scanner peut faciliter l&#39;analyse en aval. Parce que la segmentation de la plantule à partir du reste de the image peut également réduire considérablement le stockage des pixels de fond inutiles, cette approche conduit également à une réduction significative de la taille des données. En outre, si l&#39;analyse en aval est centré sur les tissus des racines, il peut ne pas être nécessaire de conserver des informations de couleurs depuis les racines pixels sont relativement étroites dans leur espace de couleur. Un protocole de traitement d&#39;image de l&#39;ordinateur et du code pour réduire la taille des données à la fois par la segmentation sur des plants individuels et convertir des images en niveaux de gris a été développé. L&#39;approche se traduit par une réduction de 60% des besoins en espace de stockage. Le flux de travail utilisé pour réaliser cette compression de données est décrit dans les étapes suivantes: <ol><li> Commencez par une série de temps de fichiers d&#39;image du scanner dans un seul dossier. </li><li> Pour chaque image, convertir un RVB en niveaux de gris (Figure 8, en haut). </li><li> Diviser l&#39;image en deux moitiés gauche et droite. </li><li> Extrait chaque plant de l&#39;image dans son propre fichier (figure 8).Ceci est réalisé en appliquant un seuil à convertir les pixels en noir ou en blanc et ensuite calculer l&#39;intensité totale des pixels de chaque ligne de l&#39;image. La ligne avec la plus grande intensité est identifié et chaque pixel est classé comme «plante» ou «nonplant» basé sur l&#39;intensité de ses voisins. Le centre de chaque «plante» au sein de cette ligne se trouve et de ce point une boîte de culture d&#39;une taille prédéterminée est établi (Figure 8, en bas). </li><li> Créez un dossier séparé pour chaque côté de l&#39;image (gauche et droite) avec les sous-dossiers séparés pour chaque plant pour le stockage de temps individuel des fichiers d&#39;image de la série. </li><li> Archiver les dossiers résultant dans un fichier compressé ZIP. </li></ol> Un code qui accomplit ces étapes a été développé en utilisant le langage Python de programmation 20. L&#39;algorithme permet une réduction d&#39;environ 60% de la taille des données et est retenue dans l&#39;ensemble dans l&#39;identification des plants individuels dans 90% de l&#39;imag du scannere fichiers analysés jusqu&#39;ici. Les codes sont disponibles gratuitement pour téléchargement sous la licence GNU General Public License version 3 (voir le tableau des matériaux). <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. La procédure de numérisation commence avec la plantation de graines (jusqu&#39;à neuf graines d&#39;Arabidopsis par plaque) et se termine avec le stockage de données et de traitement de l&#39;image. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. T emplate pour la construction de Petri support de plat. Ple<html> xiglas a été coupé de telle sorte que la largeur correspond le plat (dans ce cas 227 mm) et la longueur est de 128 mm. Deux cercles d&#39;un diamètre de 88 mm ont été découpés de la partie restante de telle sorte qu&#39;ils sont uniformément répartis le long de la largeur et de la longueur du support. Le support est fixé sur le plat avec des bandes de commande 3M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Configuration du scanner Figure 3. Après semis ont été gravistimulated et le couvercle de document placé. C&#39;est la configuration du scanner à l&#39;étape 1.21 de l&#39;installation du scanner et collection d&#39;images.&quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Figure 4. Capture d&#39;écran de paramètres sélectionnés pour l&#39;étape 1.8 de l&#39;installation du scanner et collection d&#39;images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Figure 5. Capture d&#39;écran du logiciel VueScan pendant les étapes 1.9 et 1.10 de l&#39;installation du scanner et Collection de l&#39;image. L&#39;encadré rouge met en évidence l&#39;importance de la récolte alors que la boîte bleue met en évidence les paramètres spécifiques fo<html> r x-et y-offset utilisée afin de capturer les semis et les informations d&#39;étiquette. La région de la vitre d&#39;exposition pour numériser est représenté par une ligne en pointillés dans la zone Aperçu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Figure 6. Sélection de dossier de destination pour l&#39;étape 1.12 de l&#39;installation du scanner et Collection de l&#39;image. Appuyez sur la touche @ à côté de la boîte de dialogue de dossier par défaut (flèche rouge) permet à l&#39;utilisateur de sélectionner le dossier de destination approprié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . re 7 &quot;fo: contenu width =&quot; 5 po &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Figure 7 (AD). Les images ci-dessus sont des exemples de ceux recueillis à l&#39;aide de la méthode décrite dans le présent document. Panneaux A, B et C, D sont les premières et dernières images, respectivement, à partir d&#39;une seule période de balayage. A, B montrent la pleine zone balayée, tandis que C, D sont une région cultivée de la zone balayée, montrant une seule plaque. Plusieurs incohérences peuvent être observées. Le panneau A montre la variation de la germination et de la trajectoire de croissance. Groupe B (les mêmes plants que l&#39;image A, 9 h plus tard) montre que les plaques peuvent s&#39;accumuler condensation. Les panneaux C et D sont considérés comme de bons résultats en raison de la forte croissance of semis et la qualité d&#39;image tout au long de la course. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. L&#39;algorithme de compression d&#39;image développé convertit une image du scanner de gris (en haut). L&#39;image est divisée en deux moitiés droite et gauche et image frontières sont supprimés (non représenté). Les positions des plants individuels sur chaque moitié sont identifiés par trouver la ligne avec la plus grande intensité de pixels au total. Ces positions sont utilisées pour définir une nouvelle zone de culture, appliquée à tous les semis sur la plaque (en bas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Ce protocole décrit un procédé pour la collecte rapide d&#39;images de jeunes plants d&#39;Arabidopsis répondant à un stimulus de gravité en utilisant des scanners à plat disponibles dans le commerce. La méthode permet de peu coûteuse, la capture de gros volumes d&#39;images haute résolution qui se prêtent à des algorithmes d&#39;analyse en aval.

Utilisation de scanners à plat pour collecter haute résolution temps-caduque Images de la réponse gravitropique Arabidopsis racine

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K vues.  Doane College.  Ce protocole décrit un procédé pour la collecte rapide d'images de jeunes plants d'Arabidopsis répondant à un stimulus de gravité en utilisant des scanners à plat disponibles dans le commerce. La méthode permet de peu coûteuse, la capture de gros volumes d'images haute résolution qui se prêtent à des algorithmes d'analyse en aval. 

Vidéo: Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

En utilisant la réponse optocinétique pour étudier la fonction visuelle du poisson zèbre

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Recherche

Biologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral système inductible Racine dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Et de maïs

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.